tiểu luận (công nghệ tế bào động vật)

II.NUÔI CẤY SƠ CẤP TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Khái niệm Nuôi cấy sơ cấp là quá trình nuôi cấy đầu tiên của tế bào saukhi tách từ mô hay cơ quan trước lần cấy truyền đầu tiên. Đặc điểm nuôi cấy sơ cấp Thành phần tế bào trong giai đoạn này rất hỗn độn. Kết thúc nuôi cấy sơ cấp khi tế bào được cấy truyền sang một dụng cụ khác. Các tế bào không mong muốn trong nuôi cây sơ cấp gọi là tế bào nhiễm. Các tế bào nhiễm được loại bỏ bằng cơ học hoặc enzyme hoặc môi trường chọn lọc Thu nhận sử lý mẫu: B1 xác định vị trí mô B2 khử trùng,đưa vào bảo quản trong dung dịch đệm B3 đưa đến phòng thí nghiệm chuyển sang dd đệm mới + kháng sinh. Tách rời các tế bào: Tách bằng cơ học: dùng dao, kéo cắt rời các mảnh mô mục đích làm tế bào tách ra thành tế bào đơn lẻ Hiệu quả của tách cơ học Thu được ít tế bào đơn Không áp dụng được với mẫu hiếm Sức sống tế bào cao Tăng hiệu quả tiếp xúc enzyme. Áp dụng cho mẫu lớn không khan hiếm. Tách bằng enzyme: Sử dụng enzyme: phá vỡ các liên kết giữa các tế bào trong khối mô. Hiệu quả khi tách băng enzyme. Thu được nhiều tế bào đơn Áp dụng được với hầu hết các mô Hiệu quả không mong muốn Sức sống tế bào giảm Nếu không bất hoạt enzyme sẽ ảnh hưởng tới thí nghiệm sau. Các enzyme thường dùng Pronase Dispace Trypsin collagenase hyaluronidase Nuôi cấy thu tế bào: Quá trình cơ bản của nuôi cấy Loại bỏ dịch nổi trong dịch tách tế bào bằng ly tâm 10000v Dùng khoảng 1ml môi trường cho vào ống eppendorf để tạo huyền phù Huyền phù được đưa vào bình nuôi cấy ,lắc đều. Binh nuôi cấy được ủ trong điều kiện thich hợp,thường là nhiệt độ 3737,5. Môi trừơng nuôi sẽ được thay đổi liên tục khoảng 2448h .do tế bào sinh trưởng tạo CO2 Tế bào phát triển thành lớp đơn trong bình.

Chuyên đề: Nuôi cấy tế bào động vật

Nhóm 3:

1.Nguyễn Đình Duy Khanh

2.Hà Văn Hướng 3.Nguyễn Thị Bích Hường

4.Nguyễn Khắc Khánh

5 Hà Đức Huy 6.Ngô Đình Hưng 7.Nguyễn Thu Hường

BÀI TIỂU LUẬN

QÚA TRÌNH NUÔI CẤY TẾ BÀO DA

• Các yếu tố ảnh hưởng quá trình nuôi cấy

• Nuôi cấy sơ cấp

• Nuôi cấy thứ cấp

Nuôi cấy tế

bào động vật

Chương 2:Nuôi cấy tế bào động vật

I.Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi

cấy

I.Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi

cấy

1.Điều kiện hóa, lý

1.Điều kiện hóa, lý

Chương 2:Nuôi cấy tế bào động vật

2.Mức độ vô trùng:

Vi sinh vật là yếu tố gây nhiễm và phá hoại hàng đầu Vì vậy quá trình nuôi cấy tế bào động vật cần độ vô trùng rất cao Các thiết bị,dụng cụ nuôi,môi trường cần phải được khử trùng theo đúng quy định.

