A.LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀITrong những năm gần đây, nghành công nghệ sinh học đang có bước phát triển rất mạnh mẽ. Phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học là một xu thế tất yếu trong điều kiện các sản xuất truyền thống đang gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Các chế phẩm sản xuất bằng con đường sinh học không chỉ thân thiện với môi trường sống, mang lại giá trị kinh tế cao mà còn ứng dụng rất hiệu quả trong lĩnh vực đời sống. và enzyme là một phần khong thể thiếu được của nghành công nghệ sinh học. Hiện nay có rất nhiều loại enzyme được nghiên cứu và ứng dụng của chúng ngày càng được mở rộng. Một trong số đó có enzyme chitinase với dẫn xuất quan trọng là chitosan đang được ứng dụng vào vô số các lĩnh vực khác nhau. 1Việt Nam có nguồn lợi thủy sản rất dồi dào, nghành công nghệ nuôi trồng và chế biến ngày càng phát triển mạnh. Nuôi tôm là một trong những nghề đã đem lại hiệu quả kinh tế cao vì tôm là mặt hàng hải sản có giá trị không những cho nguồn đạm động vật cao mà còn là loại thực phẩm được nhiều người ưu thích và ngày càng có giá trị trên thị trường thế giới. Tuy nhiên dịch bệnh là nỗi ám ảnh và gây thiệt hại lớn về kinh tế cho nghề nuôi tôm nói riêng và nghành thủy sản nói chung. Nguyên nhân gây bệnh là do lượng thức ăn hữu cơ dư thừa trong nước sẽ làm ô nhiễm, gây độc cho tôm, đồng thời vỏ tôm sau khi sau khi lột xác bị lắng động xuống đáy ao tạo điều kiện phát triển cho các sinh vật có hại cho sự phát triển của tôm. Trên thị trường đã xuất hiện nhiều chế phẩm vi sinh được nhập về nhưng quá đắt cho người nông dân sử dụng và không kiểm soát được các vi sinh vật có trong chế phẩm có ảnh hưởng gì đến sức khỏe con người và môi trường không. Trong khi đó việc sử dụng các chế phẩm sinh học có nguồn gốc tự nhiên lại cho hiệu quả hơn trong việc phòng và trị bệnh nhờ quá trình cạnh tranh sinh học. Khi ta thêm các vi sinh vật có lợi như các vi sinh vật có hoạt tính sinh học cao vào môi trường, chúng sẽ phân giải nhanh các chất hữu cơ, lấn át và ức chế mầm bệnh phát triển, vì thế sẽ ngăn ngừa được các mầm bệnh xảy ra. 1.Mặt khác một trong những dạng phế liệu chiếm phần lớn từ nghành thủy sản là nguồn chitin từ vỏ ngoài giáp xác như tôm, cua. Tận dụng nguồn phế liệu này không những giải quyết triệt để vấn đề ô nhiễm môi trường mà còn tạo ra các chế phẩm mới có giá trị vì vậy nên tôi chọn đề tài: “Vi sinh vật thủy phân chitin và khả năng ứng dụng của chúng trong bảo vệ môi trường’’ từ bài báo tiếng Anh “Chitinolytic Microorganisms and Their Possible Application in Environmental Protection” đăng trên tạp chí Current Microbiololy năm 2014, tập 68. B.NỘI DUNG BÀI BÁOTóm tắtBài báo này cung cấp một đánh giá về các kết quả nghiên cứu mới nhất về ứng dụng của vi khuẩn chitinases để kiểm soát sinh học. Vi sinh vật sản xuất ra các enzim này có thể ức chế sự phát triển của nhiều bệnh nấm gây ra mối đe dọa nghiêm trọng tới sản xuất mùa vụ toàn cầu. Gần đây, những nỗ lực đang được thực hiện để khám phá các vi sinh vật sản xuất enzyme thủy phân chitin. Tiềm năng tồn tại mà các loại thuốc diệt nấm sinh học tự nhiên sẽ thay thế thuốc diệt nấm hóa học hoặc sẽ được sử dụng để bổ sung thuốc diệt nấm hiện đang được sử dụng, điều này sẽ làm giảm tác động tiêu cực của các chất hóa học trong môi trường và hỗ trợ phát triển bền vững của nông nghiệp và lâm nghiệp.Giới thiệuBệnh thực vật là một vấn đề chính đối với việc canh tác cây trồng và gây thất thoát 10% tổng sản lượng mùa vụ toàn cầu 98. Nấm mốc, một trong những tác nhân gây bệnh thực vật nặng nhất, thường bị phá hủy bằng thuốc trừ nấm hóa học. Chúng được sử dụng phổ biến rộng rãi, điều này đã tăng gấp ba lần trong 40 năm qua, đã tăng tốc gây ô nhiễm và hủy hoại môi trường. Hơn thế nữa, thuốc diệt nấm hóa học có thể gây tử vong cho các côn trùng có lợi và các quần thể vi sinh vật ở đất và có thể đi vào chuổi thức ăn 9. Ngoài hiệu quả cao và dễ sử dụng, thuốc trừ nấm hóa học có nhiều bất lợi. Kiểm soát sinh học, sử dụng vi sinh vật để kiểm soát các bệnh thực vật, mang đến những thay đổi, đây là chiến lược thanh thiện với môi trường để kiểm soát các tác nhân gây bệnh thực vật. Gần đây, kiểm soát sinh học sử dụng các vi sinh vật sản xuất enzim phân hủy nấm, đặc biệt là chitinases (CHIs), được biết đến để thủy phân chitin, một thành phần chính của thành tế bào nấm, CHIs hoặc các vi sinh vật thủy phân chi tin hiện đang được nghiên cứu như một sự thay thế hấp dẫn đối với các hóa chất tổng hợp vì sự an toàn của chúng và tác động môi trường thấp hơn. Chiến lược kiểm soát sinh học