công nghệ tế bào thực vật

Nhóm Bản chất hóa học Nguồn gốc Vị trí sinh tổng hợp Sự vận chuyển Vai trò sinh lý Auxin Acid libe Kéo dài và phân chia tế bào, hướng động, ưu tính ngọn, lão suy, rụng, đậu và tăng trưở

CÔNG NGHỆ

Công ngh sinh h c là s th ng m i hóa sinh h c nh ệ ọ ự ươ ạ ọ ờ

s nuôi c y t bào và công ngh tái t h p DNA (Vasil, ự ấ ế ệ ổ ợ 1990).

Công ngh sinh h c th c v t đ c chú ý vì ba lí do: ệ ọ ự ậ ượ

a 98% th c ph m trên th gi i d a vào đ t, 92% nhu c u ự ẩ ế ớ ự ấ ầ

Ng i ta phân bi t s áp d ng các công ngh sinh ườ ệ ự ụ ệ

h c th c v t:ọ ự ậ

1 Các áp d ng ng n h n (d i 5 năm) d a vào ụ ắ ạ ướ ựcác k thu t vi nhân gi ng, nuôi c y mô phân sinh, ỹ ậ ố ấphôi ch a tr ng thành, t o cây đ n b i, s n xu t ư ưở ạ ơ ộ ả ấcác ch t bi n d ng th c p, dung h p t bào ấ ế ưỡ ứ ấ ợ ế

tr n,…ầ

2 Các áp d ng trung h n (5-10 năm) d a vào ụ ạ ự

s chuy n các gen có ích và thu nh n cây chuy n ự ể ậ ểgen qua nuôi c y t bào.ấ ế

3 Các áp d ng dài h n (trên 10 năm) d a vào ụ ạ ự

s hi u bi t hoàn h o h n v s phát tri n th c ự ể ế ả ơ ề ự ể ự

v t m c phân t , v c u trúc, ch c năng và s ậ ở ứ ử ề ấ ứ ự

bi u hi n c a các gen l ể ệ ủ ạ

Công ngh sinh h c đang làm thay đ i nông ệ ọ ổ

nghi p trên ba ph ng di n chính: ệ ươ ệ

1 Đi u khi n các quá trình sinh tr ng và ề ể ưở

phát tri n c a th c v t ể ủ ự ậ

2 B o v th c v t ch ng l i stress ả ệ ự ậ ố ạ

3 Kh c ph c nh ng h n ch trong s n xu t ắ ụ ữ ạ ế ả ấ

các lo i th c ph m ch c năng, hóa ch t ạ ự ẩ ứ ấ sinh h c và d c ph m ọ ượ ẩ

I NUÔI C Y MÔ, T BÀO TH C V T Ấ Ế Ự Ậ

Nuôi c y mô th c v t theo nghĩa r ng ấ ự ậ ộ

là s nuôi c y in vitro t t c các ph n ự ấ ấ ả ầ

th c v t: t bào đ n, mô hay c quan, ự ậ ế ơ ơ trong đi u ki n nhân t o và vô trùng ề ệ ạ

Theo nghĩa h p, ta có th phân bi t các ki u nuôi c y in vitro ẹ ể ệ ể ấ

khác nhau:

1 Nuôi c y cây non (plant culture) ấ

2 Nuôi c y phôi non hay tr ng thành (embryo culture) ấ ưở

3 Nuôi c y c quan (organ culture) ấ ơ

4 Nuôi c y mô hay mô s o (tissue or callus culture) ấ ẹ

5 Nuôi c y d ch treo (suspension culture) hay nuôi c y t ấ ị ấ ế

bào (cell culture)

6 Nuôi c y t bào tr n (protoplast culture) ấ ế ầ

7 Nuôi c y th đ n b i: h t ph n, bao ph n hay noãn ấ ể ơ ộ ạ ấ ấ

Các y u t nh h ng đ n quá trình nuôi ế ố ả ưở ế

c y mô: ấ

• Tr ng thái sinh lí c a mô c y ạ ủ ấ

• Thành ph n các ch t dinh d ng trong ầ ấ ưỡ

môi tr ng nuôi c y ườ ấ

Nhóm Bản chất hóa

học Nguồn gốc Vị trí sinh tổng hợp Sự vận chuyển Vai trò sinh lý

Auxin Acid

libe

Kéo dài và phân chia tế bào, hướng động, ưu tính ngọn, lão suy, rụng, đậu và tăng trưởng

trái, chín trái, tính cái của hoa

Giberelin Cấu trúc

giberelan Acid mevalonic Các mô non của chồi, lá, rễ,

phôi

Trong libe và mạch mộc vỡ trạng thái ngủ, kích thích nảy mầm, đậu và Kéo dài thân và cuống hoa cây ngày dài, phá

tăng trưởng trái, tính đực của hoa

Cytokinin Dẫn xuất

adenin Adenin Ngọn rễ và hột đang phát triển mộc (từ rễ tới Trong mạch

chồi)

Phân chia tế bào, tạo chồi, phá vỡ trạng thái ngủ, tăng trưởng nụ nách, tăng rộng lá, chậm

lão suy

Abcisic acid Sesquiterpen Acid mevalonic Rễ, lá trưởng

thành, trái non,

hột

Xuất từ rễ trong mạch mộc và từ lá trong libe

Đóng khí khẩu, cản tăng trưởng chồi, cảm ứng tổng hợp protein trong hột, cảm ứng và duy trì

sự ngủ, dấu hiệu khô hạn

Ethylen C2H4 metionin Mô chịu stress,

trái chín, mô

Khuếch tán, ACC được

Gỡ hưu miên, tăng trưởng và phân hóa (chồi và rễ), tạo rễ bất định, rụng lá và trái, tính cái

1 Ph ươ ng pháp kh trùng môi ử

tr ườ ng nuôi c y, d ng c th y ấ ụ ụ ủ tinh và d ng c c y ụ ụ ấ

Môi trường

Dụng cụ thủy tinh

Dụng cụ cấy

Thể tích môi trường trong bình chứa

(ml) Thời gian khử trùng tối thiểu (phút)

2 Khử trùng phòng nuôi cấy, tủ

cấy

• Khử trùng phòng nuôi cấy mô

• Khử trùng tủ cấy

3 Khử trùng mô thực vật

Xà phòng Alcol 700

4 Pha chế môi trường

Môi trường MS, N6, SH, AA.

• Stock đa lượng, vi lượng: 2-40C,1

năm

• Stock vitamin: 2-40C, 2-3 tháng

• Các chất điều hòa tăng trưởng thực

vật: 2-4 C, vài tháng hoặc vĩnh viễn

II HỢP CHẤT THỨ CẤP

Các h p ch t th c p là các ch t không có ch c ợ ấ ứ ấ ấ ứ năng tr c ti p trong các quá trình đ ng hóa, hô h p, v n ự ế ồ ấ ậ chuy n, tăng tr ng và phát tri n th c v t ể ưở ể ự ậ

Ch c năng ch y u c a các h p ch t th c p là b o ứ ủ ế ủ ợ ấ ứ ấ ả

v th c v t ch ng l i các tác nhân gây b nh và đ ng v t ăn ệ ự ậ ố ạ ệ ộ ậ

c Nhi u ch t th c p có ho t tính sinh h c m nh đ c ỏ ề ấ ứ ấ ạ ọ ạ ượ dùng làm ch t di t côn trùng, n m, d c ch t ấ ệ ấ ượ ấ

H p ch t th c p đ c phân làm ba nhóm chính ợ ấ ứ ấ ượ ở

th c v t: các terpen, các h p ch t phenolic và các h p ự ậ ợ ấ ợ

ch t ch a nitrogen ấ ứ

S t ng h p và tích lũy các h p ch t th c p x y ra trong ự ổ ợ ợ ấ ứ ấ ả

t bào c a nh ng c quan khác nhau Trong t bào s n xu t, ế ủ ữ ơ ế ả ấ

chúng đ c t ng h p và tích lũy trong các ngăn d i t bào khác ượ ổ ợ ướ ế nhau.

Ví d : ụ Các anthocyan đ c t ng h p trong t bào ch t và tích lũy ượ ổ ợ ế ấ trong không bào.

Các acid amin th m và terpenoid đ c tìm th y trong di p ơ ượ ấ ệ

l p ạ

Shikonin trong m ng n i ch t và túi màng ạ ộ ấ

S tích lũy đôi khi x y ra trong các t bào ự ả ế

1 Alkaloid

chất hữu cơ, có chứa nitơ, có phản ứng kiềm

a Tính chất vật lý

- Có oxy trong phân tử: thể rắn; không có oxy

trong phân tử: thể lỏng

- Mùi vị: đa số không mùi, vị đắng, 1 số cay

- Màu sắc: đa số không màu, 1 số ít có màu vàng

(becberin, palmatin, chelidonin)

- Độ tan: không tan trong nước, dễ tan trong

dung môi hữu cơ

b Tính chất hóa học

- Tác dụng với các acid

- Tác dụng với kim loại nặng: muối phức

- Phản ứng với thuốc thử: tạo tủa, tạo màu

 Thuốc thử Mayer (K2HgI4): tủa trắng hoặc vàng ngà

 Thuốc thử Dragendorff (KBiI4): tủa đỏ cam-đỏ

 Thuốc thử Bouchardat (iodo-iodid): tủa nâu-nâu đen

 Thuốc thử Bertrand : tủa trắng

 Thuốc thử Hager: tủa vàng-đỏ cam

III H T NHÂN T O Ộ Ạ

H t nhân t o (artifical seed) là d ng h t mô ộ ạ ạ ộ

ph ng h t t nhiên, có m t phôi sinh d ỏ ộ ự ộ ưỡ ng đ ượ c

b c trong m t l p hydrogel có ch a ch t dinh ọ ộ ớ ứ ấ

d ưỡ ng Sau đó, phôi này n y m m thành m t cây ả ầ ộ con hoàn ch nh ỉ

Phôi vô tính, phôi th h , phôi sinh d ng, ể ệ ưỡ

(3)

(4)

8 μm

Mô sẹo 6 tháng tuổi Dịch treo tế bào 2 tuần tuổi Phôi

Tính dính v a ph i ừ ả

Không gây đ c cho phôi, có đ c tính ộ ặ

t ng h p sinh h c ươ ợ ọ

Kh năng t o gel nhanh, đ đ c lâu ả ạ ể ượ

Đ c ng gel v a thu n l i cho s hô h p ộ ứ ừ ậ ợ ự ấ

c a phôi, v a b o v phôi kh i nh ng ủ ừ ả ệ ỏ ữ

t n th ng bên ngoài ổ ươ

• B sung các ch t dinh d ng, ch t đi u ổ ấ ưỡ ấ ề hòa sinh tr ng th c v t ưở ự ậ

• Ch t n n, các ch t kháng sinh, tr n m, ấ ề ấ ừ ấ

tr sâu, vi sinh v t ừ ậ

• Gieo tr ng h t nhân t o: ngâm trong ồ ộ ạ

KNO3 200mM trong 1 gi , r a d i vòi ờ ử ướ

n c trong 40 phút H t đ c tr ng vào ướ ộ ượ ồ khay, n y m m sau 6 gi ả ầ ờ

Đun cách thủy, khuấy tan

Khử trùng 121 0 C, 1atm, 40phút

Dùng pipet nhỏ giọt

Mẫu cấy (phôi vô tính)

Dung dịch vỏ alginate Bột alginate

Dung dịch vỏ bao alginate (1)

Dung dịch vỏ bao alginate (2)

Chồi sau một tuần Chồi sau 10 ngày

Hạt mới tạo thành Hạt nảy chồi sau 1 tuần

IV H TH NG NUÔI C Y Ệ Ố Ấ

IV H TH NG NUÔI C Y Ệ Ố Ấ

BIOREACTOR

Bioreactor

là m t bình ph n ng nuôi c y trong môi ộ ả ứ ấ

tr ng l ng đi u ki n vô trùng ườ ỏ ở ề ệ

- S l ng m u c y nhi u ố ượ ẫ ấ ề

- Có kh năng t đ ng hóa, vi tính hóa thông ả ự ộ

qua vi đi u khi n các y u t môi tr ng nh ề ể ế ố ườ ư

m c đ khu y tr n, s thoáng khí, nhi t đ , ứ ộ ấ ộ ự ệ ộ oxy hòa tan, pH, vv…

1 Phân lo i bioreactor theo ng d ng g m: ạ ứ ụ ồ

- Lo i nuôi c y ng p chìm toàn b hay liên t c ạ ấ ậ ộ ụ

3 Phân lo i theo s di chuy n c a m u nuôi c y: ạ ự ể ủ ẫ ấ m u n i sát b m t môi tr ng, ẫ ổ ề ặ ườ

m u l l ng trong môi tr ng, m u chìm ẫ ơ ử ườ ẫ

VI S CHUY N GEN TH C V T Ự Ể Ở Ự Ậ

Sự chuyển gen là sự biến đổi

bộ gen của tế bào bởi sự thêm vào đó một DNA ngoại sinh

1 Sự dung hợp tế bào trần

1.1 Sự cô lập và nuôi cấy tế bào trần

- Sự cô lập

Enzyme: cellulaz, hemicellulaz, pectolyaz

Cân bằng: CaCl2, KCl, manitol, sorbitol

1.2 Sự lai thể hệ bằng sự dung hợp tế bào trần

a Tự dung hợp: xảy ra trong quá trình thủy giải enzyme, do sự tăng rộng của các cầu liên bào ở các tế bào nằm cạnh nhau Tần số tự dung hợp gia tăng theo nhiệt độ (35-45 0 C).

Cô lập 2 loại tế bào trần

Rửa CaCl2 + manitol, hòa chung

Xử lí điện trường và xung điện

1.3 Các sự kiện di truyền

- Bộ gen nhân

Hợp nhất toàn phần hay một phần của hai nhân: tế bào lai

Một trong hai nhân được bảo tồn: tế bào chất lai

1.4 Tuyển chọn các sản phẩm dung hợp

Nhuộm sống tế bào trần bằng các chất phát huỳnh quang khác nhau

VD: fluorescin, rhodamin

Tạo các tế bào lai sao cho chỉ có các tế bào này

phát triển trên môi trường tuyển chọn

Tạo dòng tế bào có đặc tính mới

Tạo dòng tế bào có đặc tính bổ sung

Các dòng tế bào kháng với các chất độc riêng biệt Tuyển chọn ở cây nguyên vẹn

2 Sự chuyển gen nhờ Agrobacterium

Nuôi cấy tế bào trần thực vật/vi khuẩn hoặc ‘tế bào thực vật/vi khuẩn’

Chủ yếu dicot: cà chua, khoai tây, bông vải, vv…

- Plasmid: phân tử DNA vòng, sợi kép, kích thước nhỏ, nằm tách biệt với nhiễm sắc thể, trong tế

bào vi khuẩn

- Plasmid mang 3 loại gen: có ích, chỉ thị, báo hiệu Gen có ích: kháng bệnh, kháng thuốc trừ cỏ, tạo màu hoa, chậm chín trái,…

Gen chỉ thị: cho phép thực vật tránh xa hiệu

ứng độc của tác nhân chọn lọc

Gen báo hiệu: gus – mã hóa β-glucuronidaz

VD: 12-24g sau chuyển gen, ủ tế bào với X-Gluc,

cho màu xanh lơ đậm

TẠO GIỐNG LÚA BIẾN ĐỔI GEN GIÀU

VITAMIN A

3 Kỹ thuật ‘súng’ DNA

Các plasmid có mang gen lạ được cố định trên các hạt kim loại có đường kính khoảng 1µm, nhờ lực hút tĩnh điện

và được bắn với vận tốc lớn xuyên qua vách, màng và

xen vào bộ gen của tế bào.

Các plasmid được dùng ngoài gen có ích còn có gen dùng để tuyển chọn các tế bào chuyển gen và gen chỉ thị

(gus).

Cấu tạo súng DNA:

- Bình chứa khí helium (6-8atm, 1100psi)

- Van, áp kế điều chỉnh lượng khí thoát ra

- Máy chỉnh thời gian (50-70ms)

- Lưới (lỗ 100µm): 1 giọt 1-2µl hạt kim DNA

loại Chuông chân không (loại 0,95 bars)

- Giá điều chỉnh khoảng cách

VII TH Y CANH Ủ

William Frederick Gericke, 1937 là người đầu tiên khảo sát, phát triển một phương pháp nuôi trồng thực vật trong nước (dịch dinh dưỡng) khả thi về mặt kinh tế cho mục đích thương mại.

Cooper, 1975 đưa ra kỹ thuật màng dinh dưỡng (NFT – nutrient film technique), là kỹ

thuật thủy canh đầu tiên được sử dụng trên qui

mô lớn

Thủy canh (hydroponics) là trồng cây không cần đất, mà trồng trực tiếp vào dung dịch dinh dưỡng và các giá thể

khác không phải là đất.

Lợi ích của thủy canh:

1 Năng suất cao

2 Sản phẩm hoàn toàn sạch, phẩm chất

cao

3 Thích nghi dễ dàng với các điều kiện

trồng khác nhau

Các yếu tố ngoại sinh có thể ảnh hưởng trực tiếp: nồng độ CO2, dinh

dưỡng khoáng, độ thoáng khí cho rễ, nhiệt độ, nấm bệnh, vv…

Thủy canh gồm hai dạng: hồi lưu

và không hồi lưu.

KỸ THUẬT MÀNG MỎNG DINH DƯỠNG (NFT)

Bể chứa

Ống dẫn dinh dưỡngỐng dẫn dinh dưỡng Ống PVC

Bơm

KỸ THUẬT TÚI TREO KỸ THUẬT TÚI TĂNG TRƯỞNG

Ống cung cấp dung dịch dinh dưỡng

Chậu chứa giá thể

Ống cung cấp dung dịch dinh dưỡng

KỸ THUẬT RÃNH

Lớp phủ bằng plastic Môi trường dinh dưỡng ở dạng sương mù

Các tấm xốp

KỸ THUẬT KHÍ CANH