VD:hóa chất(cồn70 0 ,fomaldehyde), chất kháng sinh, hơi nóng, tia UV, màng lọc

2.Mức độ vô trùng:

Vi sinh vật là yếu tố gây nhiễm và phá hoại hàng đầu Vì vậy quá trình nuôi cấy tế bào động vật cần độ vô trùng rất cao Các thiết bị,dụng cụ nuôi,môi trường cần phải được khử trùng theo đúng quy định.

VD:hóa chất(cồn70 0 ,fomaldehyde), chất kháng sinh, hơi nóng, tia UV, màng lọc

4.Thiết bị nuôi cấy

Để nuôi cấy tbdv phòng thí nghiệm cần phải được trang bị:

 Các thiết bị thiết yếu:

• Thiết bị bảo quản mẫu- hóa chất: tủ lạnh, tủ lạnh sâu,bình

nitrogen lỏng, máy làm đá

• Thiết bị nuôi cấy: tủ cấy, tủ ấm

• Thiết bị đếm số lượng tế bào: máy đếm hồng cầu, đếm khuẩn lạc => kiểm tra mật độ tế bào ở thời điểm nhất định

• Thiết bị khử trùng và tinh sạch: nồi khử trùng, tủ sấy, máy rửa dụng cụ, đèn tiệt trùng, hệ thống lọc…

• Thiết bị quan sát: thường là các kính hiển vi có gắn camera, kết nối với màn hình lớn,gắn với máy ảnh

 Thiết bị hỗ trợ khác

Ví dụ: máy pha hóa chất, máy votex,máy li tâm,

máy khuấy từ, máy đo pH…

Hình ảnh

Máy đếm khuẩn lạc

Thiết bị hỗ trợ hút dịch Hệ thống phân tích và ghi

hình ảnh

 So sánh thiết bị làm bằng nhựa và thủy tinh

• Tốn thời gian và công sức

• tốn nhiều môi trường

• Bề mặt không được xủ lí chất bám dính và chất nền

II.NUÔI CẤY SƠ CẤP TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

1 Khái niệm

 Nuôi cấy sơ cấp là quá trình nuôi cấy đầu tiên của tế bào

saukhi tách từ mô hay cơ quan trước lần cấy truyền đầu

tiên.

2 Đặc điểm nuôi cấy sơ cấp

 Thành phần tế bào trong giai đoạn này rất hỗn độn

 Kết thúc nuôi cấy sơ cấp khi tế bào được cấy truyền sang

một dụng cụ khác

 Các tế bào không mong muốn trong nuôi cây sơ cấp gọi là tế

bào nhiễm

 Các tế bào nhiễm được loại bỏ bằng cơ học hoặc enzyme

hoặc môi trường chọn lọc

3.Quy trình chung của nuôi cấy sơ cấp

1.Thu nhận mẫu

1.Thu nhận mẫu

3.Nuôi cấy tế bào

•Hiệu quả của tách cơ học

Thu được ít tế bào đơn

Không áp dụng được với

 Tách bằng enzyme:

• Sử dụng enzyme: phá vỡ các liên kết giữa các tế bào

trong khối mô.

• Hiệu quả khi tách băng enzyme.

Thu được nhiều tế bào đơn

Áp dụng được với hầu hết các mô

• Hiệu quả không mong muốn

Nuôi cấy thu tế bào:

Quá trình cơ bản của nuôi cấy

• Loại bỏ dịch nổi trong dịch tách tế bào bằng ly tâm 10000v

• Dùng khoảng 1ml môi trường cho vào ống eppendorf để tạo huyền phù

• Huyền phù được đưa vào bình nuôi cấy ,lắc đều

• Binh nuôi cấy được ủ trong điều kiện thich hợp,thường là nhiệt độ 37-37,5

• Môi trừơng nuôi sẽ được thay đổi liên tục khoảng 24-48h do tế bào sinh trưởng tạo CO2

• Tế bào phát triển thành lớp đơn trong bình.

III.Nuôi cấy thứ cấp

1 Khái niệm:

- Nuôi cấy thứ cấp là quá trình nuôi cấy các tế bào đã được chọn lọc trong nuôi cấy sơ cấp.