đã trở thành một cách tiếp cận quan trọng để tạo thuận lợi cho nông nghiệp bền vững 40, 54, 80, 92.Sự xuất hiện của Chitin trong tự nhiênChitin, a β (1,4) liên kết polymer của NacetylDglucosamine, là một trong những polysacchrides phổ biến nhất trong tự nhiên. Chitin xuất hiện ở dạng kết hợp với polyme, chẳng hạn như protein. Trong tự nhiên, nó được tìm thấy trong hai dạng tinh thể. Dạng α có chitin song song vi sợi với liên kết hydro liên phân tử mạnh và là chitin phong phú nhất trong tự nhiên, được tìm thấy trong tôm và cua. βchitin có chuỗi chitin song song và xuất hiện trong mai mực 125. Chitin được phân bố rộng rãi trong tự nhiên, đặc biệt là cấu trúc polysacchride trong thành tế bào, bộ khung ngoài của động vật chân đốt, vỏ bên ngoài của động vật giáp xác và giun tròn. Khoảng 75% tổng trọng lượng của động vật có vỏ, như tôm, cua và nhuyễn thể, được coi là chất thải. Chitin chiếm 20–58% trọng lượng khô của chất thải này 116. Chitin có một loạt các ứng dụng trong sinh hóa, thực phẩm và các ngành công nghiệp hóa chất và có khả năng kháng khuẩn, kháng cholesterol và hoạt tính chống ung thư 32, 77. Chitin và các vật liệu liên quan của nó cũng được sử dụng trong xử lý nước thải 26, vận chuyển thuốc, và chữa lành vết thương và là nguồn chất xơ 19, 74. Chất thải từ việc chế biến động vật giáp xác biển là một nguồn thương mại chitin đáng kể. Số lượng đáng kể được sản xuất ở châu Á, chủ yếu là Thái Lan, là nước xuất khẩu chính tôm và Ấn Độ. Sử dụng chất thải chitin rất hiếm, nhưng nếu được tiến hành đúng cách, sẽ giải quyết được vấn đề về môi trường xử lý chất thải và cho phép nền kinh tế lớn giá trị của chitin được sử dụng 117. Điều đáng chú ý là việc sản xuất chitin trong sinh quyển biển là rất lớn. Lượng chitin hàng năm ước tính được sản xuất bởi động vật phù du biển là hơn vài tỷ tấn 8, và tổng sản lượng chitin hàng năm ước tính là 1010 tới 1011 tấn 31, 42. Phần lớn sản lượng chitin này ở dạng vỏ gắn với động vật phù du biển và động vật giáp xác ở biển như tôm, cua và tôm hùm. Khi lột xác, bộ khung ngoài lột vỏ có thể chứa nhiều hơn năm lần chitin so với cơ thể của động vật. Động vật chân đốt hoạt động có ý nghĩa lớn nhất bởi vì chúng tạo ra lượng chitin rất lớn. Tương tự, lớp bề mặt của các cơ quan của côn trùng trên cạn và loài nhện có chứa một lượng đáng kể chitin 119. Đáng ngạc nhiên là hàm lượng chitin trong trầm tích biển khá thấp. Điều này là do quá trình chuyển đổi sinh học được thực hiện bởi vi khuẩn thủy phân chitin ở biển 37, chuyển đổi polysaccharide thành các hợp chất hữu cơ sau đó được các vi sinh vật khác sử dụng như một nguồn cacbon và nitơ.Vi sinh vật thủy phân chitinThường được tìm thấy trong sinh quyển, vi sinh vật thủy phân chitin có khả năng phân hủy chitin dưới cả hai điều kiện hiếu khí và yếm khí. Chúng được tìm thấy trong nhiều môi trường khác nhau. Trái ngược với kỳ vọng rằng chúng có rất nhiều trong môi trường có lượng chitin cao (như vỏ tôm), chỉ một số nhỏ đã được xác định trong chất thải của tôm: vi khuẩn thủy phân chitin chỉ chiếm 4% tổng số vi khuẩn dị dưỡng. Nấm thủy phân chitin chiếm 2560% tổng số nấm mốc, nhưng số lượng của chúng thấp hơn số lượng vi khuẩn 106. Trong khi nghiên cứu mối tương quan giữa chất thải tôm và số lượng vi khuẩn trong đường tiêu hóa của cừu, Cobos et al. 13 xác định chỉ một tỷ lệ nhỏ vi khuẩn thủy phân chitin trong môi trường này. Họ đã xác định không có vi khuẩn thủy phân chitin sau 30 ngày cho cừu ăn một chế độ ăn không chứa hoặc 15% chất thải từ tôm. Chỉ sau 72 ngày cho ăn cừu trên một chế độ ăn uống có chứa 25% bột chất thải từ tôm đã ghi nhận 0,1% vi khuẩn thủy phân chitin trong hệ thống tiêu hóa của cừu.Chất nền Chitin không phải lúc nào cũng kích thích sự tăng trưởng của vi sinh vật thủy phân chitin. Các kết quả thu được từ Zdanowski và Vosjan 123 chỉ ra rằng vi sinh vật thủy phân chitin chỉ là một tỷ lệ nhỏ trong tổng số vi sinh vật trên vỏ nhuyễn thể. Trong hồ và đất trong các lưu vực thoát nước của hồ được xác định có số lượng cao hơn một cách đáng kể. Đất và vùng rễ được sinh trưởng rất nhiều nhờ vi sinh vật thủy phân chitin, và xạ khuẩn là phổ biến nhất. Swiontek Brzezinska et al. 108 cho rằng 4569% của xạ khuẩn và 3240% nấm mốc có thể phân hủy chitin trong đất trong bồn thoát nước của hồ Chełmzynskie. Bởi vì vi sinh vật phân hủy vi khuẩn phân lập từ đất thường hoạt động tích cực hơn vi khuẩn thủy phân chitin phân lập từ nước và trầm tích đáy, chúng có thể thích hợp hơn cho sử dụng trong nông nghiệp. Paul và Clark báo cáo rằng 90% tất cả các chủng xạ khuẩn phân lập từ đất thuộc chi Streptomyces.
