Đồ án công nghệ 2 ỨNG DỤNG PCR words

Phụ lụcPhần 1 Giới thiệu về phương pháp PCR1.1Khái niệm21.2 Lịch sử phát triển21.3Nguyên tắc phương pháp PCR51.4Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR91.5Giải pháp tối ưu hóa cho phản ứng PCR111.6Ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật PCR131.7Ứng dụng của PCR15Phần 2 Ứng dụng của PCR trong kỹ thuật DGGE2.1Khái niệm DGGE162.2Ứng dụng của kỹ thuật DGGE16Phần 3 Ứng dụng3.1 Ứng dụng 1: Nghiên cứu khả năng phân hủy dioxin và phân loại gen mã hóa dioxin dioxingienaza của hỗn hợp chủng vi khuẩn kị khí không bắt buộc SETDN20 từ đất nhiễm độc hóa học tại Đà Nẵng173.2 Ứng dụng 2: Xác định cấu trúc và sự đa dạng của tập đoàn vi khuẩn khử sunfate trong mẫu bùn hồ khu vực nhiễm chất diệt cỏ dioxin tại sân bay Đà Nẵng bằng kỹ thuật PCRDGGE26

1.2 Lịch sử phát triển

1.2.1 Lịch sử ra đời phương pháp PCR

Phương pháp căn bản chạy PCR được Kary Mullis và cộng sự phát minh năm

1985, ông đã đoạt giải Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này

Ý kiến của Mullis là phát triển một quy trình mà DNA có thể nhân lên nhiều lầnmột cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA polymerase DNApolymerase có tự nhiên trong sinh vật sống, nơi mà nó thực hiện chức năng nhân DNAkhi tế bào phân chia Nó làm việc bằng cách nối với sợi DNA và tạo sợi bổ sung Theoquy trình PCR gốc của Mullis, enzyme phản ứng nhân bản DNA được thực hiện trongống nghiệm (in vitro) Sợi DNA đôi bị tách thành 2 sợi đơn khi đun nóng ở 96°C Tuynhiên, ở nhiệt độ này DNA polymerase bị phá hủy vì vậy cần bổ sung enzyme sau mỗigiai đoạn nung nóng của mỗi chu kỳ Quy trình PCR gốc của Mullis không có hiệu quảcao vì nó mất nhiều thời gian, cần một lượng lớn DNA polymerase, và phải liên tục lưu

ý suốt trong quá trình PCR

Sau đó, quy trình gốc này được phát triển bằng cách dùng DNA-Polymerase lấy từ

vi khuẩn thermophilic (ưa nhiệt) sống trong mạch nước phun ở nhiệt độ trên 110°C.DNA polymerase từ sinh vật này là thermostable (ổn định ở nhiệt độ cao) và khi dùngtrong PCR nó không bị phá vỡ khi hỗn hợp được nung nóng để tách sợi DNA Từ đó,không cần phải thêm DNA-polymerase vào mỗi chu kỳ, quá trình sao chép DNA có thểđơn giản và tự động hơn

Một trong những DNA-polymerase chịu nhiệt đầu tiên được phân lập được từThermus aquaticus và được gọi là Taq Taq polymerase được dùng rộng rãi trong thựcnghiệm PCR (5/2004) Nhược điểm của Taq là thỉnh thoảng nó nhầm lẫn trong quátrình sao chép DNA, dẫn đến đột biến (sai) trong chuỗi DNA, vì nó thiếu tính sửa saiexonuclease 3’-5’ Các polymerase như Pwo hay Pfu, được phân lập từ Archaea có cơchế sửa sai (cơ chế kiểm tra lỗi sai) và có thể làm giảm một cách đáng kể số đột biếnxảy ra trong chuỗi DNA được sao chép Ngày nay, sự kết hợp giữa Taq và Pfu có thể

cung cấp cả độ tin cậy cao lẫn sự nhân bản chính xác của DNA.

PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một phần

Đó có thể là một gen đơn, hay một phần của gen Trái với sinh vật sống, quy trình PCR

có thể copy một mảnh DNA ngắn, có thể lên đến 10kb (kb = kilo cặp base=1000 cặpbase) DNA là một sợi đôi, và vì vậy nó được đo với DNA bổ sung … gọi là cặp base.Một vài phương pháp có thể copy một mảnh kích thuớc lên đến 40kb ít hơn nhiều sovới nhiễm sắc thể DNA trong tế bào eukaryote – ví dụ như tế bào người chứa hơn 3 tỉcặp base

Phản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt Đây là máy đun nóng và làmnguội trong ống phản ứng ở nhiệt độ chính xác cho mỗi phản ứng Để ngăn ngừa sựbay hơi của hỗn hợp phản ứng, phần nắp đậy của máy PCR cũng được đun nóng,trường hợp lượng dung dịch phản ứng quá ít, người ta cho một lớp dầu (natural oil) lêntrên bề mặt hỗn hợp phản ứng

1.2.2 Hai bước tiến quan trọng đã đưa PCR đến cuộc đại cách mạng sinh học phân tử

a, Sự phát hiện ra các men polymerase chịu nhiệt độ

Chính việc phát hiện được các men polymerase chịu nhiệt là bước tiến đầu tiên đãlàm thử nghiệm PCR trở nên đơn giản hơn Chúng ta thử tưởng tượng nếu không cómen polymerase chịu nhiệt thì thử nghiệm PCR sẽ phức tạp và kém hiệu quả như thếnào khi mà cứ sau mỗi chu kỳ nhiệt lại phải thêm men polymerase mới vào vì men cũ

đã bị hủy bởi nhiệt độ trong chu kỳ nhiệt trước đó? Cũng nhờ sự sử dụng các menpolymerase chịu nhiệt mà giai đoạn bắt cặp của đoạn mồi vào nucleic acid đích đượcđặc hiệu hơn vì được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn, do đó phản ứng PCR trở nên đặc

hiệu hơn Cho đến nay, đã có hàng chục loại polymerase chịu nhiệt đã được phát hiện

và tổng hợp ra Có những men polymerase trích từ các vi khuẩn chịu nhiệt nhưThermus aquaticus (Taq polymerase), Thermus thermophilus (rTth), Thermus lithoralis(Vent), Pyrococcus furiosus (Pfu), Có những men polymerase chịu nhiệt được tổnghợp từ các vi khuẩn không chịu nhiệt nhưng mang gen tái tổ hợp từ các vi khuẩn chịunhiệt như Ampli Taq, Vent (exo), Có những men polymerase chịu nhiệt có hoạt tínhsửa sai (proofreading) khi tổng hợp chuỗi nucleic acid bổ sung (3’-5’exonuclease) nhưUltima, Vent, Deep Vent, Pfu, Nhờ vậy mà người dùng có rất nhiều chọn lựa để sửdụng cho đúng mục đích của mình

Thermus aquaticus Thermus thermophiles

b, Máy chu kỳ nhiệt

Máy PCR

Trước đây, khi chưa có máy chu kỳ nhiệt, thử nghiệm PCR được thực hiện bằngcách liên tục chuyển các ống nghiệm phản ứng PCR vào các máy cách thủy có nhiệt độkhác nhau để tạo ra được các chu kỳ nhiệt cho phản ứng Sau đó công việc bằng taynhàm chán và nặng nhọc này được thay thế bằng các robot tương đối cồng kềnh và đắttiền Ngày nay, thử nghiệm PCR được thực hiện trong các buồng ủ PCR của máy chu

kỳ nhiệt, còn gọi là máy luân nhiệt Một cách tổng quát, máy luân nhiệt gồm các bộphận chính như sau:

• Một bàn phím đơn giản để lập các chương trình chu kỳ nhiệt và ra các mệnhlệnh để máy thực hiện

• Một bộ vi xử lý để ghi nhớ các chương trình đã nạp vào máy, thực hiện cácmệnh lệnh đến buồng ủ PCR, cũng như ghi nhận cách thay đổi nhiệt độ buồng ủPCR trong các chu kỳ nhiệt để điều chỉnh cho đúng với chương trình đang đượcthực hiện

• Buồng ủ PCR là nơi mà các chu kỳ nhiệt được thực hiện qua sự điều khiển của

bộ vi xử lý Trong các chu kỳ nhiệt, nhiệt độ trong buồng ủ PCR có thể đưa lên

cao hay hạ xuống thấp trong một thời gian rất ngắn

Ðể làm thay đổi được nhiệt độ trong buồng ủ PCR, có hai phương pháp:

1 Liên tục thổi lên buồng ủ những luồng khí nóng sinh ra từ một đèn phát nhiệt,hay luồng khí lạnh sinh ra từ một dàn lạnh của máy làm lạch Với phương phápnày, máy luân nhiệt hãy còn tương đối cồng kềnh, khá đắt tiền và khi máy hoạtđộng âm thanh cũng khá ồn ào

2 Phương pháp thứ hai hoạt động dựa theo hiệu quả Peltier ngược Hiệu quảPeltier là nguyên tắc của các máy đo nhiệt độ điện tử: Khi áp hai mảnh kim loạivào nhau và khi có sự cách biệt nhiệt độ giữa hai mãnh kim loại thì sẽ sinh ramột dòng điện và chính sự lưu thông của dòng điện này khi đo lường ra sẽ phảnánh sự cách biệt nhiệt độ giữa hai mãnh kim loại Hiệu quả Peltier ngược lại vậnhành theo kiểu ngược lại, nghĩa là khi tạo ra một dòng điện giữa hai mãnh kimloại thì sẽ tạo ra được một sự cách biệt nhiệt độ giữa hai mãnh: bên này nóng,bên kia lạnh Khi thay đổi chiều dòng điện thì nhiệt độ của hai mãnh cũng thayđổi ngược lại: bên này lạnh, bên kia nóng Các máy chu kỳ nhiệt hiện nay đềuđược chế tạo dựa theo phương pháp thứ hai này, nhờ vậy mà máy trở nên rấtgọn nhẹ, giá thành rẽ hơn gấp nhiều lần so với trước đây

1.3 Nguyên tắc phương pháp PCR

Kỹ thuật tổng hợp DNA ngoài cơ thể cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản củasao chép DNA trong cơ thể như: Đoạn DNA cần nhân bản phải mở xoắn thành 2 mạchđơn, cần có các cặp mồi (mồi xuôi, mồi ngược), cần nguyên liệu, điều kiện môi trườngthích hợp và enzym DNA polymerase Tuy nhiên kỹ thuật PCR có khác là dùng nhiệt

độ cao (94oC) tháo xoắn thay cho helicase kết hợp với enzym DNA polymerase chịunhiệt và hệ thống điều nhiệt cho từng giai đoạn phản ứng tổng hợp cùng với các đoạnmồi được thiết kế chủ động Nhờ kỹ thuật PCR mà với một lượng nhỏ DNA ban đầu

chúng ta có thể thu được đủ lượng DNA cần thiết để tiến hành các thí nghiệm vềDNA

Một phản ứng PCR là một chuỗi phản ứng gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu

kỳ gồm ba giai đoạn: Giai đoạn biến tính, giai đoạn bắt cặp và giai đoạn kéo dài chuỗi

Giai đoạn biến tính (denaturation): Tách chuỗi ADN từ mạch đôi thành dạng mạch

đơn

Phân tử DNA sợi đôi được hình thành bởi mối liên kết hydro giữa hai mạch đơn Trongquá trình biến tính, nhiệt độ phản ứng gia tăng lên nhanh chóng đến 95oC và giữ ởnhiệt độ này trong khoảng 15-50 giây Ở nhiệt độ này mối liên kết hydro giữa hai mạch

đơn của phân tử DNA sợi đơi bị phá vỡ Trong giai đoạn bắt cặp tiếp theo, nhiệt độphản ứng giảm nhanh chĩng làm cho mối liên kết hydro ban đầu khơng hình thành lạiđược kết quả làm tạo thành hai phân tử DNA mạch đơn.

Tuy nhiên, việc tăng nhiệt độ đột ngột hoặc thời gian biến tính kéo dài cĩ thể làm giảm hoạttính của enzyme DNA polymerase Đối với những enzyme DNA polymerase được sử dụngtrong phản ứng PCR, nhiệt đơ ở giai đoạn biến tính thường từ 950C đến 980C Về thời gianbiến tính, đối với các genome lớn như thực vật thường giai đoạn biến tính được kéo dài trong

5 phút Ngồi ra, sau khi đã tối ưu phản ứng PCR, để giảm sự ảnh hướng của nhiệt độ và thờigian biến tính đối với sự hoạt động của enzyme DNA polymerase, enzyme này cĩ thể được bổsung sau khi kết thúc giai đoạn biến tính ban đầu Đối với mỗi hệ thống luân nhiệt của cáchang sản xuất khác nhau, tốc độ gia nhiệt và chế độ điều khiển nhiệt độ là khác nhau

Giai đoạn bắt cặp (anealation): Gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung.