- Nuôi cấy thứ cấp trong những điều kiện nhất định sẽ quyết

định tới sự phát triển, khả năng phân chia và biệt hóa của các tế bào nhằm thu được những dòng tế bào theo mục đích của người tiến hành.

2 Tiến hành:

Trong nuôi cấy thứ cấp cần tiến hành thao tác:

a) Cấy truyền

- Khái niệm: Cấy truyền là quá trình chọn lọc và tách các tế bào

trong nuôi cấy sơ cấp chuyển sang nuôi cấy ở môi trường mới thích hợp

- Cấy truyền gồm các giai đoạn:

Rửa và tách các tế bào

Chuyển sang môi trường nuôi cấy

- Đặc tính: Trypsin sẽ làm cuộn tròn tế bào do vậy các liên kết trở nên lỏng lẻo, dễ tách rời.

- Trypsin do có thể phá vỡ màng tế bào nên sẽ được bất hoạt bằng huyết thanh

+ Dòng tế bào giới hạn :(finite cell lines): có khả năng phân chia kém

hơn,có thể thu được các tế bào đã gần như lão hóa không thể sử dụng cho các ứng dụng của việc nuôi cấy tế bào động vật

- Khi các quần thể tế bào có sự khác biệt rõ ràng thì có thể phân tách chúng bằng những thao tác trực tiếp bằng tay, dưới kính hiển vi.

- Có những trường hợp 1 quần thể tế bào tưởng như cùng 1 loại,

sự thật lại chứa nhiều loại tế bào thì ta phải sử dụng những cách khác nhau

+ Nhân dòng các tế bào trên agar hoặc dung dịch có độ nhớt

cao như methocell ( sử dụng vs tế bào bám dính)

VD: với tế bào Hela – S3,CHO

+ Nuôi cấy tế bào ở dạng dung dịch (sử dụng với tế bào không bám dính)

VD: tế bào máu

Phương pháp pha loãng.

Pha loãng là giai đoạn cuối của quá trình nuôi cấy thứ cấp.

Phương pháp pha loãng:

 Đối với tế bào CHO:

Tế bào CHO Tế bào đơn

- Nuôi cấy trong bình flask 25 cm2, giai đoạn cuối pha log

- Sử lý trypsin để thu nhận tế bào đơn

Chú ý:

- Nếu sử lý chưa đủ thời gian sẽ thu được cụm tế bào

- Nếu sử lý quá lâu sẽ làm các tế bào giảm sức sống

 Trypsin

Là một protease enzyme, tìm thấy trong hệ tiêu hóa của động vật

có xương sống, có vai trò thủy phân protein trong thức ăn

- Cách pha loãng:

Tế bào đã co tròn bổ xung chất ức chế trypsin hoặc môi

trường(gấp 5 lần thể tích enzyme) Pha loãng tế bào đạt

nồng độ khoảng 100.000 tế bào/1ml lấy 200 microlit của dung dịch 100.000 tế bào/ ml thêm môi trường đạt 20ml ( pha loãng 100 lần) thu được dung dịch nòng độ 1000 tế bào/ ml

Lấy 200microlit dung dịch này pha loãng 100 lần thu đượcnồng độ 10 tế bào/1ml lấy 5ml dung dịch pha loãng nuôi cấy trong đĩa peptri ( 3 đĩa mỗi đĩa 5ml) điều kiện 5%CO2

• Môi trường cho pha loãng

- Tế bào CHO môi trường Ham’s F12.

- Tế bào TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ môi trường DMEM/F12.

- Huyết thanh : thường dùng huyết thanh thai bò.

- Một số hormone làm tăng khả năng bám dính của tế bào: isulin, Dexamethasone

- Các chất trao đổi như piruvate, a- ketoglutarate

- CO2: 2%+HEPES

- Cơ chất : fibronectin, liên kết integrin.

- Trypsin: dùng ở 4độ C, tinh sạch tốt cho bám dính hơn