Trang 1ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
BẢO VỆ MÔI TRƯỜNG
Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:
TS Nguyễn Xuân Huy Nguyễn Thị Linh
Lớp: Sinh 4B
MSV: 15S3011043
Trang 2A LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Trong những năm gần đây, nghành công nghệ sinh học đang có bước phát triển rấtmạnh mẽ Phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học là một xu thế tất yếu trong điều kiệncác sản xuất truyền thống đang gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng Các chế phẩm sảnxuất bằng con đường sinh học không chỉ thân thiện với môi trường sống, mang lại giá trịkinh tế cao mà còn ứng dụng rất hiệu quả trong lĩnh vực đời sống và enzyme là một phầnkhong thể thiếu được của nghành công nghệ sinh học Hiện nay có rất nhiều loại enzymeđược nghiên cứu và ứng dụng của chúng ngày càng được mở rộng Một trong số đó cóenzyme chitinase với dẫn xuất quan trọng là chitosan đang được ứng dụng vào vô số các lĩnhvực khác nhau [1]
Việt Nam có nguồn lợi thủy sản rất dồi dào, nghành công nghệ nuôi trồng và chế biếnngày càng phát triển mạnh Nuôi tôm là một trong những nghề đã đem lại hiệu quả kinh tếcao vì tôm là mặt hàng hải sản có giá trị không những cho nguồn đạm động vật cao mà còn
là loại thực phẩm được nhiều người ưu thích và ngày càng có giá trị trên thị trường thế giới.Tuy nhiên dịch bệnh là nỗi ám ảnh và gây thiệt hại lớn về kinh tế cho nghề nuôi tôm nóiriêng và nghành thủy sản nói chung Nguyên nhân gây bệnh là do lượng thức ăn hữu cơ dưthừa trong nước sẽ làm ô nhiễm, gây độc cho tôm, đồng thời vỏ tôm sau khi sau khi lột xác
bị lắng động xuống đáy ao tạo điều kiện phát triển cho các sinh vật có hại cho sự phát triểncủa tôm Trên thị trường đã xuất hiện nhiều chế phẩm vi sinh được nhập về nhưng quá đắtcho người nông dân sử dụng và không kiểm soát được các vi sinh vật có trong chế phẩm cóảnh hưởng gì đến sức khỏe con người và môi trường không Trong khi đó việc sử dụng cácchế phẩm sinh học có nguồn gốc tự nhiên lại cho hiệu quả hơn trong việc phòng và trị bệnhnhờ quá trình cạnh tranh sinh học Khi ta thêm các vi sinh vật có lợi như các vi sinh vật cóhoạt tính sinh học cao vào môi trường, chúng sẽ phân giải nhanh các chất hữu cơ, lấn át và
ức chế mầm bệnh phát triển, vì thế sẽ ngăn ngừa được các mầm bệnh xảy ra [1]
Mặt khác một trong những dạng phế liệu chiếm phần lớn từ nghành thủy sản là nguồnchitin từ vỏ ngoài giáp xác như tôm, cua Tận dụng nguồn phế liệu này không những giảiquyết triệt để vấn đề ô nhiễm môi trường mà còn tạo ra các chế phẩm mới có giá trị vì vậynên tôi chọn đề tài: “Vi sinh vật thủy phân chitin và khả năng ứng dụng của chúng trong bảo
vệ môi trường’’ từ bài báo tiếng Anh “Chitinolytic Microorganisms and Their PossibleApplication in Environmental Protection” đăng trên tạp chí Current Microbiololy năm 2014,tập 68
Trang 3B NỘI DUNG BÀI BÁO
và hỗ trợ phát triển bền vững của nông nghiệp và lâm nghiệp
Giới thiệu
Bệnh thực vật là một vấn đề chính đối với việc canh tác cây trồng và gây thất thoát10% tổng sản lượng mùa vụ toàn cầu [98] Nấm mốc, một trong những tác nhân gây bệnhthực vật nặng nhất, thường bị phá hủy bằng thuốc trừ nấm hóa học Chúng được sử dụng phổbiến rộng rãi, điều này đã tăng gấp ba lần trong 40 năm qua, đã tăng tốc gây ô nhiễm và hủyhoại môi trường Hơn thế nữa, thuốc diệt nấm hóa học có thể gây tử vong cho các côn trùng
có lợi và các quần thể vi sinh vật ở đất và có thể đi vào chuổi thức ăn [9] Ngoài hiệu quảcao và dễ sử dụng, thuốc trừ nấm hóa học có nhiều bất lợi Kiểm soát sinh học, sử dụng visinh vật để kiểm soát các bệnh thực vật, mang đến những thay đổi, đây là chiến lược thanhthiện với môi trường để kiểm soát các tác nhân gây bệnh thực vật Gần đây, kiểm soát sinhhọc sử dụng các vi sinh vật sản xuất enzim phân hủy nấm, đặc biệt là chitinases (CHIs),được biết đến để thủy phân chitin, một thành phần chính của thành tế bào nấm, CHIs hoặccác vi sinh vật thủy phân chi tin hiện đang được nghiên cứu như một sự thay thế hấp dẫn đốivới các hóa chất tổng hợp vì sự an toàn của chúng và tác động môi trường thấp hơn Chiếnlược kiểm soát sinh học đã trở thành một cách tiếp cận quan trọng để tạo thuận lợi cho nôngnghiệp bền vững [40, 54, 80, 92]
Sự xuất hiện của Chitin trong tự nhiên