Trong giai đoạn bắt cặp, nhiệt độ lai thường duy trì khoảng 50- 600C, trong thờigian 15-60 giây Quá trình này giúp cho các mồi (primer) tìm kiếm và bắt cặp bổ sungđặc hiệu với trình tự đích (DNA hoặc cDNA) tại vị trí mong muốn Nhiệt độ bắt cặpphụ thuộc vào số lượng G, C cĩ trong mồi (primer)

Đối với primer dài hơn 22 nucleotide, nhiệt độ bắt mồi thường hoạt động ở Tm thấpnhất + 3°C Đối với primer nhỏ hơn 22 nucleotide, nhiệt độ bắt mồi thường thấp hơn

Tm thấp nhất, cĩ thể dùng grandient nhiệt độ (touchdown PCR) để tìm nhiệt độ bắtmồi tối ưu (khoảng cách nhiệt ở mỗi chu kỳ thường là 0.5°C) Đối với các cặp Tm caohoặc tự bắt cặp, cĩ loop thì cĩ thể khắc phục bằng PCR 2 bước (95°C và 68°C)

Giai đoạn kéo dài chuỗi (elongation): Tổng hợp chuỗi DNA mới giống chuỗi DNA

gốc

Sau khi mồi (primer) tìm kiếm và bắt cặp bổ sung với trình tự đích, nhiệt độ của phảnứng lại nhanh chĩng chuyển về nhiệt độ thích hợp với hoạt động của enzyme DNApolymerase thường là 720C và giữ ở nhiệt độ này 30 giây đến 2 phút tùy theo chiều dàicủa đoạn DNA đích cần tổng hợp Trong quá trình tổng hợp DNA polymerase sẽ lấynucleotide (A, T, G, C) từ mơi trường phản ứng để gắn vào đầu 3’ của mồi (primer)theo nguyên tắc bổ sung với trình tự trên phân tử DNA hoặc cDNA đích Năng lượngdùng trong quá trình gắn kết này là ATP cũng cĩ trong mơi trường phản ứng Kết quảquá trình này phản ứng PCR đã tạo ra hai phân tử DNA mạch đơi mới từ một phân tửDNA mạch đơi ban đầu

Nhiệt độ kéo dài thường tiến hành ở 72°C tuy nhiên, hoạt tính 5'-3' DNA polymerase vẫnxảy ra ở nhiệt độ 68°C Thời gian kéo dài phụ thuộc hoạt độ enzyme DNA polymerase, chiềudài sản phẩm và loại template 1) Đối với DNA đồng nhất (plasmid, lambda hoặc BAC DNA)thì tốc độ cĩ thể đạt tới 15s/kb; 2) đối với DNA genome lớn, phức tạp thì tốc độ thường 30s-1min/kb Như vậy sau nhiều chu kỳ khuyếch đại (thường từ 30-40 chu kỳ) từ một phân tử đíchban đầu phản ứng PCR đã tạo ra vơ số phân tử bản sao (khoảng 106 bản sao) cĩ kích thước

xác định mong muốn.Cuối cùng sản phẩm PCR được nhuộm với Ehididum bromide và đemquan sát sự phát quang dưới tia UV (bước sóng 312 nm) sau khi phân tách sản phẩm PCR trêngel.

Sơ đồ tổng hợp nguyên tắc của phương pháp PCR

1.4 Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR

1.4.1 Mồi

Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại đặc trưng và có hiệuquả cao Việc lựa chọn mồi tuân theo các quy tắc đơn giản sau: chiều dài mồi khoảng 18 -24bp hoặc hơn và phần trăm GC chiếm 35%-60%, do vậy, nhiệt độ gắn mồi vào khoảng55-580C hoặc cao hơn Những mồi dài hơn (mồi DMD, 28-30bp) cho phép phản ứng đượcthực hiện ở nhiệt độ gắn mồi cao hơn và thu được ít sản phẩm không đặc hiệu hơn Đểkiểm tra các trình tự có khả năng lặp lại, các mồi sử dụng đã được đối chiếu với cơ sở dữliệu trình tự tại Trung tâm quốc gia về thông tin công nghệ sinh học (National Center forBiotechnology Information - NCBI) sử dụng các công cụ tìm kiếm (Basic LocalAlignment Search Tool - BLAST)

