enzyme amylase và ứng dụng của nó

Các Enzyme nàythuộc nhóm Enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhómpolysaccharide với sự tham gia của nước.. Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-Amylase là quá tr

K IL

M

Enzyme Amylase

Lớp 08DTP06

MỤ C LỤ C

Giới thiệu chung 3

A Giới thiệu I Khái niệm Enzyme 4

II Enzyme Amylase là gì 4

III Lịch sử phát hiện 5

B Tổng quan về Enzyme Amylase I Phân loại

6

II Hệ Enzyme Amylase 7

1 Enzyme α-Amylase 7

2 Enzyme β-Amylase 11

3 Enzyme γ -Amylase 13

4 Oligo 1,6-glucosidase 14

5 Enzyme pullulanase 15

6 α-glucosidase hay maltase 14

III Cơ chất 15

1 Tinh bột 15

2 Glycogen 16

IV Công nghệ lên men và thu nhận Enzyme Amylase 17

1 Nguồn thu nhận 17

2 Thu nhận Enzyme Amylase từ thực vật 19

3 Thu nhận Enzyme Amylase từ vi sinh vật 22

V Phương pháp xác ñịnh hoạt ñộ 28

1 Đơn vị ño hoạt ñộ 28

2 Xác ñịnh hoạt ñộ Enzyme α-Amylase theo Rukhliadeva 28

3 Xác ñịnh hoạt ñộ Enzyme glucoamylase ( γ -Amylase ) 29

4 Điều kiện cần và ñủ ñể thu nhận Amylase có hoạt lực cao 29

C Ứng dụng Enzyme Amylase I.Ứng dụng trong sản xuất Bia 3 3 II.Ứng dụng trong sản xuất Bánh mì 3 7 III Ứng dụng trong sản xuất Siro 38

IV.Ứng dụng trong sản xuất cồn 41

V Ứng dụng trong sản xuất bánh kẹo 42

VI.Ứng dụng trong sản xuất Glucose và Mật 4 3 VII.Ứng dụng trong chế biến thức ăn gia súc 4 3 VIII Ứng dụng trong công nghiệp dệt 43

Tài liệu tham khảo 4 5

- 2 –

nhất trongchế ñộ dinh dưỡng của loài người cũng như nhiều loài ñộng vật khác

Người La Mã gọi là amilum, một từ bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp (amilon )

Trong quá trình tiêu hóa chúng bị thủyphân thành ñường glucose là chất tạo

nên nguồn năng lượng chính trong thực phẩm

Ngoài ra tinh bột còn giữ vai trò quan trọng trong công nghiệp thực

phẩm do những tính chất hóa lý của chúng Tinh bột thường ñược dùng làm

chất tạo ñộ nhớt sánh cho cácthực phẩm dạng lỏng, là tác nhân làm bền cho

thực phẩm dạng keo, là các yếu tố kết dính và làm ñặc ñể tạo ñộ cứng, ñộ ñàn

hồi cho nhiều loại thực phẩm Bên cạnh ñó, tinh bột còn ñược dùng trong các

ngành công nghiệp khác như sản xuất giấy, rượu,

Nhiều nước trên thế giới sử dụng nguồn tinh bột từ khoai tây, lúa mì, ngô

(sắn), cònriêng ở nước ta thì sử dụng gạo và khoai mì là nguồn tinh bột chủ

yếu Trong chế biến tinh bột và ñường, công ñoạn quan trọng nhất là thuỷ phân

tinh bột về các ñường ñơn giản Sau ñó, chủ yếu trên cơ sở ñường ñơn nhờ lên

men, người ta sẽ nhận ñược rất nhiều sản phẩm quan trọng như: rượu cồn, rượu

vang, bia, các loại acid hữu cơ, amino acid,… Trước ñây người ta hay dùng

acid hoặc H2SO4 ñể thủy phân tinh bột Nhưng kết quả cho thấy, thuỷ phân

bằng acid rất khó kiểm soát và thường tạo nhiều sản phẩm không mong muốn

và không ñápứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm trong khi giá thành lại cao Cho

nên hiện nay ñể thủy phân tinh bột người ta thường sử dụng Enzyme Amylase

thu nhận từ thực vật hoặc các loại vi sinhvật

Ngoài ra, Amylase còn có nhiều ưu ñiểm hơn khi sử dụng acid ñể thuỷ

phân tinh bột như năng lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị sử

dụng, giảm chi phí cho quá trình tinh sạch dịch ñường Nguồn Amylase có thể

lấy từ mầm thóc, mầm ñại mạch ( malt ), hạt bắp nảy mầm, hay từ nấm mốc,…

Trong ñó Amylase ñược thu nhận từ malt với số lượngnhiều nhất, chủ yếu

dùng trong sản xuất bia.Nguyên liệu cho sản xuất Enzyme thường làgạo, bắp,

khoai mì,… ñây là những nguồn nguyên liệu rẻ tiền có thể tìm thấy dễ dàng ở

nướcta Cho nên ñây là một lợi thế và là hướng phát triển mạnh có thể làm cơ

sở cho nhiều ngành khác phát triển

- 3 –

I Khái niệm Enzyme:

Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn luôn xảy ra quá trình trao ñổi chất

Sự trao ñổichất ngừng thì sự sống không còn tồn tại Quá trình trao ñổi của một

chất là tập hợp của rấtnhiều các phản ứng hóa học phức tạp Các phản ứng này

có liên quan chặt chẽ với nhau vàñiều chỉnh lẫn nhau Enzyme là hợp chất

protein xúc tác cho các phản ứng hóa học ñó Chúngcó khả năng xúc tác ñặc

hiệu các phản ứng hóa học nhất ñịnh và ñảm bảo cho các phản ứngxảy ra theo

một chiều hướng nhất ñịnh với tốc ñộ nhịp nhàng trong cơ thể sống

Enzyme có trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống Chính do

những tác nhân xúctác có nguồn gốc sinh học nên Enzyme còn ñược gọi là các

chất xúc tác sinh học(biocatalysators) nhằm ñể phân biệt với các chất xúc tác

hóa học

Chúng là chất xúc tác sinh học không chỉ có vai trò quan trọng trong quá

trình sinhtrưởng, phát triển của mọi sinh vật mà nó còn giữ vai trò rất quan

trọng trong công nghệ chếbiến thực phẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân

tích, trong công nghệgen và bảo vệ mộitrường

II Enzyme Amylase là gì?