Chitin, a β- (1,4) liên kết polymer của N-acetyl-D-glucosamine, là một trong nhữngpolysacchrides phổ biến nhất trong tự nhiên Chitin xuất hiện ở dạng kết hợp với polyme,chẳng hạn như protein Trong tự nhiên, nó được tìm thấy trong hai dạng tinh thể Dạng α cóchitin song song vi sợi với liên kết hydro liên phân tử mạnh và là chitin phong phú nhấttrong tự nhiên, được tìm thấy trong tôm và cua β-chitin có chuỗi chitin song song và xuấthiện trong mai mực [125] Chitin được phân bố rộng rãi trong tự nhiên, đặc biệt là cấu trúcpolysacchride trong thành tế bào, bộ khung ngoài của động vật chân đốt, vỏ bên ngoài củađộng vật giáp xác và giun tròn Khoảng 75% tổng trọng lượng của động vật có vỏ, như tôm,cua và nhuyễn thể, được coi là chất thải Chitin chiếm 20–58% trọng lượng khô của chất thảinày [116] Chitin có một loạt các ứng dụng trong sinh hóa, thực phẩm và các ngành côngnghiệp hóa chất và có khả năng kháng khuẩn, kháng cholesterol và hoạt tính chống ung thư[32, 77] Chitin và các vật liệu liên quan của nó cũng được sử dụng trong xử lý nước thải
Trang 4[26], vận chuyển thuốc, và chữa lành vết thương và là nguồn chất xơ [19, 74] Chất thải từviệc chế biến động vật giáp xác biển là một nguồn thương mại chitin đáng kể Số lượng đáng
kể được sản xuất ở châu Á, chủ yếu là Thái Lan, là nước xuất khẩu chính tôm và Ấn Độ Sửdụng chất thải chitin rất hiếm, nhưng nếu được tiến hành đúng cách, sẽ giải quyết được vấn
đề về môi trường xử lý chất thải và cho phép nền kinh tế lớn giá trị của chitin được sử dụng[117] Điều đáng chú ý là việc sản xuất chitin trong sinh quyển biển là rất lớn Lượng chitinhàng năm ước tính được sản xuất bởi động vật phù du biển là hơn vài tỷ tấn [8], và tổng sảnlượng chitin hàng năm ước tính là 1010 tới 1011 tấn [31, 42] Phần lớn sản lượng chitin này ởdạng vỏ gắn với động vật phù du biển và động vật giáp xác ở biển như tôm, cua và tôm hùm.Khi lột xác, bộ khung ngoài lột vỏ có thể chứa nhiều hơn năm lần chitin so với cơ thể củađộng vật Động vật chân đốt hoạt động có ý nghĩa lớn nhất bởi vì chúng tạo ra lượng chitinrất lớn Tương tự, lớp bề mặt của các cơ quan của côn trùng trên cạn và loài nhện có chứamột lượng đáng kể chitin [119] Đáng ngạc nhiên là hàm lượng chitin trong trầm tích biểnkhá thấp Điều này là do quá trình chuyển đổi sinh học được thực hiện bởi vi khuẩn thủyphân chitin ở biển [37], chuyển đổi polysaccharide thành các hợp chất hữu cơ sau đó đượccác vi sinh vật khác sử dụng như một nguồn cacbon và nitơ
Vi sinh vật thủy phân chitin
Thường được tìm thấy trong sinh quyển, vi sinh vật thủy phân chitin có khả năng phânhủy chitin dưới cả hai điều kiện hiếu khí và yếm khí Chúng được tìm thấy trong nhiều môitrường khác nhau Trái ngược với kỳ vọng rằng chúng có rất nhiều trong môi trường cólượng chitin cao (như vỏ tôm), chỉ một số nhỏ đã được xác định trong chất thải của tôm: vikhuẩn thủy phân chitin chỉ chiếm 4% tổng số vi khuẩn dị dưỡng Nấm thủy phân chitinchiếm 25-60% tổng số nấm mốc, nhưng số lượng của chúng thấp hơn số lượng vi khuẩn[106] Trong khi nghiên cứu mối tương quan giữa chất thải tôm và số lượng vi khuẩn trongđường tiêu hóa của cừu, Cobos et al [13] xác định chỉ một tỷ lệ nhỏ vi khuẩn thủy phânchitin trong môi trường này Họ đã xác định không có vi khuẩn thủy phân chitin sau 30 ngàycho cừu ăn một chế độ ăn không chứa hoặc 15% chất thải từ tôm Chỉ sau 72 ngày cho ăncừu trên một chế độ ăn uống có chứa 25% bột chất thải từ tôm đã ghi nhận 0,1% vi khuẩnthủy phân chitin trong hệ thống tiêu hóa của cừu
Chất nền Chitin không phải lúc nào cũng kích thích sự tăng trưởng của vi sinh vật thủyphân chitin Các kết quả thu được từ Zdanowski và Vosjan [123] chỉ ra rằng vi sinh vật thủyphân chitin chỉ là một tỷ lệ nhỏ trong tổng số vi sinh vật trên vỏ nhuyễn thể Trong hồ và đấttrong các lưu vực thoát nước của hồ được xác định có số lượng cao hơn một cách đáng kể.Đất và vùng rễ được sinh trưởng rất nhiều nhờ vi sinh vật thủy phân chitin, và xạ khuẩn làphổ biến nhất Swiontek Brzezinska et al [108] cho rằng 45-69% của xạ khuẩn và 32-40%nấm mốc có thể phân hủy chitin trong đất trong bồn thoát nước của hồ Chełmzynskie Bởi vì
vi sinh vật phân hủy vi khuẩn phân lập từ đất thường hoạt động tích cực hơn vi khuẩn thủyphân chitin phân lập từ nước và trầm tích đáy, chúng có thể thích hợp hơn cho sử dụng trongnông nghiệp Paul và Clark báo cáo rằng 90% tất cả các chủng xạ khuẩn phân lập từ đấtthuộc chi Streptomyces Hầu như, tất cả các xạ khuẩn đều là các tế bào mầm có khả năng
Trang 5phân hủy lignin, chitin, pectin và creatine Vi khuẩn đất có thể phân hủy chitin bao gồm
Flavobacterium, Bacillus, Cytophaga, Pseudomonas Các loại nấm phân hủy Chitin bao
gồm, ví dụ Aspergillus, Mucor và Mortierella [90]
Trong môi trường thủy sinh, chitin bị phân hủy chủ yếu bởi vi khuẩn dị dưỡng Chúng
bao gồm vi khuẩn hiếu khí của chi Aeromonas, Enterobacter, Chromobacterium,
Arthrobacter, Flavobacterium, Serratia, Bacillus, Erwinia, Vibrio [20, 102] Theo Swiontek