1.4.2 DNA mẫu

Kết quả phản ứng PCR lệ thuộc rất lớn vào DNA mẫu

• Phản ứng PCR tối ưu khi DNA thật tinh sạch Bụi bẩn sẽ làm giảm đáng kể hiệusuất của phản ứng Tuy nhiên nhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kếtquả đối với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào hoặc ngay cả mẫu DNAkhông được bảo quản tốt

dụng cũng có khuynh hướng giảm (1µg xuống còn 100ng) khi sử dụng cácDNA polymerase cho hiệu quả cao Việc giảm lượng mẫu còn hạn chế được sựkhuếch đại ký sinh tạo những sản phẩm phụ không mong muốn

1.4.3 Enzyme

Enzyme được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I Ðây làenzyme không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp Hiện nay, một sốenzyme mới có hiệu quả hơn

DNA polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ một vi khuẩn hiện diện trong suốinước nóng, Thermus aquaticus Enzyme này được viết tắt Taq polymerase

Tth polymerase tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt động như mộtenzyme phiên mã ngược khi có mặt RNA khuôn và ion Mn2+; ngược lại, khi khuôn làDNA và có ion Mg2+, enzyme này lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA

Nồng độ enzyme được khuyến cáo là 1- 2,5 đv/1µl Nồng độ phản ứng quá caohoặc quá thấp đều khiến phản ứng không đạt kết quả tốt

Tính chính xác của enzyme DNA polymerase phụ thuộc vào hoạt tính 3´-5

´exonuclease Tùy thuộc mục đích thí nghiệm mà cần lựa chọn loại DNA polymerase

co hay không có hoạt tính

hoạt động của Taq polymerase bị ức chế

• Nồng độ Mg2+ quá thừa làm ổn định sự bắt cặp sai của mồi với khuôn, dẫn đếnnhiều sản phẩm không đặc hiệu

• Nồng độ tối ưu của Mg2+ phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thửnghiệm

• Đối với từng genome lớn như thực vật thường sử dụng bước biến tính dài đến5min Để làm giảm ảnh hưởng đối với enzyme thì có thể bổ sung enzyme DNApolymerase sau khi biến tính ban đầu.

• Khi đã tối ưu phản ứng PCR thì cần giảm tối thiểu thời gian biến tính mỗi chu

kỳ để tăng lượng sản phẩm Thông thường là từ 10s-30s

• Tốc độ gia nhiệt và chế độ điều khiển nhiệt độ ở mỗi hệ thống luân nhiệt là khácnhau phụ thuộc hãng sản xuất Một số hệ thống cho phép thay đổi thông số nàykhi PCR tối ưu

1.5 Giải pháp tối ưu hóa cho phản ứng PCR

Do PCR rất nhạy, nên phải tránh ô nhiễm các DNA khác có trong phòng thínghiệm (vi khuẩn, virus, DNA , ) Vì vậy các mẫu DNA, hỗn hợp phản ứng và quytrình DNA, ngoài ra còn có phản ứng phân tích sản phẩm, nên được thực hiện trongmột khu vực riêng biệt Ở giai đoạn chuẩn bị hỗn hợp phản ứng, phải chuẩn bị phòngriêng biệt với đèn UV Phải sử dụng găng tay sạch cho mỗi bước PCR cũng như thaythế các pipet Thuốc thử dùng trong PCR phải được chuẩn bị riêng biệt và chỉ đượcdùng cho mục đích này Các mẫu phải được giữ riêng biệt với các mẫu DNA khác.Phản ứng có kiểm soát (kiểm soát bên trong), ngoại trừ DNA khuôn mẫu, phải luônđược htực hiện, để kiểm tra sự nhiễm bẩn

Các giải pháp cụ thể:

Không có sản phẩm hoặc lượng sản phẩm quá thấp:

1 Lặp lại thí nghiệm đề phòng lỗi thao tác.

2 Sử dụng ống dNTP mới, có chất lượng đảm bảo

3 Tăng lượng DNA template, điện di kiểm tra lại nồng độ DNA template

4 Tinh sạch DNA template bằng chiết phenol, tủa cồn hoặc kit tinh sạch hoặc thôigel Nếu có thể cần tiến hành tách chiết mới DNA template bằng các phươngpháp tách chiết khác nhau

5 Tăng thời gian kéo dài đối với các sản phẩm PCR trên 0,5 kb

6 Tăng số chu kỳ PCR lên 35, 40

7 Hạ thấp nhiệt độ bắt mồi xuống 1 đến 2°C Hoặc sử dụng touchdown PCR

8 Dùng PCR đánh bắt với nhiệt độ bắt mồi khá thấp (~45°C) trong 10 chu kỳ đầu

và nâng cao nhiệt độ đến Tm thấp nhất ở 20 chu kỳ tiếp theo

9 Tăng nhiệt độ biến tính (tối đa 98°C) và điều chỉnh thời gian biến tính DNA đốivới các mẫu DNA của genome lớn hoặc khi khuyếch đại các đoạn lặp SSR

10 Kiểm tra các điều kiện của primer, thiết kế cặp primer mới để chạy nestPCR

11 Tăng nồng độ enzyme DNA polymerase

12 Thay đổi loại enzyme DNA polymerase và hệ buffer

Vệt smear kích thước lớn hơn sản phẩm mong muốn:

1 Giảm nồng độ enzyme DNA polymerase

2 Rút ngắn thời gian kéo dài

3 Giảm số chu kỳ nhiệt PCR xuống tối đa 25

4 Tăng nhiệt độ bắt mồi lên 2°C hoặc thử với PCR 2 giai đoạn hoặc nestPCR

5 Thay đổi nhiệt độ biến tính

6 Thử chạy gradien nồng độ Mg2+

7 Hạ thấp nồng độ primer

8 Đối với trường hợp vệt smear thấp hơn băng mong muốn thường được tối ưubằng cách tăng thời gian kéo dài cuối cùng ở 72°C từ 8 đến 10 min

Băng sản phẩm phụ rõ nét với kích thước thấp hơn sản phẩm mong muốn:

1 Tăng nhiệt độ bắt mồi 2°C và/hoặc tăng thời gian bắt mồi

2 Tăng thời gian kéo dài thêm 30s

3 Giảm nồng độ DNA polymerase

4 Tối ưu hóa nồng độ Mg2+

5 Tinh sạch DNA template bằng thôi gel Hoặc thủy phân DNA bằng một số REtrước khi dùng làm template (hiệu quả khi băng sản phẩm phụ kích thước khálớn >= 1kb)

6 Giảm nồng độ primer

7 Thiết kế cặp primer mới

1.6 Ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật PCR

1.6.1 Ưu điểm

• Thời gian thực hiện cực nhanh: chỉ cần mất 3h để khuếch đại một trình tự ANDđược quan tâm, so với phương pháp tao dòng của kỹ thuật tái tổ hợp AND phảimất cả tuần hoặc lâu hơn

• Đơn giản và ít tốn kém: nó được thực hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ gồmcác thành phần tối thiểu được sử dụng đồng thời Trong khi đó phương pháp tạodòng điển hình cần các vật liệu đắt tiền như: màng, nucleotide triphosphatemang dấu phóng xạ và việc thực hiện cần các thao tác đặc biệt

acid thô Ví dụ: mẫu này hay các dấu vết phân tích trong pháp y

• Điều nay ngược với kĩ thuật tái tổ hợp ADN, đoạn gen hay vector đều cần tươngđối tinh khiết

• PCR có thể giúp phân biệt được gen đột biến do mất đoạn, thêm đọa hay độtbiến điểm

• Dùng để định lượng so sánh bằng cách cho tiến hành khuếch đại đòng thời trình

tự đích và một trình tự chứng có nồng độ đã biết

1.6.2 Hạn chế

Do độ nhạy rất cao nên PCR vừa rất đơn giản, có khuynh hướng sử dụng rộng rãinhưng cũng gặp không ít khó khăn

a Trong thực nghiệm, trình tự của khích thước cần khuếch đại là giới hạn đầu tiên