Amylase là một hệ Enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật Các

Enzyme nàythuộc nhóm Enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân

tử trong nhómpolysaccharide với sự tham gia của nước

RR’ +H-OH → RH +R’OH

Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose

và dextrinhạn chế Các Enzyme Amylase có trong nước bọt (còn ñược gọi là

ptyalin), trong dịch tiêuhóa của người và ñộng vật, trong hạt nảy mầm, nấm

sợi, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn.Trong nước bọt của người có ptyalin

nhưng ở một số loại ñộng vật có vú thì không có nhưngựa, chó, mèo Ptyalin

bắt ñầu thủy phân tinh bột từ miệng và quá trình này hoàn tất ở ruộtnon nhờ

Amylase của tuyến tụy (còn ñược gọi là amylopsin) Amylase của malt thủy

phântinh bột lúa mạch thành disaccharide làm cơ chất cho quá trình lên men

bởi nấm men

Amylase là một trong những loại Enzyme ñược ứng dụng rộng rãi nhất trong

công

chuyển hóa tinh bột thành ñường ở nhiệt ñộ từ 4000C – 6000C

Năm 1833, Payen và Perso (Pháp) thêm cồn vào dịch chiết này, thu ñược

kết tủa cókhả năng phân giải tinh bột thành ñường, và ñặt tên là Diastase (xuất

phát từ tiếng Hy Lạp,diastatics, có nghĩa là phân giải, ñó là Amylase) Sau này

theo ñề nghị của Duclo, Enzymephân giải tinh bột ñược gọi là Amylase

Năm 1851: Leuchs ñã phát hiện nước bọt cũng có khả năng phân giải

tinh bột thànhñường Sau ñó, các Enzyme Amylase trong nước bọt, trong dịch

tiêu hóa của người và ñộngvật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi

khuẩn bắt ñầu ñược quan tâm nghiên cứu

Năm 1862, Danilevxki ñã tách ñược Amylase của tuyến tụy bằng phương pháp

Năm 1971, Uxtinilov và cộng sự bằng phương pháp ñiện di trên gel

poliacrylamid ñãxác ñịnh ñược sự có mặt của một lượng lớn α-Amylase và

glucoamylase trong canh trườngnấm mốc và một lượng nhỏ các phân ñoạn có

hoạt lực dextrinase và transglucosilase

Hiện nay các nước trên thế giới sản xuất hàng trăm tấn chế phẩm

Enzyme, trong ñóNhật là nước có truyền thống lâu ñời nhất, sau ñó ñến Anh,

Pháp, Mỹ, Đan Mạch, ThụyĐiển, ñặc biệt hãng Novo của Đan Mạch là 1

trong những hãng sản xuất Enzyme nổi tiếngtrên thế giới Bên cạnh ñó trong

những năm gần ñây các nước Đông Âu và Trung Quốc cũngbắt ñầu nghiên cứu

và sản xuất Enzyme

Nếu như ở Tây Âu mạch nha từ lúa mạch là nguồn Enzyme chủ yếu cho

việc chuyểnhóa tinh bột thành ñường, thì ở Viễn Đông Amylase thường ñược

sản xuất từ nấm mốc trênmôi trường nuôi cấy là các loại ngũ cốc có chứa tinh

bột Như hãng Novo ñã có nhiều chếphẩm Enzyme Amylase ñang ñược sử

dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp như: Côngnghiệp sản xuất rượu bia,

công nghiệp sản xuất bột giặt, công nghiệp giấy…

B Tổng quan về Enzyme Amylase

I Phân loại :

Hiện nay, có sáu loại Enzyme Amylase ñược xếp vào 2 nhóm: Endoamylase (

Enzyme nội bào ) và Exoamylase ( Enzyme ngoại bào )

- Endoamylase : gồm có α-Amylase (EC 3.2.1.1) và nhóm Enzyme khử nhánh

Nhóm nzyme khử nhánh này ñược chia thành hai loại: khử trực tiếp là

pullulanase ( hay α-dextrin6-glucanohydrolase ) (EC 3.2.1.41); khử gián tiếp là

transglucosylase (hay oligo-1,6-glucosidase) (EC 3.2.1.20) và

amylo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.10) Các Enzyme này thủyphân các liên kết bên trong

của chuỗi polysaccharide

-Exoam ylas e Đây là những Enzyme thủy phân tinh bột tử ñầu không khử của

chuỗi olysaccharide Nhóm này gồm có:

+ β-Amylase (EC 3.2.1.2)

+ Amyloglucosidase (glucoamylase hay γ-Amylase) (EC 3.2.1.3)

( có một sơ ñồ)

* Sự khác biệt giữa các loại Enzyme Amylase:

- Các loại Enzyme Amylase không chỉ khác nhau ở ñặc tính mà còn khác nhau

ở pH hoạt ñộng và tính ổn ñịnh với nhiệt

- Tốc ñộ phản ứng của Amylase phụ thuộc vào pH, nhiệt ñộ, mức ñộ

polyme hóa củacơ chất Các Enzyme Amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có

tính chất, cơ chế tác dụng và sảnphẩm cuối cùng của quá trình thủy phân khác

nhau

- Amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có thành phần, tính chất, nhiệt ñộ hoạt

ñộng, pH tối ưu và các ñặc ñiểm thủy phân khác nhau

II Hệ Enzyme Amylase:

1 Enzyme α-Amylase (α-1,4-glucanohydrolase) (EC 3.2.1.1):

a) Cấu tạo:

Enzyme α-Amylase là protein có phân tử lượng thấp, thường nằm trong khoảng

50.000 ñến 60.000 Dal Có một số trường hợp ñặc biệt như α-Amylase từ loài

vi khuẩn Bacillus macerans có phân tử lượng lên ñến 130.000 Dal.Đến nay

người ta ñã biết rất rõ các chuỗi acid amin của 18 loại α-Amylase nhưng chỉ có

2 loại α-Amylase là taka-Amylase từ Apergillus orysee và α-Amylase của tụy

lợn ñược nghiên cứu kỹ về hình thể không gian cấu trúc bậc 3 Mới ñây các

nghiên cứu về tính ñồng nhất của chuỗi mạch acid amin và về vùng kịnước cho

thấy các chuỗi mạch acid amin của tất cả các Enzyme α-Amylase ñều có cấu

trúcbậc 3 tương tự nhau

Cấu trúc không gian của α-Amylase b) Cơ chế tác dụng của α-Amylase:

Amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều ñiềm rất giống nhau

α-Amylase có khảnăng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên

trong phân tử cơ chất ( tinh bộthoặc glycogen ) một cách ngẫu nhiên, không

theo một trật tự nào cả α-Amylase không chỉthủy phân hồ tinh bột mà nó thủy

phân cả hạt tinh bột nguyên song với tốc ñộ rất chậm

Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-Amylase là quá trình ña giai ñoạn:

+Ở giai ñoạn ñầu ( giai ñoạn dextrin hóa ): Chỉ một số phân tử cơ chất bị

thủy phântạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin ), ñộ nhớt

của hồ tinh bột giảm nhanh( các amylose và amylopectin ñều bị dịch hóa

nhanh)

+ Sang giai ñoạn 2 ( giai ñoạn ñường hóa ): Các dextrin phân tử thấp tạo

thành bị thủyphân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine

Các chất này bị thủy phânrất chậm bởi α-Amylasecho tới disaccharide và

monosaccharide Dưới tác dụng của α-Amylase, amylose bị phân giải khá

nhanh thành oligosaccharide gồm 6 - 7 gốc glucose ( vìvậy, người ta cho rằng

α-Amylase luôn phân cắt amylose thành từng ñoạn 6 - 7 gốcglucopiranose 1 )

+ Sau ñó, các poliglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch

polyglucosecolagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm ñến maltotetrose,

maltotriose và maltose Qua mộtthời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của

amylose chứa 13% glucose và 87% maltose.Tác dụng của α-Amylase lên

amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt ñượcliên kết

α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác

dụnglâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các ñường nói trên ( 72% maltose và

19% glucose ) còn códextrin phân tử thấp và isomaltose 8%

Tóm lại, dưới tác dụng của α-Amylase, tinh bột có thể chuyển thành

maltotetrose,maltose, glucose và dextrin phân tử thấp Tuy nhiên, thông thường

α-Amylase chỉ thủy phântinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho

màu với Iodine và một ít maltose Khảnăng dextrin hóa cao của α-Amylase là

tính chất ñặc trưng của nó Vì vậy, người ta thườnggọi loại Amylase này là

Amylase dextrin hóa hay Amylase dịch hóa

Các giai ñoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-Amylase:

+ Giai ñoạn dextrin hóa:

Α-Amylase Tinh bột → dextrin phân tử lượng thấp

+ Giai ñoạn ñường hóa:

Dextrin → tetra và trimaltose → di & monosaccharide

c) Đặc tính α-Amylase

α-Amylasetừ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi

loại α- Amylase có một tổ hợp amino acid ñặc hiệu riêng α-Amylase là một

protein giàu tyrosine, α-Amylase, acid glutamic và aspartic Các glutamic acid

và aspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử

Enzyme:

+ α-Amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine

+ Trọng lượng phân tử của α-Amylase nấm mốc: 45.000-50.000 Da ( Knir

1956; Fisher, Stein, 1960 )

+ Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng

+ Protein của các α-Amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline

Điểm ñẳng ñiện nằm trong vùng pH=4,2 - 5,7 ( Bernfeld P, 1951 )

α-Amylase làmột metaloEnzyme Mỗi phân tử α-Amylase ñều có chứa

1-30 nguyêntử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1 - 6 nguyên tử gam/mol Ca

tham gia vào sự hình thànhvà ổn ñịnh cấu trúc bậc 3 của Enzyme, duy trì hoạt

ñộng của Enzyme ( Modolova, 1965 ) Doñó, Ca còn có vai trò duy trì sự tồn

tại của Enzyme khi bị tác ñộng bởi các tác nhân gây biếntính và tác ñộng của

các Enzyme phân giải protein Nếu phân tử α-Amylase bị loại bỏ hết Cathì nó

sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất α-Amylase bền với nhiệt

ñộ hơncác Enzyme khác Đặc tính này có lẽ liên quan ñến hàm lượng Ca trong

phân tử và nồng ñộMg2+ Tất cả các Amylase ñều bị kiềm hãm bởi các kim

loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+ Một sốkim loại như : Li+, Na+, Cr3+, Mn2+,

Zn2+, Co2+, Sn2+, Cr3+, không có ảnh hưởng mấy ñến α-Amylase Một ñặc

ñiểm cần lưu ý là hầu hết α-Amylase khá bền với tác ñộng của proteasenhư

pepsin, trypsin, papain

Thành phần amino acid của α-Amylase ở nấm mốcAspergillus như sau (

g/100 gprotein ): alamine = 6,8 ; glycine = 6,6 ; valine = 6,9 ; leucine = 8,3 ;

Isoleucine = 5,2 ; prolin= 4,2 ; phenylalanine = 4,2 ; tyrosine = 9,5 ; trytophan

= 4,0; xetin = 6,5 ; trionin = 10,7 ;cystein + cystine = 1,6 ; glutamic acid = 6,9 ;

amide = 1,5 ( Akabori et amilose 1954 ) Khônggiống các α-Amylase khác,

Amylase củaAsp.orysee có chứa phần phi protein làpolysaccharide Polyose

này bao gồm 8 mol maltose, 1 mol glucose, 2 mol hexosemin trên 1mol

Enzyme ( Akabori et amilose, 1965 ) Vai trò của polyose này vẫn chưa rõ,

song ñã biếtñược rằng nó không tham gia vào thành phần của trung tâm hoạt

ñộng và nằm ở phía trongphân tử Enzyme

α-Amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị

thương tổn Sảnphẩm cuối cùng của thủy phân Amylase là glucose và maltose

Đối với nấm sợi tỉ lệ là 1:3,79( Hanrahan, Caldwell, 1953 ) Fenikxova và

Eromsina (1991) cho biết rằng các maltopentosevà maltohexose bị thủy phân

theo sơ ñồ sau:

G5 → G4 + G1; G6→G2 + G4 hay 2G3 ( chính ) hoặc G5 + G1 ( ít )

α-Amylase của nấm sợi không tấn công liên kết α-1,6 glucoside của

amylopectin, nênkhi thủy phân nó sẽ tạo thành các dextrin tới hạn phân nhánh

Đây là một cấu trúc phân tửtinh bột do Enzyme α-Amylase phân cắt tạo thành

dextrin tới hạn phân nhánh

Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bộtdưới tác dụng của Amylase

nấm sợi chủyếu là maltose, thứ ñến là maltotriose Nồng ñộ α-Amylase của

VSV tương ñối lớn có thểchuyển hóa 70 - 85% tinh bột thành ñường lên men

Còn các α-Amylase của nấm mốc thìmức ñộ ñường hóa ñến glucose và maltose

có thể lên tới 84 - 87%

Điều kiện hoạt ñộng của α-Amylase từ các nguồn khác nhau thường

không giốngnhau pH tối thích cho hoạt ñộng của α-Amylase từ nấm sợi là 4,0

- 4,8 ( có thể hoạt ñộng tốttrong vùng pHtừ 4,5 - 5,8 ) Theo số liệu của

Liphis,pH tối thích cho hoạt ñộng dextrin hóavà ñường hóa của chế phẩm

Amylase từAsp.orysee trong vùng 5,6 - 6,2 Còn theo số liệu củaFenixova thì

pH tối thích cho hoạt ñộng dextrin hóa của nó là 6,0 - 7,0

Độ bền ñối với tác dụng của acid cũng khác khác nhau α-Amylase củaAs

p.or ys ee bềnvững ñối với acid tốt hơn là α-Amylase của malt và vi

khuẩnBac.s ubtilis Ở pH= 3,6 và 0oC,α-Amylase của malt bị vô hoạt hoàn

toàn sau 15 - 30 phút; α-Amylase vi khuẩn bị bất hoạtñến 50%, trong khi ñó

hoạt lực của α-Amylase của nấm sợi hình như không giảm bao nhiêu(

Fenilxova, Rmoshinoi 1989) Trong dung dịch α-Amylase nấm sợi bảo quản tốt

ở pH= 5,0- 5,5 ; α-Amylase dextrin hóa của nấm sợi ñen có thể chịu ñược pH

từ 2,5-2,8 Ở 0oC và pH=2,5 , nó chỉ bị bất hoạt hoàn toàn sau 1 giờ

Nhiệt ñộ tối thích cho hoạt ñộng xúc tác của α-Amylase từ các nguồn

khác nhau cũngkhông ñồng nhất, α-Amylase của nấm sợi rất nhạy cảm ñối với

tác ñộng nhiệt Nhiệt ñộ tốithích của nó là500C và bị vô hoạt ở700C (

Kozmina, 1991 )

Trong dung dịch ñệm pH = 4,7 , α-Amylase củaAsp.orysee rất nhạy với

tác ñộng củanhiệt ñộ cao, thậm chí ở 400C trong 3 giờ hoạt lực dextrin hóa của

nó chỉ còn 22 - 29%, hoạtlực ñường hóa còn 27 - 85% Ở 500C trong 2 giờ,

α-Amylase của nấm sợi này bị vô hoạt hoàntoàn ( Miller và cộng sự )

(co mot bảng)

2 Enzyme β-Amylase (β-1,4-glucan-maltohydrolase) (EC 3.2.1.2):

a) Cấu tạo:

β-Amylase hiện diện phổ biến ở thực vật, ñặc biệt là hạt nảy mầm Ở

trong các hạt ngũcốc nảy mầm, β-Amylase xúc tác sự thuỷ phân các liên kết

1,4 α-glucan trong tinh bột ,glucogen và polysaccharide, phân cắt từng nhóm

maltose từ ñầu không khử của mạch Maltose ñược tạo thành do sự xúc tác của

β-Amylase có cấu hình β

Ở ngũ cốc, β-Amylase tham gia vào sự phân giải của tinh bột trong quá

trình nảy mầmcủa hạt Ở lúa, β-Amylase ñược tổng hợp trong suốt quá trình

của hạt và hầu như không ñượctổng hợp ở hạt khô Ở lúa mạch, Enzyme có mặt

ở trong hạt khô, nó ñược tích lũy trong suốtquá trình phát triển của hạt, khi ở

dạng liên kết, Enzyme này là một phân tử có trọng lượngphân tử là 64.000 Da

và khi bị phân cắt bởi một protease sẽ ñược phóng thích dưới dạng tự dovà có

khối lượng phân tử là 59.000 Da

b) Cơ chế tác dụng của β-Amylase:

β-Amylase là một Enzyme ngoại bào (exoenzyme) Tiến trình phân giải

bắt ñầu từ ñầukhông khử của các nhánh ngoài cùng cơ chất β-Amylase phân

cắt các liên kết α-1,4glucoside nhưng khi gặp liên kết α-1,4 glucoside ñứng kế

cận liên kết α-1,6glucoside thìnó sẽ ngừng tác dụng Phần polysaccharide còn

lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiềuliên kết α-1,6 glucoside và ñược gọi

β-Amylase là một albumin , tâm xúc tác có chứa nhóm –SH , nhóm X-COOH

và vòngimidazol của các gốc histidine và là Enzyme ngoại bào (exoEnzyme )

β-Amylase không bền khi có Ca2+, β-Amylase bị kìm hãm bởi Cu2+, Hg2+,

urea,iodineoacetamide, iodine, ozon…

β-Amylase chịu nhiệt kém hơn α-Amylase nhưng bền hơn với acid.β-Amylase

bịbất hoạt ở nhiệt ñộ 700C Nhiệt ñộ tối thích của β-Amylase là 550C, pH 5,1 –

5,5

Tham gia vào cơ chế tác dụng của β-Amylase thường có một nhóm

caboxyl thể hiệntính chất ái nhân và một nhóm imidazol thể hiện tính chất ái

electron Sự nghịch ñảo hình thểcủa cacbon anome (C1) ñược thực hiện nhờ

việc tạo thành hợp chất ñồng hoá trị trung giankiểu este axetal giữa cacbon

anome và nhóm cacboxyl của tâm hoạt ñộng Sau ñó este này bịphân huỷ bởi

tác ñộng của 1 phân tử nước lên nhóm cacboxyl ñể giải phóng ra α-maltose và

hoàn nguyên nhóm cacbxyl của Enzyme

Các ñặc tính của β-Amylase

(bảng)

3 Enzyme γ-Amylase (glucoamylase) (EC 3.2.1.3):

a) Cấu tạo:

γ-Amylase ( glucoamylase hay α-1,4-glucan-glucohydrolase ) là những

Enzyme có thể thuỷ phân ñược cả hai kiểu liên kết của các mạch α-glucan ñể

giải phóng ra ở dạng β

Glucoamylase hayγ-Amylasechủ yếu ñược tạo ra bởi các vi sinh vật Đặc biệt

là kiểu nấm mốc aspergillus, penicillium và Rhizopus

Amyloglucosidase từ nấm mốc là các protein có khối lượng phân tử lượng dao

ñộng rất lớn từ 27.000 ñến 112.000 Dal tuỳ thuộc vào nguồn gốc của Enzyme

Nói chung thì các amyloglucosidase ñều chứa các gốc mêthioni,

tritophan, và một nửagốc cystein Tuy nhiên mối quan hệ giữa chuỗi acid amin,

cấu trúc bậc 3 và hoạt ñộng củaEnzyme vẫn chưa ñược làm sáng tỏ tất cả các

amyloglucosidase từ nấm mốc ñều làglucoprotein chứa từ 5 - 20% gluxit trong

ñó chủ yếu là các mono saccharid glucose mannose,galactose và glucosamin

Các amyloglucosidase chủ yếu ñược tạo nên từ hai isoEnzyme I và II

khác nhau ở khảnăng thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn và bởi ñộ bền của

chúng Amyloglucosidase I tự hấpthụ và thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn,

ngược lại amyloglucosidase II không có cả hai tinhchất này

b) Cơ chế hoạt ñộng:

Amyloglucosidase có thể giải phóng ra β-D-glucose bằng cách thuỷ phân

lặp lại nhiềulần các liên kết α-1,4 của mạch α-glucan từ ñầu không khử, chúng

cũng thuỷ phân ñược cácliên kết α-1,6 và α-1,3 nhưng rất chậm (10 - 30 lần )

Tốc ñộ thuỷ phân cũng phụ thuộc vàobản chất của các liên kết kề cận với các

liên kết glucozit ñược thuỷ phân , cũng như kíchthuớc và cấu trúc của cơ chất

bị thuỷ phân Nhất là với các α-glucan mạch dài ( amylose vàamylopectin ) thì

bị thuỷ phân nhanh hơn là với các maltodextrin và các oligosaccharit

c) Tính chất:

Glucoamylase có khả năng thuỷ phân các liên kếtα-1,4 lẫn α-1,6

glucoside Khi thuỷphân liên kết α-1,4-glucan trong chuỗi polysaccharide,

glucoamylase tách lần lượt từng phântử glucose ra khỏi ñầu không khử của

mạch ñể tạo ra glucose Enzyme này có nhiều tên gọikhác nhau: α-1,4 ;

α-1,6-glucan-4; 6-glucohydrolase; glucoamylase; amyloglucosidase;

taka-Amylase B; γ-Amylase… Là Enzyme ngoại bào

Ngoài các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside , glucoamylase còn có khả năng

thuỷ phân các liên kết α-1,2 và α-1,3 glucoside

Glucoamylase có khả năng thuỷ phân hoàn toàn tinh bột , glucogen ,

amylopectin ,dextrin , panose , iso maltose và maltose thành glucose, mà không

cần có sự tham gia cuả cácloại Enzyme khác Glucoamylase thuỷ giải các

polysaccharide có phân tử lớn nhanh hơn so ới các chất có phân tử nhỏ Các

polisaccharide có nhánh như amylopectin, glucogen, β-

dextrin bị glucoamylase thủy phân khá nhanh

Đa số glucoamylase có hoạt lực cao nhất ở vùng có pH 3,5 – 5,5 và nhiệt

ñộ 500C Nó bền với acid hơn α-Amylase nhưng kém bền hơn trong rượu,

acetone và không ñược bảovệ bởi Ca2+

4 Oligo 1,6-glucosidase (dextrinase tới hạn) (EC 3.2.1.10)

Enzyme này có thể thuỷ phân liên kết α-1,6 – glucoside trong isomaltose,

panose vàcác dextrin tới hạn thành ñường có thể lên men ñược Enzyme này có

ở VSV nhưng ñồng thờicũng có trong các hạt nảy mầm ( ñại mạch, thóc nảy

mầm ) Ngoài oligo–1,6–glucosidase, hệdextrinase của hạt ngũ cốc , hạtnảy

mầm còn có amylopectin–1,6–glucosidase hay R–Enzyme và dextrin–1,6–

glucoside hay amylo–1,6–glucoside hay dextrin-6-glucocanhydrolase Hai loại

Enzyme này ñều thuỷ phân dextrin triệt ñể hơnα-Amylase vàβ-Amylase do ñó

trong dung dịch thuỷ phân có nhiều maltose hơn

Nhiệt ñộ tối thích cho các hoạt ñộng của các dextrinase là 400C và pH tối thích

là 5,1

5 Enzyme pullulanase (α-dextrin6-glucosidase) (EC 3.2.1.41)

Enzyme này có thể thuỷ phân các liên kết α-1,6 của tinh bột, glucogen,

pululan và cácdextrin tới hạn Điều ñáng chú ý là sự ñịnh vị của các liên kết

1,6 có ảnh hưởng lớn ñến tácñộng của Enzyme Đặc biệt là sự có mặt của hai

liên kết α-1,4 nằm liền kề bên liên kết α-1,6là ñiều kiện cần thiết cho Enzyme

phân cắt liên kết này

Pullulanase phân giải các liên kết α-1,6 glucoside bị bao quanh tứ phía

bởi các liên kếtα-1,4 Nó còn có khả năng thủy phân cả những dextrin phân

tửthấp chỉ gồm có hai gốcmaltose nối nhau bằng liên kết α-1,6 glucoside Tác

dụng hiệp ñồng của α-Amylase vàpullulanase làm nó bị thủy phân hoàn toàn

6 α-glucosidase hay maltase (α-D,glucoside-glucohydrolase) (EC 3.2.1.20)

Nhiều loại nấm sợi sản sinh Enzyme này Giống như glucomylase, nó

thủy phânmaltose thành glucose nhưng không thủy phân tinh bột Maltase và

glucozyltranferase là mộtEnzyme ñồng nhất vừa có khả năng thủy phân liên kết

α-1,4, trong các glucopiranoside vừacó khả năng chuyển các gốc glucoside

sang ñường và rượu

II I Cơ chất:

Cơ chất tác dụng của Amylase là tinh bột và glucose

1 Tinh bột: là nhóm Cacbonhydrat ở thực vật, có chủ yếu trong các loại củ

như khoai

lang, khoai tây, khoai mì…, trong các hạt ngũ cốc, các loại hạt và có công thức

tổng quát là(C6H12O6)n Hạt tinh bột có hình dáng rất khác nhau với kích

thước từ 2 ñến 15µm Tinh bộtkhông nước có khối lượng riêng khoảng 1,633 –

1,648

- Tinh bột là chất keo háo nước ñiển hình cấu tạo từ amylose – mạch thẳng và

amylopectin.Tỷ số amylose và amylopectin trong tinh bột thường vào khoảng 1

: 4 Cả hai ñều tạo nhữnggốc α-D-glucose Amylo có cấu tạo mạch thẳng

Chúng ñược liên kết bởi các nối α-1,4glucozit và α-1,6 glucozit nên tạo thành

nhiều nhánh Ngoài amylose và amylopectin trongtinh bột còn có chứa một

lượng nhỏ các chất khác như muối khoáng, chất béo, protit… Hàmlượng chung

của chúng khoảng 0,2 – 0,7%

- Tinh bột không hòa tan trong nước lạnh, trong rượu và ete Amylose dễ tan

trong nước nóngvà tạo nên ñộ nhớt của dung dịch Amylopectin khi hòa tan

trong nước nóng tạo dung dịch rấtnhớt

- Trong nước nóng tinh bột sẽ hút nước trương nở và tạo dạng gel Mức ñộ

trương của tinhbột phụ thuộc nhiệt ñộ Khi tăng dần nhiệt ñộ, dịch tinh bột sẽ

biến thành dạng keo và gọi làhồ tinh bột Nhiệt ñộ làm cho hồ tinh bột có ñộ

nhớt cực ñại gọi là nhiệt ñộ hồ hóa của tinhbột Trong thực tế luôn luôn tồn tại

+Amylos e: có cấu tạo chuỗi không phân nhánh, mạch thẳng cấu tạo từ

các gốc α–D-glucopyranosyl, liên kết với nhau bởi gốc α-1,4 glucoside, dài

khoảng 300 – 1000 gốcglucose, xoắn theo chiều lò xo mỗi xoắn có 6 gốc

glucose tạo thành hình lục giác Cấu trúcxoắn ñược giữ vững nhờ các liên kết

hidro ñược tạo thành giữa các nhóm OH tự do Bêntrong xoắn có thể kết hợp

với các nguyên tử khác Cùng với amylopectin, các phân tửamylose tham gia

tạo nên cấu hình hạt tinh bột ở thực vật Ví dụ Amylose tạo thành màu xanhkhi

tác dụng với Iodine, nếu ñun nóng liên kết hidro bị cắt ñứt, chuỗi amylose bị

duỗi thẳngdo bị tách ra khỏi amylose dung dịch mất màu xanh

Amilose thường ñược phân bố ở phần bên trong của hạt tinh bột Dung dịch

amylose có ñộ nhớt thấp hơndung dịch amilopectin Amylose bị kết tủa bởi

ancol butylic

+ Am ylopectin:Là một polyme mạch nhánh, ñược cấu tạo từ các gốcα-D-

glucopyranosylliên kết với nhau bởi α-1,4 và α-1,6 glucozit Mức ñộ polyme

hóa tửamylopectin có thể lên ñến giá trị hàng triệu Cấu trúc phân mạchcủa nó

bao gồm 1 nhánhtrungtâm ( chứa liên kết 1-4 ) từ nhánh này phát ra cácnhánh

phụ có chiều dài khoảng vàichục gốc glucose Khối lượng phân tử của

amylopectin khoảng 500000 - 1 triệu.Amylopectin ñược phân bố mặt ngoài hạt

tinh bột Dung dịchamylopectin có ñộ nhớt cao khi ñun nóng làm thay ñổi sâu

sắc và không thuận ngịch cấu trúc phân tử amilopectin gây ratrạng thái hồ hoá

tinh bột Tinh bột có thể bị thuỷ phân dưới tác dụng của Enzyme Amylasehoặc

acid tạo thành các sản phẩm có khối lượng phân tử thấp hơn gọi là dextrin Các

dextrinnày có thể bị thuỷ phân hoàn toàn tạo thành các gốc glucose Như vậy

sản phẩm thuỷ phânhoàn toàn tinh bột là glucose tuy nhiên ở những ñiều kiện

xác ñịnh, dưới tác dụng củaEnzyme disaccharit mantose lại là sản phẩm chủ

yếu trong sản phẩm thuỷ phân tinh bột

Glycogen cũng thuộc glucan, là polysaccharide dự trữ ở người và ñộng

vật Phân tửglycogen có công thức chung là (C6H10O5)n cũng phân nhánh

giống như phân tử amilopectinnhưng mức ñộ phân nhánh nhiều hơn Phần lớn

các gốc glucose trongphân tửkết hợp vớinhau qua liên kết α -1,4 glucozit , liên

kết α-1,6-glucozit ở chỗ phân nhánh của phân tử.Glycogen bị thuỷ phân dưới

tác dụng của Enzyme amylasehoặcacid Khi thuỷ phân hoàntoàn glycogen nhận

ñược α-D-glucose Glycogen hoà tan trong nước nóng, cho màu ñỏ tímhoặc ñỏ

nâu với iot

Glycogen cósố mạch nhiều hơn tinh bột Phân tử lượng ở trong khoảng 2

– 3 triệuDa Glycogen dễ tan trong nước, nếu như chúng ta ăn quá nhiều

Carbohydrate thì cơ thểchúng ta sẽ chuyển hóa chúng thành chất béo dự trữ Ở

ñộng vật và người glucogen chủ yếutập trung ở gan

Quá trình thủy phân tinh bột của các Enzyme Amylase

Muốn thu nhận Enzyme cần chiết rút ra khỏi tế bào

Trong cơ thể sinh vật, Enzyme ở trong tế bào chất và các cấu tử tạo nên tế bào

nhưnhân microsom … Enzyme không có khả năng ñi qua màng tế bào, ñể ñi

vào dung dịch chiết.Vì vậy việc ñầu tiên là cần phải phá vỡ màng tế bào Việc

phá vỡ cấu trúc tế bào có thể sửdụng một số cách sau :

+ Biện pháp cơ học nhưnghiền xay với bột thuỷ tinh , cát thạch anh hoặc máy

xay ñồng hoá…

+ Bằng dung môi hữu cơ như butanol, axeton, glycerin, etyl axetat …

+ Bằng sóng siêu âm, tia X, tia UV…

Sau khi nghiền nhỏ Enzyme ñược chiết rút bằng nuớc hay dung dịch ñệm thích

hợp, hoặc dung dịch muối trung tính …

Dung dịch thu ñược sau khi chiết ngoài Enzyme còn có các tạp chất khác

nhưprotein phi Enzyme, muối, gluxit …

Chúng ta cần loại bỏ ñể thu nhận Enzyme có ñộ tinh khiết cao Có

rấtnhiềuphươngpháp tinh sạch Enzyme sau ñây là một số phương pháp cơ bản

ñược sử dụng rộng rãi và có hiệu quả :

+ Để loại muối và tạp chất có trọng lượng phân tử nhỏ ta dùng phương

pháp thẩm tíchqua màng bán thấm Tinh chất của màng này sẽ cho chất có

trọng lượng phân tử nhỏ ñi qua Các chất có trọng lượng phân tử lớn bị giữ lại

Enzyme Amylase có trong tụy tạng của ñộng vật Tụy tạng là ống dạng

chùm, dài, lớn,nằm ngang phía sau dạ dày, giữa lá lách và tá tràng Chiều dài

của tụy tạng khoảng 30-35cm,và nặng khoảng 80-150g Bên trong có những

vách ngăn nhỏ chia tụy tạng thành nhiều thùynhỏ Tụy tạng vừa có chức năng

nội tiết vừa có chức năng ngoại tiết

Thu nhận Amylase từ ñộng vật phần lớn là từ dịch tụy tạng 98% tụy

tạng ñược cấutạo từ các tế bào ngoại tiết hoặc là tế bào tuyến Các tế bào này

tiết Enzyme tiêu hoá vào trongtá tràng

b) Thực vật:

Được lấy từ nhiều nguồn như:

- Đại mạch (Hordeum sativum): có giống hai hàng và giống nhiều hàng (4,6

hàng), trong ñóngười ta sử dụng loại hai hàng ñể sản xuất malt làm bia, những

loại còn lại ñể làm thức ăn chogia súc

- Lúa (Oryse sativa L): Chủ yếu ở vùng Đông Nam Á

- Ngô (Zea mays): có nhiều loại ngô: ngô ñá, ngô bột, ngô răng ngựa Hạt ngô

có màu trắng,màu vàng hay màu hồng Ngô màu vàng do có sự hiện diện của

carotenoid và zeaxanthine ởtrong nội nhũ, ngô màu hồng là do trong nội nhũ

của ngô có anthocyanin

c) Vi sinh vật:

Ngày nay do ưu thế về nhiều mặt, VSV trở thành nguồn thu Enzyme

Amylase chủñạo Những chủng VSV tạo nhiều Amylasethường ñược phân lập

từ các nguồn tự nhiên.VSV tạo Amylase ñược dùng nhiều hơn cả là nấm sợi,

giả nấm men và vi khuẩn, còn xạkhuẩn thì ít hơn

- Các giống nấm sợi thường dùng là giống nấm sợiAs per gillus,Rhiz opus

- Nấm men và giả nấm men thuộc các giốngCandida, Saccharomyces

Endomycopsy,

Endomyces cũng tạo Amylase

- Nhiều vi khuẩn có khả năng tạo lượng lớn Amylase như: Bac Polymyxa,

Phytomonas

destructans, Bact cassavanum, Clostridium acetobutylium, Pseudomonas

saccharophila …

Các vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng sinh trưởng nhanh và phát triển tốt ở nhiệt

ñộ cao nên khi nuôi chúng ít bị nhiễm VSV khác Đáng chú ý là Bac

diastaticus, Bac stearothermophilus,

Bac coagulans, Bac circulans

- Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loại tạo Amylase mạnh mẽ, tuy nhiên

cũng có một sốchẳng hạn như xạ khuẩn ưa nhiệt Micromonospora vulgaris 42

có khả năng tạo một lượngnhỏ α-Amylase hoạt ñộng ở 650C cùng với

proteinase và các Enzyme khác

2 Thu nhận Enzyme từ thực vật:

Ngâm hạt, ủ hạt cho nảy mầm, sấy malt tươi, tách mầm, bảo quản malt khô

* Yêu cầu về nguồn nguyên liệu

- Hạt có màu vàng vàng óng ánh , thơm mùi rạ tươi

- Hạt phải thuần , tỷ lệ hạt ngoại lai chỉ ñược chiếm 5% Không có hạt bị bệnh

- Vỏ hạt < 7-9% trọng lượng hạt Trọng lượng 1000 hạt khoảng 40-44g

- Sức nảy mầm ( qua ngày thứ 3 của quá trình nảy mầm ) : 80 -90%

- Khả năng nảy mầm ( tính ñến ngày thứ 5 của quá trình nảy mầm : > 95% )

Các bước trong quy trình sản xuất malt ñại mạch :

Đại mạch - > làm sạch - > sấy bảo quản - > ngâm hạt - > ủ

mầm - > malt tươimầm - > sấy maltmầm - > tách mầm rễmầm - > malt khô

Ngâm Hạt : Đại mạch ñược ngâm trong nước sạch cho ñến khi ñạt ñến sự

cân bàng vềñộ ẩm Chú ý ñến sự thông khí trong khối hạt bằng cách ñảo trộn

khối hạt thường xuyên Mụcñích của giai ñoạn này là tạo ñộ ẩm cho hạt có ñiều

kiệnlấy ñủ oxy, ñẩy CO2 và các sảnphẩm bất lợi cho quá trình nảy mầm của

hạt ra ngoài khối hạt

Khi ngâm hạt, nước sẽ ngấm vào hạt làm cho thể tích hạt tăng nên, các

Enzyme ñangở trạng thái không hoạt ñộng chuyển sang trạng thái hoạt ñộng và

hoạt tính của Enzyme sẽmạnh dần và thuỷ phân các chất dự trữ có phân tử

lượng cao ở trong hạt thành các chất cóphân tử lượng nhỏ hơn như ñường ,

amino acid Vì vậy , cần phải luôn luôn chú ý ñến sựthông khí , ñộ ẩm của hạt

và nhiệt ñộ

Hạt ñại mạch khô hầu như không có hoạt lực của α-Amylase Khi hạt

chuẩn bị nảymầm thì xuất hiện hoạt lực của α-Amylase và hoạt lực này tăng

dần Đến ngày thứ 7 và thứ 8của quá trình nảy mầm ( nhiệt ñộ18 – 200C), hoạt

lực này ñạt ñến mức ñộ tối ña, sau ñó giảmxuống Vào lúc hoạt lực của

Enzyme ñạt ñến mức tối ña thì phải ngừng quá trình nảy mầmbằng cách sấy

hạtñang nảy mầm ở nhiệt ñộ thích hợp

(co so do t18)

Đại mạch là loại ngũ cốc trồng ở vùng ôn ñới có khí hậu lạnh Ở những

vùng nhiệt ñớingười ta nghiên cứu việc sử dụng malt thóc, bắp ñể thay thế một

phần hay toàn bộ malt ñạimạch

* Các bước trong quy trình sản xuất malt thóc

Hạt lúa - > làm sạch, phân loại - > sấy bảo quản - > ngâm

hạt > ủ mầm

- > malt tươi -> sấy malt - > tách mầm rễ - > malt khô

Trong qúa trình nảy mầm của hạt, các Enzyme như Amylase, protease,…

hoạt ñộngmạnh xúc tác cho các biến ñổi sinh lý, sinh hoá trong hạt như thuỷ

phân các chất cao phân tửnhư tinh bột và cellulose, protein thành những chất

ñơn giản hơn Quá trình nảy mầm xảy rakhi hạt có ñầy ñủ các ñiều kiện thích

hợp về ñộ ẩm, nhiệt ñộ

Ngâm Hạt : trong hạt lúa có sẵn một lượng nước ở dạng liên kết Nước từ bên

ngoàikhi thấm vào hạt sẽ hoà tan các chất dự trữ, hoạt hóa các Enzyme xúc tác

quá trình phân giảicác hợp chất cao phân tử trong hạt thành những chất ñơn

giản cung cấp cho hoạt ñộng tăng trưởng của phôi ñể hình thành cây mầm

Phôi là nơi hút nước mạnh nhất Tốc ñộ hút nước rất

mạnh ở thời gian ñầu do có sự chênh lệch áp suất thẩm thấu rất lớn giữa môi

trường bên ngoài và các tế bào bên trong hạt, ñồng thời các chất keo háo nước

trương nở rất mạnh, càng về sau, sức hút nước của hạt càng giảm

Ủ hạt : việc ủ hạt trải qua 3 giai ñoạn

+ Giai ñoạn 1 : kéo dài 3 ngày Ở ngày thứ ba bắt ñầu nảy mầm, nhiệt ñộ của

khối hạt tăng nhanh do hoạt ñộng hô hấp mạnh Khối hạt cần ñược ñảo 2 - 3

lần/ngày

+ Giai ñoạn 2 : kéo dài 3 ngày Lúc này chồi mầm và rễ mầm tăng

trưởng nhanh,nhiệt ñộ khối hạt cũng tăng nhanh do hoạt ñộng hô hấp cao Khối

hạt cần ñược ñảo 2 - 3lần/ngày

+ Giai ñoạn 3 : những ngày sau quá trình nảy mầm xảy ra chậm dầm, nhiệt ñộ

tăng yếu và khối hạt cũng cần ñược ñảo 2 - 3 lần/ngày

* Các quá trình xảy ra trong quá trình nảy mầm của Hạt

Khi nước ở bên ngoài thấm vào hạt, các hợp chất cao phân tử bên trong

hạt thấm nướcvà trương lên, các Enzyme thuỷ phân hoạt ñộng, phân cắt các

chất này thành những chất ñơngiản hơn ở trạng thái hoà tan Các chất này một

phần ñược chuyển ñến ñể nuôi phôi, một phầnbị tiêu hao do hoạt ñộng hô hấp

và phần lớn ñược sử dụng ñể chuyển hoá thành những chấtcao phân tử mới ở

các mô của cây nảy mầm Hoạt ñộng hô hấp trong hạt cần ñược cung cấpoxy

ñồng thời thải ra khí CO2 và toả nhiệt làm cho nhiệt ñộ của khối tăng lên, do

ñó cần phảichú ý tới ñảo trộn khối hạt

Hoạt ñộng của Enzyme : trong khối hạt, Enzyme ở dạng liên kết và

chúng ñượcchuyển sang trạng thái hoạt ñộng khi hạt nảy mầm Ngoài ra còn có

một số Enzyme ñượctổng hợp mới Các Enzyme hoạt ñộng trong quá trình nảy

mầm của hạt lúa

- α-Amylase : Enzyme này không hoàn toàn hoạt ñộng ở hạt chín Hoạt

tính củaEnzyme α-Amylase tăng dần trong quá trình nảy mầm của hạt Ở nhiệt

ñộ 15 - 170C, hoạt tínhcủa α-Amylase ñạt ñến cực ñại vào ngày thứ 10 – 12

của quá trình nảy mầm; Ở nhiệt ñộ 28 –300C, hoạt tính của α-Amylase ñạt cực

ñại vào ngày 5 – 8

- β-Amylase : Enzyme β-Amylase tồn tại ở dạng liên kết và một số ít

hoạt ñộng rấtyếu trong hạt chín hoàn toàn Hoạt ñộng này tăng nên trong quá

trình hạt nảy mầm Thời gianñể hoạt ñộng của Enzyme này ñạt ñến cực ñại

cũng tuỳ thuộc vào nhiệt ñộ

- Enzyme Oxy Hoá Khử: Trong quá trình nảy mầm , hoạt ñộng của các

ezyme nàytăng nên mạnh do ñó hoạt ñộng hô hấp của hạt cũng gia tăng Hoạt

ñộng hô hấp của hạt mạnhnhất vào ngày thứ 4–6 ở nhiệt ñộ 27 - 280C và cường

ñộ hô hấp phụ thuộc vào ñộ ẩm của hạt,nhiệt ñộ vào lượng O2 cung cấp

Phương pháp tinh sạch Amylase:

Có hai phương pháp

-Tinh sạch Enzyme Amylase bằng phương pháp sắc ký

- Thu nhận Enzyme Amylase bằng phương pháp ñiện di trên gel

polyacrylamide

(polyacrylamide Gel Electrophoresis – PAGE)

3 Thu nhận Enzyme từ vi sinh vật:

Nguồn thu nhận chủ yếu là : nấm mốc, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn…

Khi nuôi VSV tạo Amylase có hai quá trình liên quan mật thiết với nhau Quá

trình tổng hợp sinh khối VSV và quá trình tích tụ Enzyme trong tế bào hay

ngoài môi trường

Ở một số VSV, quá trình tổng hợp Amylase tiến hành song song với quá trình

sinh trưởng, nghĩa là sự tích tụ Enzyme phụ thuộc vào tuyến tính của sự tăng

khối

* Yêu cầu chung

Muốn thu nhận các Enzyme Amylase với hiệu suất cao cần phải tiến

hành phân lập, vàchọn giống VSV ñể tuyển lấy những chủng hoạt ñộng mạnh,

ñồng thời phải tiến hành lựachọn cơ chất cảm ứng và thành phần môi trường

tối thích cũng như tiêu chuẩn hoá các ñiềukiện nuôi Như vậy sự tổng hợp

Enzyme Amylase không những phụ thuộc vào tính chất ditruyền của VSV mà

còn phụ thuộc vào việc tuyển chọn các ñiều kiện nuôi ñặc hiệu

Ngoài các yếu tố hoá học (thành phần môi trường) ra, thì các ñiều kiện lý hoá

của quá trình nuôi cấy cũng có một ý nghĩa rất lớn ñối với sinh tổng hợp

Enzyme Amylase

Trong các yếu tố ảnh hưởng ñến sinh tổng hợp các Enzyme Amylase

trong quá trìnhnuôi VSV, thì thành phần môi trường , tính chất cơ lý của môi

trường, ñộ tiệt trùng, ñộ ẩmban ñầu, ñộ thoáng khí, nhiệt ñộ nuôi và pH môi

trường… Là những yếu tố cơ bản tối quantrọng

* Nuôi VSV tạo Amylase bằng phương pháp bề mặt:

• Yêu cầu ñối với môi trường thành phần dinh dưỡng

Yêu cầu cơ bản ñối với thành phần của môi trường nuôi VSV tạo

Amylase cũng giốngnhư yêu cầu ñối với môi trường nuôi VSV tạo Enzyme

khác là tính hoàn thiện Hầu hết cácVSV tạo Amylase ñều hấp thụ carbon chủ

yếu ở các dạng hợp chất hữu cơ (tinh bột,dextrin…), hyñro ở dạng H2O và của

các hợp chất hữu cơ, oxy ở trong thành phần cấu tử cơbản của môi trường và ở

dạng oxy phân tử

Cấu tử chính của môi trường VSV tạo Amylase bằng phương pháp lên men bề

mặt làcám mì, cám gạo Cám mì, cám gạo là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là

một cấu tử duy nhấtcủa môi trường ñể nuôi VSV không cần bổ sung thêm các

chất khác nữa Cám mì có 16 ÷22%, tinh bột, 10 – 12% protein, trong ñó các

amino acid quan trọng như methionine (0,19%),cystine (0,3%), arginine (1%),

lysine (6%), tryptophan (0,3%), 3 – 4% chất béo, 10,3%celulose, các nguyên tố

trơ (Na – 0.09% , K – 1% , Ca – 0.16% , P - 0.94% ) và các nguyên tốvi lượng

cùng các chất khác Cám gạo có khoảng 20% tinh bột 10 –15% chất béo, 10 –

14%protein, 8–16% celulose, các chất hoà tan không chứa nitơ (37 –5 9 %)

Chất lượng của cám gạo, cám mì có ảnh hưởng lớn tới hoạt lực của

enzyme Cámkhông ñược chứa tinh bột dưới 20 – 30% Nên dùng cám tốt, cám

mới không có vị chua hayvị ñắng, không hôi mùi mốc Độ ẩm của cám không

quá 15%, tạp chất ñộc không quá0,05% Tuy là phế liệu của công nghiệp xay

xát, nhưng cám cũng tương ñối ñắt tiền, hơnnữa trong quá trình nuôi VSV, các

chất dinh dưỡng không ñược sử dụng hết, vì thế có thểthay cám bằng một số