BÁO CÁO THỰC TẬP TẠI PHÒNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT THÀNH PHỐ ĐÀ NẮNG

Nhận thức được tầm quan trọng của việc làm quen với phòng thí nghiệm, thực hiệncác công việc nghiên cứu, và đặc biệt hơn là mong muốn tìm hiểu sâu hơn về Công nghệNuôi cấy mô và tế bào t

MỤC LỤC

MỤC LỤC 1

MỞ ĐẦU 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ĐƠN VỊ THỰC TẬP 4

1.1 Lịch sử, bộ phận chức năng của Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng 4

1.1.1 Lịch sử của Trung tâm 4

1.1.2 Các bộ phận chức năng của Trung tâm 4

1.2 Giới thiệu về Phòng công nghệ tế bào thực vật 4

1.2.1 Giới thiệu 4

1.2.2 Chức năng, nhiệm vụ Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật 5

1.3 Sơ đồ bố trí các phòng và các thiết bị 5

1.3.1 Sơ đồ bố trí các phòng 5

1.3.2 Sơ đồ bố trí thiết bị phòng hóa môi trường 5

1.4 Các trang thiết bị, dụng cụ và máy móc của phòng 6

1.4.1 Dụng cụ 6

1.4.2.1 Nồi hấp khử trùng 7

1.4.2.2 Tủ sấy 9

1.4.2.3 Máy đo pH 10

1.4.2.4 Máy khuấy từ 11

1.4.2.5 Cân kỹ thuật 11

1.4.2.6 Cân điện tử 12

1.4.2.7 Máy cất nước 13

1.4.2.8 Bếp gas 14

1.4.2.9 Buồng cấy vô trùng 14

1.4.2.9.1 Buồng cấy vô trùng 2 người AC – 312 15

1.4.2.9.2 Buồng cấy vô trùng 1 người AHC-4A1 15

1.4.2.10 Máy hút ẩm 16

1.4.2.11 Kính hiển vi OPTIKA 16

1.4.2.12 Hệ thống nuôi cấy bán ngập chìm Rita 16

1.4.2.13 Máy lắc 18

1.4.2.14 Bếp từ 18

Chương 2 : CÁC KỸ THUẬT TRONG PHÒNG NUÔI CẤY TẾ BÀO 20

2.1 Kỹ thuật pha môi trường 20

2.1.1 Hóa chất 20

Bảng 2.1 THÀNH PHẦN MUỐI KHOÁNG CƠ BẢN CỦA MÔI TRƯỜNG MS 21

2.1.2 Cách tiến hành 22

2.2 Vô trùng nơi thao tác cấy và tủ cấy vô trùng 24

2.3 Vô trùng mô nuôi cấy 25

2.4.Vô trùng dụng cụ thủy tinh, nút đậy 26

2.4.1 Dụng cụ thủy tinh 26

2.3.2 Nút đậy 26

Chương 3 :QUY TRÌNH TẠO CÂY CÚC TỪ 28

CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT 28

3.1 Kiến thức chung về công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật 28

3.1.1 Sơ lược các kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 29

3.1.1.1 Nuôi cấy phôi 29

3.1.1.2 Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời 29

3.1.1.3 Nuôi cấy mô phân sinh 30

3.1.1.4 Nuôi cấy bao phấn 30

3.1.1.5 Nuôi cấy tế bào đơn 31

3.1.1.6 Nuôi cấy protoplast 31

3.2 Giới thiệu chung về cúc 31

3.2.1 Lịch sử trồng trọt 31

3.2.2 Đặc điểm thực vật học 32

3.3 Qui trình tạo cây cúc hoàn chỉnh bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 33

3.3.2 Thuyết minh qui trình : 33

3.3.2.1Khử trùng mẫu 33

3.3.2.2.Vào mẫu 34

3.3.2.3 Nhân chồi 35

KẾT LUẬN 36

KIẾN NGHỊ 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 37

NHẬN XÉT CỦA CƠ QUAN THỰC TẬP 38

MỞ ĐẦU

Trên cơ sở những lý thuyết học được trên giảng đường, sinh viên rất cần có thêm

cơ hội tiếp xúc công việc trên thực tế, nhằm rèn luyện kỹ năng và tránh bỡ ngỡ khi ratrường, trong chương trình đào tạo dành cho chuyên nghành Công nghệ Sinh học tạitrường ĐHBK Đà Nẵng, sinh viên có nhiều đợt thực tập, thí nghệm, mà trong đó thựctập công nhân là một trong những kỳ thực tập khá quan trọng