Trừ một vài trường hợp đặc biệt, PCR không hoạt động được với những phân tửDNA có kích thước lớn hơn 3kb PCR cho kết quả tốt nhất ở ADN với kích thước dưới1,5kb

b Sự ngoại nhiễm

• Vấn đề cấp thiết trong ứng dụng chẩn đoán, dự phòng vì có thể kết quả rấtnghiêm trọng Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất là các sản phẩm khuếch đại củanhững lần thao tác trước

khuếch đại trong một khoảng không gian kín như phòng thí nghiệm sẽ khiếncho các phân tử đã được khuếch đại thoát ra ngoài và bay lơ lửng trong khôngkhí và bám vào tường, cửa, các thiết bị, dụng cụ thí nghiệm,…rồi nhiễm vào cácphản ứng tiến hành sau đó

c Các sai sót gây ra do Taq polymerase

Các sao chép bởi Taq polymerase có tỷ lệ khá cao (10-4 nghĩa là cứ 10.000 Nu thìenzyme gắn sai một Nu) Đặc tính này không nghiêm trọng nếu ta chỉ cần xem xét kíchthước hay chỉ cần xem sự có mặt của một sản phẩm khuếch đại, nhưng có ý nghĩa lớnnếu cần xác định chính xác trình tự Nucleotide của ADN Ta không thể loại bỏ hoàntoàn sai sót này nhưng có thể giảm bớt (ví dụ như: dùng DNA polymerase có tính chịunhiệt cao: pfu, )

d Mật độ sự hiện diện của vi sinh vật trong mẫu thực phẩm thường thấp, nên đa sốtrường hợp cần có bước nuôi cấy làm giàu để có được mật đọ vi vinh vật đủ cho việcphát hiện PCR

e Phương pháp này không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết, do vậy có thể dẫnđến trường hợp dương tính giả do DNA từ tế bào chết

f Chi phí cho việc phát hiện các vi sinh vật đơn lẻ trong thực phẩm thường tốn kém

Do vậy để giảm chi phí người ta thường sử dụng nhiều cặp mồi trong một phản ứngPCR (gọi là phản ứng Multiplex PCR) để có thể phát hiện đồng thời nhiều vi sinh vậtkhác nhau

1.7 Ứng dụng của PCR

• Sử dụng PCR để tạo nhanh các gen tổng hợp

• Gây đột biến điểm

• Xác định kiểu gen của các đột biến

• So sánh mức độ biểu hiện của gen

• Vân tay di truyền

• Kiểm tra huyết thống

• Ưng dụng trong chẩn đoán lâm sàng

PHẦN 2 ỨNG DỤNG CỦA PCR TRONG KỸ THUẬT DGGE

1.Khái niệm DGGE

Kỹ thuật điện di biến tính gradient trên gel (denaturing gradient gelelectrophoresis, DGGE) một dạng kỹ thuật ”dấu vân tay” (fingerprinting) phân tử chophép phân biệt các trình tự DNA khác nhau dựa trên sự khác nhau về tỷ lệ (G+C)/(A+T) giữa các trình tự Khi được điện di trên một gel có građien chất biến tính, tùy

theo thành phần nucleotit mà một phân tử DNA sẽ dừng lại ở một vị trí nhất định đặctrưng: trong phân tử càng nhiều G và C thì phân tử càng lâu bị biến tính và do đó cànglâu dừng lại trên gel điện di Vì vậy, vị trí khác nhau trên điện di đồ DGGE phản ánh

sự khác nhau về trình tự của các đoạn DNA được phân tích Trong từng trường hợp cụthể, mỗi vị trí có thể đặc trưng cho một trình tự DNA và phản ánh sự có mặt của mộtloài hay cá thể trong quần xã được phân tích

2.Ứng dụng của kỹ thuật DGGE

Myuzer lần đầu tiên dùng kỹ thuật DGGE để nghiên cứu sinh thái học vi sinh vật,xác định tính đa dạng di truyền của quần thể vu sinh vật trong môi trường thiên nhiên.Gần đây người ta còn mở rộng phương pháp DGGE để tuyển chọn các chủng vi sinhvật và rút ngắn được rất nhiều khối lượng công việc