Brzezinska et al [107], 15% vi khuẩn phân hủy chitin trong hồ Chełmzynskie giàu dinhdưỡng Tuy nhiên, trong trầm tích đáy của hồ này, số lượng vi sinh vật thủy phân chitin đãđược xác định thấp hơn nhiều Mudryk [71], trong nước mặt của hồ Gardno, phát hiện rarằng 10,6% vi khuẩn phân hủy chitin, so với chỉ 5% ở đáy trầm tích
Vi sinh vật thủy phân chitin sống trong nhiều loại môi trường Kopecny et al [56] tìm
thấy vi khuẩn thủy phân chitin trong phân của động vật ăn cỏ hoang dã (ví dụ, bò rừng bizon
- Bibos bonasus, llama - Llama vicugna paca, và nai sừng tấm - Elaphurus davidianus) và
động vật ăn cỏ trong nước (ví dụ, cừu và bò) Chúng cũng được tìm thấy trong dịch dạ cỏcủa bò, chúng không thể sản sinh ra enzyme để tiêu hóa chitin và do đó cung cấp một môitrường sống cho vi khuẩn thủy phân chitin để đổi lấy sự trợ giúp tiêu hóa hợp chất cứng này
Phần lớn các vi khuẩn được xác định thuộc chi Clostridium, chủng vi khuẩn thường gặp nhất, Clostridium sp ChK5, phân hủy chitin keo và tạo ra acetate, muối axit butyric và
lactate
Có rất ít thông tin về sự tham gia của các vi sinh vật yếm khí trong phân hủy chitin,
mặc dù vi khuẩn phân hủy chitin thuộc chi Clostridium đã được mô tả trong môi trường biển
[8, 110] và Gram âm, vi khuẩn kỵ khí có mặt trong trầm tích [79] Các kết quả thu được từReguera và Leschine [84] cho thấy rằng việc sử dụng chitin như một nguồn nitơ có thể được
phân bố rộng rãi trong các vi sinh vật phân hủy cellulose kỵ khí và hiếu khí Cellulomonas
(ATCC 21 399) có khả năng phân hủy nhanh chóng cellulose và chitin trong điều kiện kị khí
và hiếu khí Sturz và Robinson [99] đã quan sát thấy sự phân hủy của chitin xảy ra chủ yếu ởcác trầm tích bề mặt, nơi vi khuẩn hiếu khí chiếm ưu thế và đóng một vai trò quyết địnhtrong phân hủy chitin
Enzyme thủy phân chitin
CHIs là glycoside hydrolases xúc tác thủy phân chitin Chúng được sản xuất bởi vi sinhvật, nấm, côn trùng, thực vật và động vật và cũng được tìm thấy trong huyết thanh người
[30] Chúng thủy phân các liên kết giữa β-1,4-glycosidic và N-acetyl-D-glucosamine cấu tạo
nên chuỗi chitin [41] Quá trình thủy phân enzim hoàn toàn của chitin thành acetylglucosamine tự do được thực hiện bởi hệ thống thủy phân chitin bao gồm một nhómenzyme đa dạng xúc tác cho quá trình thủy phân chuỗi polyme hóa của chitin [25, 30, 77,91]
N-Danh pháp enzym thủy phân chitin không rõ ràng Do vị trí của liên kết thủy phân, CHI(EC 3.2.1.14) có thể được chia thành hai loại Endochitinases cắt chuỗi chitin ở những vị tríngẫu nhiên, tạo ra oligomers trọng lượng phân tử thấp, chẳng hạn như chitototetriose,
Trang 6chitotriose và diacetylochitobiose Exochitinases giải phóng chitobiose từ đầu tận cùng củachuỗi chitin Trong quá khứ, đã có hai lớp khác nhau cho các enzyme này: chitobiases chịu
trách nhiệm cho sự phân giải của chitobiose, và β-NN-acetylglucosaminidases, các tạo ra các đơn phân β-NN-acetyl-D-glucosamine [14, 88] Hiện nay, theo danh pháp được thành lập bởi
Ủy ban Danh mục Liên minh Hóa sinh và Sinh học Phân tử Quốc tế, chitobiase và β-NN-N acetylglucosaminidases được bao gồm trong tập hợp chung của β-NN-acetylhexosaminidases
(EC.3.2.1.52) [14, 88]
Khi phân loại theo sự giống nhau của trình tự amino acid, CHIs có thể được chia thành
ba họ: 18, 19 và 20 Họ 18 bao gồm CHIs bắt nguồn chủ yếu từ nấm nhưng cũng từ vikhuẩn, virus, động vật, côn trùng và thực vật Họ 19 bao gồm CHIs bắt nguồn từ thực vật
(loại I, II và IV) và một số có nguồn gốc từ vi khuẩn, ví dụ: Streptomyces griseus Họ 20 bao gồm N-acetylgluco-saminidase từ Vibrio harveyi và Nacetylhexosaminidase từ
Dictyostelium discoideum và người [16, 21,41, 77] Nhiều vi khuẩn, bao gồm các loài Marcescens Serratia, Aeromonas sp., Pseudomonas aeruginosa K-187, và S.griseus HUT
6037, có thể tổng hợp nhiều CHIs khác nhau [45, 101, 112, 116] Hơn nữa, nấm mốc
Trichoderma harzianum tạo ra hai N-acetyl-glucosaminidases, bốn endochitinases, và một
chitobiosidase [38]
Các CHIs từ vi khuẩn có phân tử khối từ 20 đến 120 kDa, với hầu hết 20–60 kDa [49,51] Độ pH và nhiệt độ tối ưu lần lượt của CHIs là 5–8 và 40 0C Tùy thuộc vào nguồn gốccủa CHI, hoạt động của nó có thể bị ức chế hoặc ổn định bởi sự có mặt của các ion kim loạikhác nhau (Bảng 1) Một chất ức chế mạnh mẽ của CHIs là allosamidin, lần đầu tiên đượcbáo cáo là một chất ức chế cạnh tranh cụ thể của CHI côn trùng Allosamidin có cấu trúctương tự như một chất nền trung gian, một oxazoline vòng có thể hình thành giữa oxy
cacbonyl của nhóm N-acetyl và C-1 của N-acetylglucosamine trong quá trình thủy phân [55].
CHIs là các enzyme cảm ứng (thích ứng), tức là chúng được biểu hiện hiện chỉ trongmột số điều kiện nhất định được cảm ứng bởi một yếu tố nhất định và được điều khiển bởi
hệ thống chất ức chế /cảm ứng Trong khi chitin là một chất cảm ứng, glucose hoặc mộtnguồn cacbon dễ dàng đồng hóa khác có thể là một chất ức chế [86] Theo Frandberg vàSchnurer [27], việc duy trì sản xuất các CHIs có thể được cảm ứng bởi chitin vàchitooligosaccharide trong môi trường; tuy nhiên, không có CHIs sản xuất ngoại bào đượctìm thấy trong trường hợp không có các hợp chất này Mặc dù một số actinomycetes sảnxuất CHIs một cách cấu thành, một chất nền chitin thích hợp luôn làm tăng sản lượng [77].Công việc sản xuất CHIs thông qua các chất chitin khác nhau là một tính năng đặc biệt củasản xuất enzime Nhiều nghiên cứu sử dụng chitin keo để sản xuất CHIs [44, 63] Tuy nhiên,một số vi sinh vật có thể sản xuất CHIs hoạt động trong sự hiện diện của vỏ tôm [10, 117].Các kết quả nghiên cứu trong phòng thí nghiệm nhằm đánh giá hoạt tính enzime của
Trichoderma chỉ ra rằng môi trường chứa chitin tinh khiết hoặc sợi nấm là nguồn cacbon
duy nhất cung cấp các điều kiện tăng trưởng tối ưu cho việc sản xuất CHIs ngoại bào Cácnghiên cứu sử dụng các chất nền carbon khác nhau đã xác nhận mối quan hệ giữa một nguồncarbon chuyển hóa và tổng hợp các enzym thủy phân chitin Hoạt tính thủy phân chitin được
Trang 7quan sát thấy ở vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường có chứa chitin keo hoặc glycol, acetylglucosamine, chitooligosaccarides, hoặc thành tế bào của một số loại nấm nhất định.Không có hoạt tính hoặc hoạt tính thấp của cùng một vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường cóchứa glucose hoặc laminarin làm nguồn cacbon [69, 88, 124] Các nghiên cứu về phân tử đãphát hiện sự hiện diện của một hệ thống truyền tín hiệu hai thành phần điều hòa sự tổng hợp
N-các CHIs trong Pseudoalteromonas piscicida O-7, Streptomyces thermoviolaceus OPC-520
và các vi khuẩn khác Các hệ thống bao gồm hai protein: một protein histidine kinase và mộtprotein điều hòa đáp ứng Để đáp ứng với tín hiệu từ môi trường (sự hiện diện của chitinhoặc các dẫn xuất của nó), một kinase vi khuẩn trải qua quá trình tự phosphoryl hóa ở cácamino acid histidine, sau đó xúc tác chuyển một nhóm phosphate sang amino acidasparagine trong trình tự của protien điều hòa đáp ứng Protein điều hòa đáp ứng đượcphosphoryl hóa kết hợp với trình tự promoter và hoạt hóa sự phiên mã của gen mã hóa CHI[87, 88, 111]
Bảng 1 Các tính chất sinh hóa của một số vi sinh vật CHIs
Vi sinh vật Loại enzime Khối
lương phân
tử (kDa)
Nhiệt độ ( 0 C)
pH Chất ức chế Chất kích hoạt Tài liệu
tham khảo
Zn 2+ , SDS, Tween 40, Triton X-100
Trang 8Ca 2+ , Ba 2+ , Na 2+ ,
k + [34]
Phân hủy chất thải của tôm, nguồn chính của chitin
Sự phân hủy của chitin, một phần quan trọng của chu kỳ carbon và nitơ toàn cầu [43],chủ yếu dựa vào các quá trình vi sinh Chitin có thể được sử dụng bởi các quần thể vi sinhvật như là nguồn duy nhất của hai yếu tố này [67] Được coi là chất thải thông thường, chấtthải từ tôm (nguồn chính của chitin) được chế biến làm thức ăn chăn nuôi và cũng được sửdụng trong nông nghiệp như phân bón nitơ tự nhiên giá rẻ Tuy nhiên, nó không phải làkhông phổ biến cho chất thải tôm để đi từ một lưu vực thoát nước đến vùng nước tĩnh, nơi
nó bị phân hủy bởi các vi sinh vật khác nhau Swiontek Brzezinska et al [106] xác định tỷ lệphân hủy bằng cách đánh giá lượng oxy tiêu thụ bởi các vi sinh vật có mặt trong chất thảicủa tôm Trong nghiên cứu này, họ sử dụng phân đoạn thận có chứa một lượng đáng kể chấtbéo và protein và vỏ không chứa chất béo hoặc protein Kết quả nghiên cứu của họ cho thấy
tỷ lệ phân hủy rất cao, với lượng tiêu thụ oxy tương đối cao, điển hình của loại môi trườngnày Do hàm lượng chitin và thành phần của chúng, quá trình oxy hóa vỏ tôm là chậm hơnkhi so sánh với quá trình oxy hóa của các bộ phận khác
Trong trầm tích nước và đáy của một hồ có tính chất phú dưỡng cao, chất thải của tômđược chuyển hóa hiệu quả bởi các vi sinh vật ở mặt đáy Tiêu thụ oxy trong sự hiện diện củachất thải tôm cao hơn ở phía dưới trầm tích hơn trong nước, và sự khác biệt này đã được sosánh với sự tích lũy cao hơn của các vi sinh vật trong trầm tích [107] Ngoài ra,
Streptomyces rimosus phân lập từ đất có hiệu quả chuyển hóa không chỉ chất thải tôm mà
còn chitosan, một dẫn xuất chitin Sau khi nuôi cấy trong 14 ngày, tỷ lệ phân hủy củachitosan là 42,5%, và tỷ lệ phân hủy vỏ tôm là 38,2% Xem xét rằng các chất liệu này rấtkhó phân hủy, kết quả có thể được coi là đạt yêu cầu [105] Khi Hoang và cộng sự [43]
nghiên cứu sự phân hủy vỏ tôm của Streptomyces sp TH-11, họ nhận thấy giảm đáng kể
trọng lượng của vỏ sớm nhất là ngày 7, 12 và 16 Tương tự như các cân phân tử khác, chitinkhông dễ dàng chuyển hóa, thậm chí bởi vi sinh vật chitino-lytic, bởi vì quá trình oxy hóacủa nó đòi hỏi thời gian Theo Mudryk [72] và Grover và Chrzanowski [33], cellulose, tương
tự cấu trúc chitin, không được sử dụng rộng rãi làm chất nền hô hấp, và chỉ một số ít vi sinhvật có thể phân hủy polyme này
Trang 9Chất thải vỏ tôm được kiểm tra chủ yếu để sản xuất monosaccharides hoạt tính sinh
học và oligosaccharides [18] như N-Nacetylglucosamine, được sử dụng để sản xuất mỹ phẩm
và các chất bổ sung dinh dưỡng [12] Vỏ tôm cũng là một chất nền để sản xuất CHIs
Actinomycetes và một số loài vi khuẩn sử dụng vỏ tôm hiệu quả hơn chitin keo cho các luận
án của CHIs Ngoài ra, Rattanakit et al [83] duy trì rằng chất thải vỏ tôm là một chất nền tốt
cho nuôi cấy Aspergillus sp S1–13, khi được trồng trên phương tiện truyền thông chứa chất
thải từ tôm, tổng hợp lượng enzyme thủy phân chitin giống nhau hoặc cao hơn so với nấmđược trồng trên môi trường có bổ sung chất chitin dạng keo Wang et al [115], Chang et al.[10], và Wang và Chang [116], người điều tra hoạt tính thủy phân chitin của vi khuẩn ở các
chi Bacillus và Pseudomonas sử dụng thành công chất thải vỏ tôm và cua để sản xuất CHIs
Các vi sinh vật CHIs trong kiểm soát sinh học
Nấm thực hiện vai trò rất quan trọng trong quá trình vận hành hệ sinh thái Khi các sinhvật hoại sinh chúng phân hủy chất hữu cơ, dẫn đến sự hình thành các chất mùn Tuy nhiên,rất nhiều loại nấm này là ký sinh trùng và mầm bệnh Những loại nấm tấn công cây trồng
đặc biệt nguy hiểm Các mầm bệnh thực vật nghiêm trọng nhất bao gồm: Fusarium,
Penicillium, Alternaria, Botrytis, Ramularia, Monilinia, Cladosporium và Aspergillus.
Những loài nấm này tấn công nhiều cây trồng làm vườn, bao gồm rau, trái cây và hoa trangtrí Để bảo vệ cây trồng, người ta áp dụng các loại hóa chất bảo vệ thực vật khác nhau (thuốcdiệt nấm) được sản xuất trong hóa học tổng hợp Ngoài ra còn có nhiều tác nhân sinh họcchống lại các mầm bệnh nấm, chứa nhiều hoạt chất sinh học khác nhau có nguồn gốc vi sinhvật, ví dụ, CHIs
Khả năng của các vi sinh vật để sản xuất ra kháng nấm CHIs được biết đến rộng rãi
(Bảng 2) Các enzim được tạo ra bởi các loài nấm Trichoderma có tầm quan trọng trong
công nghệ sinh học Cơ chế hoạt động của chúng đã được mô tả [5] Áp dụng các chế phẩm
có chứa nấm mốc này trong kiểm soát sinh học nấm phát triển có thể là kết quả của việc sản
xuất các enzym như CHIs hoặc glucanases [2, 38, 58] Exo-Nα-N1,3-glucanase có thể liên kết với các thành tế bào của các loại nấm gây bệnh khác nhau như Aspergillus niger, Botrytis
cinerea, Colletotrichum acutatum, Fusarium oxysporum, Penicillum aurantiogriseum, hoặc Rhizoctonia solani [2] CHI có hiệu quả ức chế sự tăng trưởng của R solani, Marcho-N phominia phaseolina, Fusarium sp [4, 70, 75]
Hơn nữa, CHIs của nguồn gốc vi khuẩn cũng đã được tìm thấy để hiển thị tính chất diệt
nấm Ví dụ, CHIs Bacillus thuringiensis spp colmeri ức chế sự tăng trưởng của nhiều tác nhân gây bệnh, bao gồm R solani, B cinerea, Penicillium chrysogenum và Physalospora
piricola [61] Prasanna et al [81] nói rằng CHI từ Brevibacillus laterosporus ức chế hiệu
quả sự phát triển của Fusarium equiseti Các loại enzyme này cũng cho thấy mối quan hệ thích hợp với côn trùng Một số nấm men, ví dụ, Pichia anomala hoặc Pichia mem-N
branefaciens, cũng sỡ hữu tính chất diệt nấm β-1.3-glucanase ức chế sự phát triển của B cinerea [48, 65] Sự phát triển của nấm mốc này cũng bị ức chế hiệu quả bởi các CHI được
sản xuất bởi nấm men sau đây: Candida saitoana, C guilliermondii, và C oleophila [23,
89] Actinomycetes cũng hiển thị tính chất diệt nấm mạnh Nó liên quan đến việc sản xuất
Trang 10nhiều loại hợp chất diệt nấm khác nhau, bao gồm kháng sinh và enzyme thủy phân ngoại bàonhư CHIs và b-1,3-glucan-ases [80] Streptomyces halstedii, S griseus và S.cavourensisSY224 sản xuất ra chất CHIs kháng nấm có hoạt tính cao, hàm ý khả năng sử dụng chúng
làm tác nhân bảo vệ sinh học cho cây trồng [29, 49, 60] Streptomyces halstedii, S griseus
và S.cavourensis SY224 sản sinh ra các chi nấm chống nấm có hoạt tính cao, hàm ý khả
năng sử dụng chúng làm tác nhân bảo vệ sinh học cho cây trồng [29, 49, 60] Với việc sửdụng các kỹ thuật kỹ thuật di truyền, nó cũng có thể sử dụng trong quá trình kiểm soát sinhhọc của các phytopathogens các enzyme tái tổ hợp thu được bằng cách đưa các gen thíchhợp mã hóa CHIs kháng nấm vào nhiều loại sinh vật khác nhau rong nghiên cứu được thựchiện bởi Bezirganoglu et al [6] protein kháng nấm (AFP) và gen hợp nhất CHI đã được đưavào dưa hấu phương Đông để kiểm soát các bệnh nấm do R solani và F oxysporum gây ra.Kết quả của họ đã chứng minh rằng gen tổng hợp AFP-CHI có hiệu quả trong việc bảo vệcây dưa chuyển gen chống lại bệnh nấm do R solani và F oxysporum gây ra Matroodi et al.[66] đã xây dựng một CHI coneric bằng cách thêm tên miền liên kết chitin từ S marcescensvào nấm CHI, Trichoderma atroviride Chit42, để nghiên cứu vai trò của miền gắn kết chitintrong hoạt động enzyme của Chit42 Việc đánh giá hoạt tính kháng nấm của các công trìnhkiến trúc và chim bản địa được xây dựng đã được thực hiện để nghiên cứu ảnh hưởng củaChBD trong hoạt tính kháng nấm của CHIs Nghiên cứu của họ đã chứng minh rằng sự hợpnhất của ChBD đã cải thiện ái lực với tinh thể và chitin dạng keo và cũng là hoạt độngenzyme của CH tinh trùng khi so sánh với Chit42 Chimeric CHI cho thấy hoạt tính khángnấm cao hơn đối với phytopathogenic nấm Hiệu quả của các tác nhân enzym trong việcchống nấm phytopathogens phụ thuộc vào nhiều yếu tố Roberts và Selitrennikoff [85] đãkhám phá ra rằng CHIs có nguồn gốc vi khuẩn cho thấy hoạt tính diệt nấm thấp hơn đáng kể
so với nguồn gốc thực vật Các tác giả kết hợp hiện tượng này với thực tế là phần lớn các chi
vi khuẩn là exochitin-ases có hoạt động thấp hơn một hoặc hai bậc so với endochitinases.Đồng thời hoạt tính diệt nấm có thể liên quan đến sự tương tác của các loại enzym khác
nhau Nghiên cứu của Someya et al [95] đã chứng minh rằng hoạt động phối hợp của en -N
dochitinase và chitobiase được tạo ra bởi các chuỗi tinh thể Serratia ức chế sự phát triển của
B cinerea đến một mức độ lớn hơn so với một trong hai enzyme riêng biệt Chang et al [11]
nói rằng Bacillus cereus QQ308 sản xuất các enzym thủy phân chống nấm, bao gồm CHI,
chitosanase và protease, khi được nuôi trong môi trường có chứa tôm và vỏ vỏ cua được sản
xuất từ chất thải biển Sự tăng trưởng của nấm gây bệnh thực vật F oxysporum, F solani, và
Pythium tối ưu đã bị ảnh hưởng đáng kể bởi việc nuôi trồng của QQ308 Một số chi nấm
mốc sản xuất rất mạnh endochitinases - T harzianum và Fusarium chlamydosporum có ý
nghĩa đặc biệt trong việc bảo vệ thực vật Ngoài chitnases, chúng còn tạo ra các enzym thủyphân khác, ví dụ, protease, tương tác với nhau đối với các enzyme phân hủy chitin [82] Joo[49], thử nghiệm hoạt tính diệt nấm của CHIs tinh khiết và không tinh khiết được sản xuấtbởi S halstedii, chứng minh rằng việc chuẩn bị enzym ức chế sự phát triển của một số chicủa nấm thực vật nấm, đến một mức độ lớn hơn hoặc thấp hơn Các CHIs đã ức chế sự phát
triển của Alternaria alternata, Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium ox-Nysporium, và sợi nấm lycopersici Stemphylum, và những chất không tinh khiết cũng gây ra sự ức chế sự tăng trưởng của Phytophtora capsci Swiontek Brzezinska et al [103, 104] phát hiện trong
Trang 11các thử nghiệm rằng mức độ ức chế sự phát triển của phytopathogenetic phụ thuộc vào mức
độ tinh khiết của việc chuẩn bị enzym Các CHIs không bị thanh lọc hóa mạnh mẽ hơn đốikháng so với CHIs tinh khiết Nó có thể kết nối với sự hiện có của các loại thuốc kháng sinhkhông tinh khiết làm tăng hoạt tính diệt nấm của các tác nhân Sự tương tác hợp lực giữa b-1,3-glucanase và kháng thể peptide-peptide (peptabols) đã được tiết lộ trong quá trình ký
sinh của T harzianum Peptabols và trichorzianines A và B có khả năng ức chế tổng hợp
b-glucan (các enzyme chịu trách nhiệm tổng hợp b-b-glucan trong thành tế bào) phân lập từ
plasmalemma của B cinerea Tác dụng của peptabols có thể được tăng cường bằng cách bổ sung b-1,3-glucanase được sản xuất bởi T harzianum, làm tăng hiệu quả diệt nấm của chúng
[64, 120]
Bảng 2: Hoạt tính kháng nấm của một số chi vi khuẩn
thamkhảo
Bacillus cereus IO8
Bacillus thuringiensis subsp.
Rhizoctonia solani
Alternaria alternata, Fusarium moniliforme, Magnaporthe grisea
Rhizoctonia solani, F solani.
Rhizopus arrhizus, Sclerotium rolfsii, R solani, Phytophthora
infestans, F oxysporum, Phanerochaete chrysosporium
Fusarium oxysporum, F solani, P ultimum Fusarium graminearum, R solani, Magnaporthe grisea,
Sclerotinia sclerotiorum, Trichoderma reesei, B.
cinerea, Bipolaris sp.
Botrytis cinerea Rhizoctonia solani, B cinerea, P chrysogenum,
P piricola, Penicillium glaucum, Sclerotinia fuckelian
Fusarium equiseti Aeromonas hydrophila SBK1
Fusarium moniliforme, Aspergillus niger, Mucor rouxi, Rhizopus nigricans
Fusarium sp Rhizoctonia bataticola
[114]
[4, 70,75]
[39][22]
[68][7]
[11][28]
[36][61]
[81]
[35][17][113][46,100