Nhận thức được tầm quan trọng của việc làm quen với phòng thí nghiệm, thực hiệncác công việc nghiên cứu, và đặc biệt hơn là mong muốn tìm hiểu sâu hơn về Công nghệNuôi cấy mô và tế bào thực vật – hướng phát triển mũi nhọn của nghành CNSH, em lựa

chọn và được phân về thực tập ở “Phòng Công nghệ Tế bào thực vật” thuộc Trung Tâm

CNSH Thành Phố Đà Nẵng

Hơn một tháng thực tập tuy ngắn ngủi nhưng đã giúp em có cái nhìn chi tiết hơn vềnuôi cây mô và tế bào thực vật, củng cố chắc kiến thức mà em đã được học trên ghế nhàtrường

Em xin chân thành cảm ơn Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng, Phòng Côngnghệ Tế bào Thực vật đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện cho em được học hỏi và hoànthành tốt đợt thực tập này

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ĐƠN VỊ THỰC TẬP1.1 Lịch sử, bộ phận chức năng của Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng 1.1.1 Lịch sử của Trung tâm

Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng được tách ra từ Trung tâm Công nghệSinh học và Ứng dụng Khoa học Công nghệ Thành phố Đà Nẵng theo quyết định số8725/QD-UBND ngày 12 tháng 11 năm 2010, và chính thức thành lập vào ngày 1 tháng 1năm 2011

1.1.2 Các bộ phận chức năng của Trung tâm

+ Ban giám đốc

+ Phòng Tổng hợp Hành chính

+ Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật

+ Phòng Công nghệ Vi sinh

+ Trạm sản xuất và kinh doanh

1.2 Giới thiệu về Phòng công nghệ tế bào thực vật

1.2.1 Giới thiệu

Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học Hiện đang

ở khu dân cư Đông Phước, quận Cẩm Lệ

1.2.2 Chức năng, nhiệm vụ Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật

- Nghiên cứu và ứng dụng công nghệ tế bào thực vật nhằm sản xuất giống cây trồng

chất lượng cao phục vụ các vùng trồng trọt, các nhà vườn, hộ nông dân trên địa bàn thànhphố Đà Nẵng và các vùng lân cận

- Tham mưu cho Ban lãnh đạo Trung tâm trong sự phát triển ngành Công nghệ Tế

bào Thực vật phục vụ công tác bảo tồn và nhân nhanh các giống cây trồng, nguồn genthực vật quý, hiếm

- Đề xuất, nghiên cứu và triển khai các chương trình ứng dụng khoa học công nghệ,

các đề tài, dự án thuộc các cấp

- Thực hiện công tác đào tạo, chuyển giao công nghệ tế bào thực vật cho các cá

nhân, tổ chức có nhu cầu

Tủ đồdùngNơi vệ

Nồi hấpkhử trùng

Hình 1.2: Sơ đồ bố trí thiết bị phòng hóa môi trường

Hành lang

Phòng nuôi cây Phòng cấy vô

Bàn pha môitrường

1.4 Các trang thiết bị, dụng cụ và máy móc của phòng

1.4.1 Dụng cụ

Hình 1.3 Dụng cụ thí nghiệm

1.4.2 Trang thiết bị và máy móc

1.4.2.1 Nồi hấp khử trùng

- Thêm nước cất vào sao cho ngập thanh ngang của mâm

- Kiểm tra mức nước ở bình xả hơi, luôn đảm bảo ở mức LOW

- Cho giỏ hấp chứa môi trường,dụng cụ cần hấp vào nồi và đóng nắp

- Bấm START

- Nồi bắt đầu hoạt động ( chữ Heat nháy )

- Quá trình hấp kết thúc khi nhiệt độ hiển thị nhỏ hơn 97ºC, nhấn STOP

- Mở nắp và lấy giỏ hấp ra

1.4.2.2 Tủ sấy

* Model: OF-22G

* Xuất xứ: Jeiotech – Hàn Quốc

* Công dụng: dùng để sấy các thiết bị, dụng cụ nuôi cấy…

- Cài đặt thời gian

+ Ấn nút Time+ Ấn nút ↓↑ để chọn chế độ thời gian cài đặt và ấn nút □ để lưu giá trị thờigian cài đặt

- Ấn nút Start để bắt đầu hoạt động

- Ấn nút Stop để máy ngưng hoạt động trước khi mở cửa máy

* Chú ý: Trong quá trình sấy chú ý đến nhiệt độ vật dụng cần sấy, tránh xảy ra

- Tháo nắp đậy bảo quản điện cực pH

- Rửa đầu điện cực đo pH bằng nước cất, thấm khô bằng giấy mềm

- Nhúng điện cực đo pH và điện cực đo nhiệt độ vào dung dịch cần đo (ngập ít nhất

4 cm) và khấy đều

- Điều chỉnh pH bằng dung dịch HCl hoặc NaOH về giá trị cần đo

- Khi giá trị đo đã ổn định, đọc giá trị hiển thị trên màn hình

- Sau khi đo, rửa điện cực bằng nước cất, thấm khô điện cực bằng giấy mềm, đậynắp bảo quản lại

- Tắt nguồn

- Vệ sinh thiết bị sau khi sử dụng

* Chú ý: Nếu thiết bị yêu cầu hiệu chuẩn, phải hiệu chuẩn lại thiết bị cho kết quả

- Đặt môi trường lên máy

- Dùng cá từ đã được rửa sạch bằng nước cất bỏ vào môi trường

- Điều chỉnh tốc độ tại nút Mot

- Điều chỉnh nhiệt độ tại nút Temp

- Khuấy xong tắt nguồn, vớt cá từ ra rửa lại với nước cất

- Ấn nút O/T để điều chỉnh khối lượng ban đầu về 0

- Đưa mẫu vật cần đo vào vật đựng rồi đậy nắp hộp cân lại

- Cân xong tắt nguồn

- Vệ sinh bàn cân sau khi sử dụng

1.4.2.6 Cân điện tử

* Model: TE 612

* Xuất xứ: SARTORIUS – Germany

*Công dụng: Cân hóa chất

- Đặt vật đựng lên đĩa cân

- Ấn nút Tare để điều chỉnh khối lượng ban đầu về 0

- Đưa chất cần cân khối lượng vào vật đựng

- Cân xong tắt nguồn

- Vệ sinh cân sau khi sử dụng

1.4.2.7 Máy cất nước

* Model : DZ 5

* Xuất xứ: Trung Quốc

*Công dụng:Tạo ra nước cất từ nước thong thường

Hình 1.10 Máy cất nước

* Hướng dẫn sử dụng

- Mở nước cấp vào không quá 1/3 (ly từ đáy lên) Quan sát đến khi nước thoát ởđầu ra thành từng dòng liên tục khoảng 5 phút

- Bật công tắc điện chờ đến khi nước sôi

- Cho ống vào bình hứng để lấy nước cất

- Tắt máy khi cất nước xong

1.4.2.8 Bếp gas

* Model : GS – XU2006GEP

* Xuất xứ : GOLDSUN - Việt Nam

* Công dụng : dùng để nấu môi trường

Hình 1.11 Bếp gas

1.4.2.9 Buồng cấy vô trùng

1.4.2.9.1 Buồng cấy vô trùng 2 người AC – 312

* Model: AC – 312

* Xuất xứ: Trần Vũ Corp – Việt Nam

Hình 1.12 Buồng cấy vô trùng 2 người AC – 312

1.4.2.9.2 Buồng cấy vô trùng 1 người AHC-4A1

* Model : AHC- 4A1

* Xuất xứ : ESCO - Singapore

Hình 1.10 Buồng cấy vô trùng 1 người AHC-4A1

* Hướng dẫn sử dụng

- Vệ sinh lau chùi box trước khi làm việc

- Bật nguồn

- Bật đèn UV trong vòng 30 phút

- Tắt đèn UV và bật quạt gió ( nên chờ khoảng 30 phút sau khi tắt đèn mới bắt đầulàm việc)

- Bật đèn huỳnh quang bắt đầu làm việc

- Sau khi kết thúc quá trình làm việc, tắt đèn, quạt, nguồn

- Vệ sinh box sau khi làm việc xong

*Mục đích : Đây là phương pháp nuôi cấy mẫu trên môi trường lỏng nhằm giảm tỷ lệnhiễm bệnh, giảm chi phí giá thành, tăng hệ số nhân giống Trong hệ thống này mẫu sẽđược ngập trong môi trường lỏng ở một thời gian nhất định sau đó lấy ra rồi cứ theo 1chu kỳ chúng tiếp tục lặp lại

Pha 3: sự trao đổi khí trong hệ thống RITA

Pha 4: chu kỳ kết thúc, các van đóng lại và môi trường lỏng rút xuống ngăn bên dưới

Chương 2 : CÁC KỸ THUẬT TRONG PHÒNG

NUÔI CẤY TẾ BÀO2.1 Kỹ thuật pha môi trường

2.1.1 Hóa chất

* Thành phần môi trường dinh dưỡng

- Nước cất

- Chất hữu cơ

Đường- Acid amin- Vitamin (B1, B6, H, PP…)

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Auxin, Cytokinin,Gibberellin…)

- Chất vô cơ

Đa lượng N, P, K, Ca, Mg, S

Vi l ượng Fe, Zn, B ,Co ,N ,Mn, Cu ,Al ,Mo, I

- Các hợp chất không biết rõ thành phần

Nước dừa, nước khoai tây, nước chuối, casein, hydrolysalt, trypton, pepton…

Bảng 2.1 THÀNH PHẦN MUỐI KHOÁNG CƠ BẢN CỦA MÔI TRƯỜNG MS

Dung dịch stock Nồng độ

(mg/L)

Nồng độ trong dung dịch mẹ (g/200 mL)

Tiệt trùng môi trường

Cân agar

Đậy kín bình

* Tiến hành như sau:

Đong chính xác MS cơ bản (môi trường MS( MS I ÷ V)), Vitamine, chất điều hoàsinh trưởng, nước dừa (nếu có), đường vào bình đựng Định mức đến thể tích cần phabằng nước cất, sau đó chuẩn độ đến pH 5.8 (môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật) Môitrường đã được chuẩn pH, bổ sung Agar và than hoạt tính (nếu có) rồi đem đun đến khisôi (trong quá trình đun phải khuấy đều để không bị cháy agar và cho agar phân tán đềutrong môi trường) Sau đó chia môi trường vào các dụng cụ chứa môi trường, đậy kínbình bằng cách dùng nút bông kèm nắp giấy hoặc dùng nắp nilon cột dây thun cột chặtmiệng bình

Ở cách pha thứ hai, khi pha môi trường bỏ qua công đoạn nấu môi trường CânAgar và chia đều vào trong các bình Đổ môi trường đã được chuẩn pH vào các bình cóchứa agar Sau đó đậy kín bình

Các bình đã được đậy kín cho vào tiệt trùng ở 121oC trong 20 phút

Ngoài các dụng cụ chứa môi trường bằng thủy tinh chúng ta có thể sử dụng các túinilon để đựng môi trường Các túi nilon và kẹp phải được thanh trùng và đưa vào tủ cấy

đã vô trùng Thao tác đổ môi trường vào túi nilon được tiến hành trong box cấy vô trùnggiống như đối với vi sinh.

Đối với môi trường có chứa than hoạt tính, sau khi hấp xong Trước khi đặt lên kệphải lắc vài vòng cho than hoạt tính không lắng xuống đáy

2.2 Vô trùng nơi thao tác cấy và tủ cấy vô trùng

Nguồn nhiễm tạp quan trọng và thường xuyên nhất là bụi rơi vào dụng cụ thủytinh chứa môi trường trong khi mở nắp hoặc nút bông để thao tác cấy Người ta áp dụngnhiều biện pháp khác nhau để chống lại nguồn nhiễm tạp này

Buồng cấy thường là buồng có diện tích hẹp, rộng từ 10-15 m2, có hai lớp cửa đểtránh không khí chuyển động từ bên ngoài trực tiếp đưa bụi vào Sàn và tường lát gạchmen để có thể lau chùi thường xuyên Trước khi đưa vào sử dụng, buồng cấy cần được xử

lý hơi formol bằng cách rót formaldehyde (formalin) 4% ra một số nắp đĩa petri để rải rácvài nơi trong phòng cho bốc hơi tự do Đóng kín cửa phòng cấy trong 24 giờ, sau đó bỏformaldehyde đi và khử hơi formaldehyde thừa bằng dung dịch NH3 25% cũng trong 24giờ Mặt bàn cấy, trước khi làm việc phải lau mặt bàn bằng cồn 90%

Các dụng cụ mang vào buồng cấy đều vô trùng trước: từ áo choàng, mũ vải, khẩutrang của người cấy, đến dao, kéo, forceps, giấy lọc, bình đựng nước cất Trên bàn cấythường xuyên có một đèn cồn (hoặc đèn gas) để sử dụng trong khi cấy và một cốc đựngcồn 90% để nhúng các dụng cụ làm việc

Trước khi cấy, kỹ thuật viên cần rửa tay bằng xà phòng và lau kỹ đến khuỷu taybằng cồn 90% Để đảm bảo mức độ vô trùng cao trong phòng cấy cần có một đèn tửngoại 40W treo trên trần Chỉ cho đèn này làm việc khi không có người trong phòng cấy.Nên bật đèn tử ngoại 30 phút trước khi cấy Cần giảm sự chuyển động của không khítrong buồng cấy đến mức tối thiểu, vì vậy tất cả các dụng cụ phục vụ việc cấy đều phảichuẩn bị đầy đủ để trong khi cấy tránh đi lại, ra vào buồng cấy nhiều lần

2.3 Vô trùng mô nuôi cấy

Mô nuôi cấy có thể là hầu hết các bộ phận khác nhau của thực vật như: hạt giống,phôi, noãn sào, đế hoa, lá, đỉnh sinh trưởng, đầu rễ, thân củ Tùy theo sự tiếp xúc vớiđiều kiện môi trường bên ngoài, các bộ phận này chứa ít hay nhiều vi khuẩn và nấm Hầu

như không thể vô trùng mô nuôi cấy được nếu nấm khuẩn nằm sâu ở các tế bào bên trongchứ không hạn chế ở bề mặt.

Phương thức vô trùng mô nuôi cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các hóa chất

có hoạt tính diệt nấm khuẩn Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thờigian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẻ ngách lồi lõm trên bềmặt mô nuôi cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô nuôi cấy

Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông thườngngười ta xử lý mô nuôi cấy trong vòng 30 giây trong cồn 70% sau đó mới xử lý trongdung dịch diệt khuẩn

Các chất kháng sinh trên thực tế ít được sử dụng vì tác dụng không triệt để và cóảnh hưởng xấu ngay lên sự sinh trưởng của mô cấy

Trong thời gian xử lý, mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn Đốivới các bộ phận thực vật có nhiều bụi đất, trước khi xử lý nên rửa kỹ bằng xà phòng dướidòng nước chảy Khi xử lý xong, mô cấy được rửa nhiều lần bằng nước cất vô trùng (3-5lần) Những phần trên mô cấy bị tác nhân vô trùng làm cho trắng ra cần phải cắt bỏ trướckhi đặt mô cấy lên môi trường Để tránh ảnh hưởng trực tiếp của các tác nhân vô trùng lên

mô cấy, nên chú ý để lại một lớp bọc ngoài khi ngâm mô vào dung dịch diệt khuẩn Lớpcuối cùng này sẽ được cắt bỏ hoặc bóc đi trước khi đặt mô cấy lên môi trường

Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên Tuy vậy,nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử, chắcchắn sẽ đạt kết quả

STT Tác nhân vô trùng Nồng độ Thời gian xử lý

6 Kháng sinh 4-50 mg/L 30-60 Khá

Bảng 2.1 Nồng độ và thời gian sử dụng một số chất diệt khuẩn

để xử lý mô cấy thực vật

2.4.Vô trùng dụng cụ thủy tinh, nút đậy

2.4.1 Dụng cụ thủy tinh

Dụng cụ thủy tinh dùng cho nuôi cấy mô và tế bào thực vật phải là loại thủy tinhtrong suốt để ánh sáng qua được ở mức tối đa và trung tính để tránh kiềm từ thủy tinh gâyảnh hưởng đến sự phát triển của mô nuôi cấy

Cần rửa sạch dụng cụ thủy tinh trước khi đưa vào sử dụng Thông thường, chỉ cần

xử lý dụng cụ thủy tinh bằng sulfochromate một lần đầu khi đưa vào sử dụng, về sau chỉcần rửa sạch bằng xà phòng, tráng sạch bằng nước máy nhiều lần và cuối cùng tráng bằngnước cất Sau khi để ráo nước, dụng cụ thủy tinh (trừ các loại dùng để do thể tích) cầnđược vô trùng khô bằng cách sấy ở 60-70oC/2 giờ Sau khi nguội được lấy ra cất vào chỗ

ít bụi

2.3.2 Nút đậy

Thường dùng nhất là các nút đậy làm bằng bông không thấm nước Nút phải tươngđối chặt để đảm bảo bụi không đi qua được, đồng thời nước từ môi trường không bị bốchơi quá dễ dàng trong quá trình nuôi cấy Bông không thấm nước là loại nút đơn giảnnhất, nhưng có các nhược điểm sau:

+ Nếu khi hấp nút bông bị ướt hoặc dính môi trường thì về sau sẽ bị nhiễm nấm,nhất là ở các thí nghiệm nuôi cấy trong thời gian dài

+ Thao tác làm nút bông chậm, không thuận tiện khi nuôi cấy trên quy mô lớn.+ Chỉ dùng được một vài lần, sau phải bỏ

Hiện nay, người ta sử dụng nhiều loại nắp đậy khác thay thế nút bông Cáchãng sản xuất dụng cụ nuôi cấy mô cung cấp loại nắp ống nghiệm và bình tam giác bằngnhựa chịu nhiệt có thể hấp vô trùng ở nhiệt độ 121oC (khoảng 1 atm) mà không bị biếndạng Một số phòng thí nghiệm dùng nắp ống nghiệm inox hoặc cao su rất thuận tiện choviệc vô trùng khô hoặc ướt Cũng có thể sử dụng giấy nhôm hoặc nilon chịu nhiệt để làm