Trong thực tế, nên phối hợp các phương pháp nghiên cứu truyền thống với cácphương pháp nghiên cứu sinh học phân tử mới có thể nghiên cứu đa dạng vi sinh vật vàcấu trúc quần lạc vi sinh vật trong hệ thống sinh thái vi sinh vật vô cùng phức tạp Khiphân tích tính đa dạng vi sinh vật cần sử dụng DNA chung của quần thể vi sinh vật chứkhông thể sử dụng DNA của các vi sinh vật nuôi cấy thuần khiết

PHẦN 3 ỨNG DỤNG

Ứng dụng 1

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY DIOXIN VÀ PHÂN LOẠI GEN MÃ HÓA DIOXIN DIOXINGIENNAZA CỦA HỖN HỢP CHỦNG VI KHUẨN KỊ KHÍ KHÔNG BẮT BUỘC SETDN20 TỪ ĐẤT NHIỄM ĐỘC HÓA HỌC TẠI

ĐÀ NẴNG

1 MỞ ĐẦU

Hiện nay, đất tại một số ‛điểm nóng’ ở các căn cứ quân sự trước đây của Mỹ vẫn

bị ô nhiễm nặng các chất diệt cỏ, polycloinated dibenzodioxin (PCDDs), polycloinateddibenzofuran (PCDFs) và các hợp chất khác

Tẩy độc các ‛điểm nóng’ ở Đà Nẵng bằng công nghệ sinh học đang được tiếnhành và cho kết quả rất khả quan, phương pháp này có giá thành thấp và thân thiện vớimôi trường Vai trò của tập đoàn vi sinh vật hiếu khí đã được nghiên cứu còn vi sinhvật kị khí và kị khí không bắt buộc vẫn chưa được quan tâm nhiều

Vi khuẩn kị khí và kị khí không bắt buộc đóng vai trò đặc biệt trong quá trình loạikhử halogen các hợp chất hữu cơ chứa halogen khó phân hủy trong đó có dioxin Điềukiện của quá trình khử loại halogen nói chung và Clo nói riêng được thực hiện trongmôi trường hoạt động của vi khuẩn kị khí như: vi khuẩn khử sắt, khử sunfat, vi khuẩnsinh methan Từ các nghiên cứu đã được công bố, chúng tôi đã thống kê được một sốloại có khả năng loại Clo trong điều kiện kị khí: dehalobacter,desulfomonile,desulfitobacterium, dehalococcoides

Phân hủy hiếu khí DD và DBF diễn theo hai cơ chế oxi hóa vị trí bên và vị trí góccủa nhân thơm, trong đó oxi hóa vị trí đầu tiên là ở vị trí góc được thực hiện bởi enzimdioxygenaza, quá trình này chuyển hóa thành DD và DBF

Ở việt nam, công nghệ chôn lấp tích cực là tổ hợp của phương pháp cô lập hấpphụ và phân hủy sinh học đã được nghiên cứu và đang được triển khai khử độc ‛điểmnóng’ nhiễm chất diệt cỏ/dioxin Tuy nhiên để nâng cao hiệu quả khử độc của quy trìnhcông nghệ và áp dụng rộng rãi ở các ‛điểm nóng’ khác cần có thêm hiểu biết sâu về đadạng, khả năng phân hủy sinh học và các gen tham gia quá trình phân hủy các chất độcbởi tập đoàn vi sinh vật bản địa

Để tìm hiểu vai trò của vi sinh vật trong điều kiện chôn lấp tích cực mà ở đó môitrường chủ yếu là kị khí và kị khí không bắt buộc, cần tiến hành nuôi cấy tập đoàn visinh vật kị khí ở điều kiện vẫn có ít oxy trong môi trường Khả năng phân hủy các chấtđộc đặc biệt là 2, 3, 7, 8 – TCDD của các vi sinh vật bản địa đã được xác định thông

qua hỗn hợp chủng vi khuẩn kị khí không bắt buộc SETDN20 Ở đây sẽ trình bày kếtquả nghiên cứu khả năng phát triển cũng như khả năng phân hủy của vi sinh vật trênmôi trường chứa dịch chiết đất (chứa 2, 3, 7, 8 – TCDD) đồng thời nghiên cứu sự đadạng của hỗn hợp chủng Sự phát triển gen chức năng dioxin dioxygenaza trong hỗnhợp chủng vi khuẩn kị khí không bắt buộc SETDN20 cũng đã được công bố trong bàibáo này

2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP