khảo sát ảnh hưởng của việc sử dụng chế phẩm enzyme amylase đến tốc độ thủy phân tinh bột trong quá trình lên men rượu nếp than

Khảo sát ảnh hưởng của việc sử dụng chế phẩm enzyme glucoamylase đến tốc độ thủy phân tinh bột trong quá trình lên men rượu nếp than được thực hiện thông qua 3 thí nghiệm sau: 1.. Nhằm k

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

LÊN MEN RƯỢU NẾP THAN

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Mã ngành: 08

Người hướng dẫn

Th.S BÙI THỊ QUỲNH HOA

NĂM 2007

Tôi kính gởi lòng biết ơn chân thành đến:

- Cha mẹ đã nuôi dạy, động viên khuyến khích và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho con trong suốt quá trình học tập cũng như trong cuộc sống

- Toàn thể quý Thầy Cô trường Đại Học Cần Thơ và đặc biệt là quý Thầy Cô trong Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu cho em trong suốt những năm tháng học tập tại trường

- Cô Bùi Thị Quỳnh Hoa đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

- Quý Thầy Cô phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ thực phẩm và thư viện Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp

- Các bạn lớp Công nghệ thực phẩm khóa 28 đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành đề tài luận văn tốt nghiệp của mình

Kính chúc tất cả quý Thầy Cô và các bạn thành đạt trong công việc và cuộc sống

Cần Thơ, ngày 28 tháng 05 năm 2007

Sinh viên thực hiện

ĐÀM THỊ HẢI YẾN

   

Trang

Lời cảm tạ i

Mục lục ii

Danh sách bảng v

Danh sách hình vii

Tóm tắt x

CHƯƠNG I ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Nguyên liệu dùng trong sản xuất rượu nếp than 2

2.1.1 Gạo nếp than 2

2.1.2 Bánh men thuốc bắc 2

2.1.3 Chế phẩm enzyme Amylase 5

2.1.4 Cồn tinh khiết 5

2.1.5 Nước 6

2.2 Vai trò của enzyme amylase trong sản xuất rượu nếp than 7

2.2.1 Cấu trúc phân tử enzyme amylase 7

2.2.2 Cơ chất tác dụng của enzyme amylase 8

2.2.3 Đặc tính và cơ chế tác dụng của enzyme amylase 9

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme amylase 12

2.3 Lý thuyết lên men rượu 15

2.3.1 Khái quát quá trình lên men rượu 15

2.3.2 Cơ sở lý luận của quá trình lên men rượu 16

2.4 Quy trình công nghệ sản xuất rượu nếp than 21

2.4.1 Qui trình sản xuất rượu nếp than 21

2.4.2 Thuyết minh qui trình 22

CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện nghiên cứu 24

3.1.1 Thời gian địa điểm 24

3.1.2 Nguyên vật liệu 24

3.1.3 Thiết bị - dụng cụ 24

3.1.4 Hoá chất sử dụng 25

3.2 Phương pháp nghiên cứu 25

3.2.1 Phương pháp lấy mẫu 25

3.2.2 Phương pháp phân tích 25

3.3 Nội dung và bố trí thí nghiệm 27

3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme glucoamylase bổ sung đến hiệu suất thu hồi rượu 27

3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến khả năng thuỷ phân của enzyme glucoamylase 29

3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát thời điểm bổ sung enzyme glucoamylase 30

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme glucoamylase bổ sung đến hiệu suất thu hồi rượu 32

4.1.1 Biến đổi hàm lượng chất khô hòa tan 32

4.1.2 Biến đổi pH 34

4.1.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến nồng độ rượu và hiệu suất thu hồi rượu 36 4.1.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến mật độ quang A (màu sắc) của sản phẩm 38

4.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhệt độ và pH đến khả năng thủy phân

của enzyme glucoamylase 40

4.2.1 Biến đổi hàm lượng chất khô hòa tan 40

4.2.2 Biến đổi pH 44

4.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến nồng độ rượu và hiệu suất thu hồi rượu ở tỷ lệ 0.3% enzyme 46

4.2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến mật độ quang A (màu sắc) của sản phẩm ở tỷ lệ 0.3% enzyme 49

4.2.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến cảm quan của sản phẩm ở tỷ lệ 0.3% enzyme 51

4.3 Khảo sát thời điểm bổ sung enzyme glucoamylase 52

4.3.1 Biến đổi hàm lượng chất khô hòa tan 52

4.3.2 Biến đổi pH 53

4.3.3 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung enzyme đến nồng độ rượu và hiệu suất thu hồi ở tỷ lệ enzyme 0,3%, nhiệt độ 35 - 380C và pH = 5,6 54

4.3.4 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung enzyme đến mật độ quang A (màu sắc) của sản phẩm ở tỷ lệ enzyme 0,3%, nhiệt độ 35 - 380C và pH = 5,6 57

4.3.5 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung enzyme đến cảm quan của sản phẩm ở tỷ lệ enzyme 0,3%, nhiệt độ 35 - 380C và pH = 5,6 59

CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 57

5.1 Kết luận 61

5.2 Đề nghị 62

Tài liệu tham khảo 63

trong vi khuẩn, malt đại mạch và nấm mốc 10 Bảng 5 Thống kê biến đổi hàm lượng chất khô hoà tan (độ Brix)

ở các tỷ lệ enzyme khác nhau 33 Bảng 6 Thống kê biến đổi pH ở các tỷ lệ enzyme khác nhau 34 Bảng 7 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến nồng độ rượu và hiệu suất thu hồi 36 Bảng 8 Thống kê ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme

đến mật độ quang A (màu sắc) của sản phẩm 38

Bảng 9 Thống kê ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến cảm quan của sản phẩm 39

Bảng 10 Thống kê biến đổi hàm lượng chất khô hòa tan (độ Brix)

ở tỷ lệ enzyme 0,3% theo nhiệt độ, pH và thời gian lên men 41 Bảng 11 Thống kê biến đổi pH ở tỷ lệ enzyme 0,3%

theo nhiệt độ, pH và thời gian lên men 44 Bảng 12 Thống kê ảnh hưởng của nhiệt độ và pH

đến nồng độ rượu ở tỷ lệ enzyme 0,3% 46 Bảng 13 Thống kê ảnh hưởng của nhiệt độ và pH

đến hiệu suất thu hồi rượu ở tỷ lệ enzyme 0,3% 47 Bảng 14 Thống kê ảnh hưởng của nhiệt độ và pH

đến thể tích dịch sau lên men ở tỷ lệ enzyme 0,3% 47

đến mật độ quang A (màu sắc)của sản phẩm ở tỷ lệ enzyme 0,3% 50

Bảng 16 Thống kê ảnh hưởng của nhiệt độ và pH

đến cảm quan của sản phẩm ở tỷ lệ 0,3% enzyme 51 Bảng 17 Biến đổi hàm lượng chất khô hòa tan (Brix) ở tỷ lệ enzyme 0,3%,nhiệt

độ 35 - 380C, pH = 5,6 theo thời điểm bổ sung enzyme và thời gian lên men 52 Bảng 18 Thống kê biến đổi pH ở tỷ lệ enzyme 0,3%, nhiệt độ 35 - 380C,

pH = 5,6 theo thời điểm bổ sung enzyme và thời gian lên men 54 Bảng 19 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung enzyme đến nồng độ rượu

và hiệu suất thu hồi ở tỷ lệ enzyme 0,3%, nhiệt độ 35 - 380C và pH = 5,6 55 Bảng 20 Thống kê ảnh hưởng của thời điểm bổ sung enzyme

đến mật độ quang A (màu sắc) của sản phẩm ở tỷ lệ enzyme 0,3%,

nhiệt độ 35 - 380C và pH = 5,6 58

Bảng 21 Thống kê ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến cảm quan của sản phẩm 59

DANH SÁCH HÌNH



   

Trang

Hình 1 Nấm men Saccharomyces cerevisiae 4

Hình 2 Cấu tạo tế bào nấm men Saccharomyces 4

Hình 3 Một số nấm mốc thường gặp 5

Hình 4 Sơ đồ phân loại enzyme amylase 7

Hình 5 Cấu tạo phân tử Amylose 9

Hình 6 Cấu tạo phân tử Amylopectine 9

Hình 7 Cơ chế tác dụng của enzyme α-amylase lên mạch tinh bột 10

Hình 8 Cơ chế tác dụng của enzyme β-amylase lên mạch tinh bột 11

Hình 9 Cơ chế cắt của enzyme amylase lên mạch tinh bột 12

Hình 10 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính enzyme 13

Hình 11 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng 13

Hình 12 Chất kìm hãm cạnh tranh 14

Hình 13 Chất kìm hãm không cạnh tranh 14

Hình 14 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng enzyme 15

Hình 15 Ảnh hưởng của pH đến tốc độ phản ứng enzyme 15

Hình 16 Qui trình công nghệ sản xuất rượu nếp than 22

Hình 17 Nguyên liệu dùng trong sản xuất rượu nếp than 24

Hình 18 Cân phân tích 25

Hình 19.Thiết bị đo pH 25

Hình 20.Thiết bị đo độ hấp thụ màu 25

Hình 21 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme glucoamylase bổ sung đến hiệu suất thu hồi rượu 28

đến khả năng thuỷ phân của enzyme glucoamylase 29 Hình 23 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời điểm bổ sung

enzyme glucoamylase đến khả năng thuỷ phân 31 Hình 24 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng chất khô hòa tan (độ Brix)

theo tỷ lệ enzyme và thời gian lên men 33 Hình 25 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi pH theo tỷ lệ enzyme và thời gian lên men 35 Hình 26 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến nồng độ rượu 36 Hình 27 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme

đến hiệu suất thu hồi rượu (ml rượu/100g gạo) 37 Hình 28 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme

đến mật độ quang A của sản phẩm 38 Hình 29 Sản phẩm ở các tỷ lệ enzyme khác nhau 40 Hình 30 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng chất khô hòa tan (độ Brix) ở tỷ lệ

enzyme 0,3% và nhiệt độ phòng thí nghiệm theo pH và thời gian lên men 41 Hình 31 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng chất khô hòa tan (độ Brix)

ở tỷ lệ enzyme 0,3% và nhiệt độ 35 - 380C theo pH và thời gian lên men 42 Hình 32 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng chất khô hòa tan (độ Brix)

ở tỷ lệ enzyme 0,3% và nhiệt độ 50 - 550C theo pH và thời gian lên men 42 Hình 33 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi pH ở tỷ lệ enzyme 0,3%

và nhiệt độ phòng thí nghiệm theo pH và thời gian lên men 44 Hình 34 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi pH ở tỷ lệ enzyme 0,3%

và nhiệt độ 35 - 380C theo pH và thời gian lên men 45 Hình 35 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi pH ở tỷ lệ enzyme 0,3%

và nhiệt độ 50 - 550C theo pH và thời gian lên men 45 Hình 36 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ và pH

Hình 37 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ và pH

đến hiệu suất thu hồi rượu ở tỷ lệ enzyme 0,3% 48 Hình 38 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ và pH

đến mật độ quang A của sản phẩm ở tỷ lệ enzyme 0,3% 50 Hình 39 Sản phẩm thu được ở các điều kiện nhiệt độ và pH khác nhau 52 Hình 40 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng chất khô hòa tan (độ Brix)

Với quy trình lên men rượu nếp than theo phương pháp cổ truyền thì đạt được hiệu suất thu hồi rượu không cao Do đó để cải tiến quy trình lên men rượu nếp than nhằm đạt được hiệu suất thu hồi rượu cao hơn, chúng tôi tiến hành bổ sung vào khối lên men enzyme glucoamylase có nguồn gốc từ vi sinh vật

Khảo sát ảnh hưởng của việc sử dụng chế phẩm enzyme glucoamylase đến tốc độ thủy phân tinh bột trong quá trình lên men rượu nếp than được thực hiện thông qua 3 thí nghiệm sau:

1 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme glucoamylase bổ sung đến hiệu suất thu hồi rượu

2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến khả năng thuỷ phân của enzyme glucoamylase

3 Khảo sát thời điểm bổ sung enzyme glucoamylase

Qua thời gian tiến hành nghiên cứu, kết quả đạt được như sau:

Ở tỷ lệ 0,3% enzyme cho kết quả tốt nhất: nồng độ rượu đạt 9,20, hiệu suất thu hồi đạt 29,2 (ml rượu/100g gạo), rượu có mùi thơm và hậu vị vừa phải nhưng chưa hoàn toàn hòa hợp

Ở tỷ lệ 0,3% enzyme khi kết hợp với các điều kiện nhiệt độ và pH thích hợp thì hiệu suất thu hồi rượu đã tăng lên đáng kể Ở nhiệt độ 35 - 380C và pH = 5,6 cho kết quả tốt: nồng độ rượu đạt được là 9,70, hiệu suất thu hồi đạt 31,9 (ml rượu/100g gạo), rượu có mùi thơm dịu, hậu tốt và hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm

Ở thời điểm bổ sung enzyme vào thời điểm 1 ngày sau đường hóa cho nồng độ

và hiệu suất thu hồi rượu cao: nồng độ rượu đạt được là 10,70, hiệu suất thu hồi đạt 37,2 (ml rượu/100g gạo), rượu có mùi thơm dịu, hậu vừa phải và đặc trưng cho sản phẩm

Từ các kết quả thu nhận được ta thấy khi tiến hành lên men rượu với điều kiện bổ sung 0,3% enzyme glucoamylase vào ngày thứ nhất, ở nhiệt độ 35 - 380C và pH = 5,6 thì sẽ đạt được hiệu suất thu hồi rượu cao hơn rất nhiều so với phương pháp lên men

cổ truyền là không có bổ sung enzyme

CHƯƠNG I ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Rượu cổ truyền từ lâu đã là niềm tự hào dân tộc của nhiều quốc gia trên thế giới

Người ta không chỉ biết đến hương vị độc đáo đặc trưng của nó, mà thông qua cách

thưởng thức rượu cổ truyền dân tộc có thể tìm về cội nguồn văn hóa của dân tộc mình

Ở Việt Nam rượu cổ truyền do các làng nghề và dân tự làm ra với sản lượng đáng kể

Nhiều làng nghề chuyên sản xuất rượu ngon nổi tiếng như rượu Làng Vân Bắc Giang,

rượu San Lùng Lào Cai, rượu Gò đen Tiền Giang, rượu nếp than của người Kinh…

Ngoài các rượu làng nghề có chất lượng cao thì phần lớn là rượu dân tự làm ra, do

trình độ công nghệ còn kém và thiết bị sản xuất thô sơ nên còn rất nhiều độc tố, tạp

chất có ảnh hưởng xấu tới sức khỏe của người tiêu dùng Mặt khác hiệu xuất thu hồi

rượu thấp, hao phí nguyên vật liệu lớn dẫn đến hiệu quả sản xuất chưa cao Nhằm kết

hợp hài hòa giữa công nghệ cổ truyền và kỹ thuật hiện đại để sản xuất những loại rượu

đặc sản có tính chất đặc trưng cho từng vùng, đề tài luận văn này sẽ tập trung nghiên

cứu việc ứng dụng chế phẩm enzyme amylase để đẩy nhanh tốc độ thuỷ phân tinh bột

trong quá trình lên men rượu nếp than - một loại rượu cổ truyền của dân tộc - nhằm

cải tiến công nghệ, nâng cao hiệu suất thu hồi và chất lượng rượu đặc sản làng nghề

Ở nước ta, nguồn nguyên liệu nếp than rất dồi dào, các nguyên liệu phụ khác như:

men thuốc bắc, cồn tinh khiết, enzyme amylase, … cũng được bán khá nhiều trên thị

trường Vì vậy, công tác nghiên cứu khảo sát qui trình sản xuất rượu nếp than dựa vào

nguồn nguyên liệu và những thiết bị sẵn có là rất thuận lợi Đồng thời qua đó tìm ra

được những phương pháp sản xuất tối ưu để góp phần nâng cao chất lượng rượu nếp

than để có thể sánh ngang hàng với các loại rượu nổi tiếng trên thế giới như: Martin,

Whisky, Brandy, Mao Đài, Sakê, Vodka, …

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Đề tài “khảo sát ảnh hưởng của việc sử dụng chế phẩm enzyme amylase đến tốc độ

thuỷ phân tinh bột trong quá trình lên men rượu nếp than” được thực hiện từ

nguyên liệu gạo nếp than, bánh men thuốc bắc và chế phẩm enzyme amylase dựa trên

qui trình sản xuất rượu nếp than cổ truyền với mục tiêu chính là nâng cao hiệu suất

thuỷ phân tinh bột để từ đó nâng cao hiệu suất thu hồi và chất lượng rượu nếp than

Đề tài tiến hành nghiên cứu với các mục tiêu nghiên cứu sau:

1 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme glucoamylase bổ sung đến hiệu suất thu hồi

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 NGUYÊN LIỆU DÙNG TRONG SẢN XUẤT RƯỢU NẾP THAN

2.1.1 Gạo nếp than

Gạo nếp than là một loại gạo đặc biệt được trồng nhiều ở vùng Nam Bộ vì thế rượu

nếp than là đặc sản của vùng Nam Bộ Gạo nếp than bao gồm 4 loại:

 Nếp cẩm Đức Hòa

 Nếp đen Khánh Vinh

 Nếp than Long Đất

 Lúa lứt nếp cẩm

Hiện nay, nếp than được phân loại dựa theo màu sắc của hạt gạo Theo cách phân loại

này, nếp than được phân ra thành hai loại:

 Nếp than đen huyền  Nếp than hồng đỏ

Các sắc tố của nếp than rất dễ tan trong nước, vì thế sản phẩm rượu sẽ mang đặc trưng

màu của loại gạo làm ra nó

Tuy khác nhau về màu sắc bên ngoài, nhưng các loại gạo nếp than có thành phần hóa

học không sai biệt nhau nhiều

Bảng 1 Thành phần hóa học của gạo nếp than

(Ngu ồn: Lượng, 2004)

Gạo nếp than chứa hàm lượng tinh bột rất cao, phù hợp với ngành công nghiệp sản

xuất rượu bằng phương pháp cổ truyền Thành phần tinh bột chủ yếu trong gạo nếp

than được cấu tạo từ amylopectin (gần như 100%) và một ít amylose

Ngoài ra trong gạo nếp than còn chứa một lượng nhỏ các chất khác như muối khoáng,

chất béo, protit, …

2.1.2 Bánh men thuốc bắc

Nguyên liệu chính để sản xuất men thuốc bắc là: bột gạo, men giống, các vị thuốc bắc

Bánh men thuốc bắc phải đảm bảo một số yêu cầu cơ bản sau:

 Phải có vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme amylase

 Có chứa nhiều giống vi sinh vật thuộc vi khuẩn, nấm men, nấm mốc (nấm sợi) có

khả năng chuyển hóa đường thành rượu

 Có các loài vi sinh vật có khả năng tạo hương thơm cho quá trình lên men

Việc cho thuốc bắc vào bánh men rượu có 2 tác dụng: tạo hương trong sản phẩm và

ức chế sự phát triển của các vi sinh vật không có ích

Thành phần hóa học của các vị thuốc bắc có thể chia làm hai nhóm: nhóm các chất

độn và nhóm hoạt chất Nhóm các chất độn gồm nước, muối vô cơ, carbohydrate

(đường, tinh bột), chất béo (dầu mỡ, sáp), protein, diệp lục tố và các sắc tố, … Nhóm

hoạt chất bao gồm các acid hữu cơ, acid vô cơ, tinh dầu, ancaloit, chất nhựa (resine),

glucoside, tanin, flavon, vitamin, các men, hocmon, …

Các chất trong nhóm hoạt chất phần lớn tác động đến hệ thần kinh, hệ tuần hoàn, hệ

hô hấp, hệ nội tiết của động vật Một số chất như tinh dầu, phenol, ancaloit, chất nhựa

còn có tính kháng sinh như sinnamic aldehyde, eugenol, menthol, thymol, vanillin, …

Thuốc bắc gồm 20 vị, trong đó có 6 vị chính, được nghiền mịn trộn lẫn với bột và men

giống Trong đó có khoảng 17 vị thuốc bắc có ảnh hưởng tốt đến sự phát triển sinh

khối của nấm mốc Aspergillus niger và nấm men Saccharomyces cerevisiae như quế

khâu, tiểu hồi, cam thảo, bạch truật, nhục đậu khấu, Một số vị thuốc có chứa hàm

lượng chất kháng sinh thực vật khá cao như tinh dầu quế chứa 95% cinnamic

aldehyde, tinh dầu đinh hương chứa 85% eugenol, tinh dầu bạc hà chứa 50% menthol,

tinh dầu tiểu hồi chứa 70% anethol Một số vị khác chứa hàm lượng chất dinh dưỡng

đáng kể như nhục đậu khấu chứa 40% chất béo, cam thảo chứa 8% glucose, 6%

saccarose, 30% tinh bột, … Sự phối hợp các vị thuốc đó có tác động mạnh hơn từng vị

thuốc đơn lẻ, các vị thuốc này cũng có ảnh hưởng đến năng suất rượu

Hệ vi sinh vật có trong bánh men thuốc bắc gồm có các loài nấm mốc như mucor và

rhizopus, các loài nấm men như saccharomyces và candida, các loài vi khuẩn có khả

năng sinh tổng hợp enzyme amylase và tạo hương Như vậy bánh men thuốc bắc là

một hỗn hợp vi sinh vật, ở đó có sự cộng tác tương hỗ trong quá trình lên men Ở đây

đồng thời xảy ra một loạt quá trình sinh hóa khác nhau khi lên men như: quá trình

tăng sinh khối, quá trình đường hóa, quá trình rượu hóa

 Hệ vi sinh vật trong bánh men thuốc bắc

Nấm men

Nấm men là tác nhân chuyển hóa đường thành rượu etylic Có cấu tạo đơn bào, sinh

sản bằng cách nảy chồi và phân cắt Đa số thường có hình oval, hình cầu, hình bầu

dục Kích thước của tế bào nấm men thường từ khoảng 3 - 3,5 x 10 µm

Nấm men tự nó không chuyển động được, trong môi trường nó chuyển động được là

nhờ sự xáo trộn của dịch lên men do CO2 bị thoát ra ngoài Nhiệt độ thích hợp cho

nấm men hoạt động từ 15 - 350C, cao hơn 500C nấm men sẽ bị chết pH hoạt động khá

rộng từ 2 - 8, pH tối thích là 4,5 - 5 Khi có O2, nấm men sẽ tăng sinh khối nhanh

chóng Khi không có O2, nấm men sẽ chuyển đường thành rượu Các loại nấm men sử

dụng trong sản xuất rượu phải là các loại nấm men ngoài việc tạo ra rượu còn tạo ra

một số sản phẩm khác góp phần tạo hương vị thơm ngon và đặc trưng của rượu

Trong mỗi gam bánh men thuốc bắc có từ vài chục triệu đến vài trăm triệu tế bào nấm

men Chúng gồm hai chi khác nhau:

Endomycopsis

Endomycopsis fibulligenes là loài nấm men rất giàu enzyme amylase, glucoamylase

Do đó chúng vừa có khả năng đường hóa, vừa có khả năng rượu hóa

Saccharomyces

Saccharomyces cerevisae: đây là loại lên men nổi, kỵ khí không bắt buộc, chúng có

khả năng hô hấp và lên men Có khả năng lên men rất nhiều loại đường khác nhau như

glucose, saccharose, maltose, fructose, raffinose, galactose Chúng có khả năng lên

men được ở nhiệt độ cao (khoảng từ 36 - 400C), có khả năng chịu được độ acid

Đặc biệt chúng có khả năng chịu được thuốc sát trùng Na2SiF6 với nồng độ 0,02 -

0,025% Đặc điểm này rất thuận lợi cho lên men khi cần phải sử dụng thuốc sát trùng

Đặc điểm quan trọng hơn hết là loài nấm men này có khả năng lên men các loại

nguyên liệu rất khác nhau như gạo, ngô, khoai, sắn, với lượng đường trong dung dịch

từ 12 - 14% có khi 16 - 18% Nồng độ rượu trong dung dịch lên men là 10 - 12 %

Nhiệt độ lên men thích hợp là 28 - 320C

Ngoài ra trong men thuốc bắc còn thấy nhiều loài nấm men dại khác nhau Chúng vừa

có khả năng thủy phân tinh bột, vừa có khả năng chuyển đường thành cồn, tuy rằng sự

chuyển hóa này còn thấp Điều đặc biệt là các loài nấm men dại này chịu nhiệt rất cao,

có khi lên tới 60 - 650C và chịu được chất sát trùng ở nồng độ 0,05 - 1%

Nấm mốc (nấm sợi)

Có cấu tạo sợi, chúng thuộc loại thực vật hạ đẳng, có bào tử, không có diệp lục tố,

không có khả năng tổng hợp các chất hữu cơ từ khí CO2 mà sử dụng trực tiếp các chất

hữu cơ sẵn có trong môi trường để phát triển và đảm bảo hoạt động sống bình thường

Nấm mốc chỉ mọc tốt trong môi trường có nhiều không khí và ẩm Vì vậy thường phát

triển trên bề mặt cơ chất dưới dạng những lớp lún phún hình sợi, lớp màng nhện hay

khối sợi bông Trong cơ chất chúng phát triển trong các khoang hổng chứa không khí

Nấm mốc có khả năng sinh ra các enzyme amylase, đặc biệt là α-amylase và

amyloglucosidase có khả năng thủy phân tinh bột tạo ra đường chủ yếu là glucose

Nguồn tinh bột ban đầu được hồ hóa bằng cách nấu hay hấp, sau đó dịch hóa bằng

α-amylase, đường hóa bằng amyloglucosidase

Trong bánh men thuốc bắc có rất nhiều loài mốc khác nhau thuộc Aspergillus,

Penicillium, Mucor, Rhizopus Trong đó Mucor và Rhizopus phát triển nhiều hơn cả

Loài Mucor, đặc biệt là Mucor rouxi có nhiều đặc tính rất quí như khả năng chịu nhiệt

độ cao (32-350C), chúng vừa có khả năng đường hóa và vừa có khả năng rượu hóa

Hình 3 Một số nấm mốc thường gặp

Vi khuẩn

Trong bánh men thuốc bắc có nhiều loài vi khuẩn phát triển Trong đó thấy chủ yếu là

các loài vi khuẩn lactic và vi khuẩn acetic Đây là các loài vi khẩn thường làm chua

môi trường Thời gian đầu của quá trình lên men, quá trình này xảy ra là có lợi vì rằng

pH môi trường do chúng tạo ra sẽ thích hợp cho nấm men và nấm sợi phát triển Tuy

nhiên pH xuống quá thấp lại ảnh hưởng xấu cho quá trình lên men Mặt khác nếu

trong dịch lên men có mặt của O2 thì vi khuẩn acetic sẽ oxy hóa rượu thành axit

acetic Quá trình này làm tổn hao lượng cồn tạo thành

2.1.3.Chế phẩm enzyme Amylase

Amylase là enzyme rất thông dụng, được dùng nhiều trong công nghệ thực phẩm

Enzyme này làm nhiệm vụ thủy phân tinh bột thành các phân tử đường đơn giản như

glucose, maltose, … gồm có α-amylase, β-amylase và glucoamylase Do đó việc bổ

sung chế phẩm enzyme amylase vào dịch đường hóa thì sẽ làm tăng cao hiệu suất thủy

phân Chế phẩm enzyme amylase có thể được sản xuất từ những hạt ngũ cốc nảy

mầm (thóc, ngô, đại mạch, tiểu mạch, lúa mì, …) và từ quá trình nuôi cấy vi sinh vật

Tùy theo nguồn chế phẩm enzyme amylase bổ sung vào mà hiệu suất thủy phân và

đặc tính tác dụng sẽ khác nhau Chẳng hạn như: α-amylase của nấm mốc và vi khuẩn

có nhiều đặc tính khác nhau như độ pH tối ưu của nấm mốc là 4,7 - 4,9 còn của vi

khuẩn là 5,9 - 6,1, nhiệt độ tối ưu của α-amylase nấm mốc là 55 - 660C và khả năng

chịu nhiệt là 700C trong khi đó nhiệt độ tối ưu của α-amylase vi khuẩn là 60 - 750C và

khả năng chịu nhiệt là 900C Tuy nhiên hoạt tính enzyme sinh ra từ nấm mốc và vi

khuẩn đều tương đương nhau nhưng khả năng đường hóa của enzyme amylase nấm

mốc khá hơn enzyme amylase vi khuẩn, ngược lại khả năng dịch hóa (tạo dextrin) của

enzyme amylase vi khuẩn lại cao hơn enzyme amylase nấm mốc

2.1.4.Cồn tinh khiết

Trong quá trình lên men rượu nếp than, lượng cồn tạo được chỉ khoảng 7 - 10% Với

nồng độ rượu này là thấp và rất dễ dàng bị oxy hóa tiếp (oxy hóa sinh học và oxy hóa

hóa học) để tạo CO2 và nước Do đó sau khi lên men xong phải cho thêm một lượng

cồn tinh khiết nhất định vừa để nâng cao hàm lượng cồn trong rượu, vừa tránh khả

năng oxy hóa rượu bởi vi khuẩn acetic

Cồn được dùng để pha thêm trong rượu nếp than là loại cồn thực phẩm có độ tinh sạch

cao và phải đạt được một số chỉ tiêu sau:

Rhizopus

Mucor Aspergillus

 Trong suốt, không màu và mùi lạ

Tiêu chuẩn của nước trong công nghiệp sản xuất rượu có yêu cầu chất lượng giống

như nước dùng trong sinh hoạt, nghĩa là: có độ cứng không quá 7mg đương lượng/lít,

trong suốt, không màu, không mùi

Bảng 2 Giới hạn hàm lượng muối trong nước

Ion Hàm lượng (mg/l) Ion Hàm lượng (mg/l)

 Không có hoặc chỉ có rất ít các muối kim loại nặng như: Hg2+, Ba2+

 Khả năng oxy hóa 1 lít nước không quá 2 ml dung dịch KMnO4 (0.01N)

 Chất cặn không vượt quá 1000mg/l

 pH kiềm không thích hợp cho quá trình nấu nguyên liệu, có khả năng tạo điều

kiện thuận lợi cho vi sinh vật gây hại phát triển và thúc đẩy quá trình tạo thành

glycerin trong quá trình lên men

 Muối CaSO4, MgCl2, NaCl với lượng từ 300 - 400 mg/l thích hợp cho hoạt động

của enzyme amylase, lượng đường khử tăng lên nhưng độ thuần khiết của dung dịch

đường lại giảm

 Muối sulfat (CaSO4, MgSO4) 400 - 800 mg/l sẽ làm tăng lượng đường không lên

men, làm giảm tốc độ đường hóa và lên men

 Muối CaCO3, MgCO3, Fe2+, Fe3+ với lượng 400 mg/l, muối Nitrat 400 mg/l và

muối Nitơ 200 mg/l sẽ ảnh hưởng không tốt đến quá trình lên men

 NH3 với lượng ít hơn 20 mg/l lại có tác dụng làm tăng hiệu suất lên men Hàm

lượng lớn hơn thì lại không cho phép

 Các muối Nitrat, Nitric, Photphat và Silicat với lượng nhỏ hơn 200 mg/l không

ảnh hưởng đến quá trình đường hóa Muối Bicacbonat với lượng không quá 200 - 400

mg/l không ảnh hưởng đến sự đường hóa, nhưng lượng lớn hơn ảnh hưởng rõ rệt đến

enzyme amylase

 Chỉ tiêu E Coli < 20 tế bào/lít

2.2 VAI TRÒ CỦA ENZYME AMYLASE TRONG SẢN XUẤT RƯỢU NẾP

THAN

Enzyme amylase thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác sự phân giải các liên kết

glucoside nội phân tử trong các polysaccharide với sự tham gia của nước Enzyme

amylase thủy phân tinh bột, glycogen và các dextrin thành glucose, maltose và dextrin

mạch ngắn

2.2.1 Cấu trúc phân tử enzyme amylase

a Thành phần cấu tạo

Enzyme amylase thuộc loại hydrolase chỉ là những phân tử protein thuần, nghĩa là sản

phẩm của sự phân giải enzyme này hoàn toàn chỉ gồm toàn những acid amin Vì vậy

chúng thuộc loại enzyme đơn giản

Hiện nay, người ta biết có 6 loại enzyme amylase trong đó α-amylase, β-amylase,

γ-amylase (hay glucoγ-amylase) thủy phân các liên kết α-1,4-glucoside của tinh bột,

glycogen và các polysaccharide cùng loại Các enzyme amylase còn lại như:

dextrin-6-glucanhydrolase, amylopectin-6-glucanhydrolase và oligodextrin-6-glucanhydrolase

thủy phân các liên kết α-1,6-glucoside Sáu loại này xếp thành hai nhóm:

 Endoamylase (enzyme nội phân): gồm α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh

 Exoamylase (enzyme ngoại phân): gồm có β-amylase và γ-amylase

Hình 4 Sơ đồ phân loại enzyme amylase

b Trung tâm hoạt động của enzyme

Enzyme amylase nói riêng hay tất cả các enzyme nói chung đều là loại protein đặc

biệt Ngoài cấu trúc giống như cấu trúc bình thường của một protein, enzyme còn có

cấu trúc rất đặc biệt liên quan đến hoạt động của enzyme Không phải toàn bộ enzyme

tham gia vào hoạt động xúc tác mà chỉ có những bộ phận rất đặc biệt mang tính đặc

hiệu trong phân tử protein của enzyme mới tham gia xúc tác phản ứng Bộ phận đặc

hiệu này được gọi là trung tâm hoạt động của enzyme

Amylase

Exoamylase

dextrin-6-glucanhydrolase

Khử gián tiếp Khử trực tiếp

Enzym khử nhánh γ-amylase

Endoamylase

và amylopectin-6-glucanhydrolase oligodextrin-6-glucanhydrolase

Đối với enzyme amylase trung tâm hoạt động của nó thường là những nhóm chức

như: - NH2, - COOH, - SH, … Ngoài ra để thực hiện được chức năng của mình

enzyme amylase còn phải qua vai trò trung gian của phân tử H2O

c Tính đặc hiệu của enzyme

Tính đặc hiệu biểu hiện khả năng xúc tác của enzyme đối với cơ chất nhất định Mỗi

enzyme đều có tác dụng chọn lọc đối với một cơ chất hoặc một loại cơ chất nhất định

và đối với một phản ứng hóa học nhất định Do cấu trúc hóa lý đặc biệt của enzyme và

đặc biệt là trung tâm hoạt động mà enzyme có tính chất đặc hiệu rất cao so với các xúc

tác thông thường khác

Đặc hiệu kiểu phản ứng: mỗi enzyme chỉ có thể xúc tác cho một kiểu phản ứng

chuyển hóa nhất định trong các kiểu phản ứng oxy hóa khử, phản ứng chuyển vị, phản

ứng thủy phân, …

Đặc hiệu cơ chất: khi tham gia các phản ứng, các loại cơ chất phải được gắn vào trung

tâm hoạt động thích hợp và không phải cơ chất nào cũng có khả năng tiếp cận với

trung tâm hoạt động của enzyme

2.2.2 Cơ chất tác dụng của enzyme amylase

Cơ chất tác dụng của enzyme amylase là tinh bột và glycogen

a Tinh bột

Tinh bột thuộc nhóm carbohydrate có chủ yếu trong các loại củ như: khoai lang, khoai

mỳ, … và trong các loại ngũ cốc, các loại hạt và có công thức tổng quát là (C6H12O6)n

Tinh bột từ mọi nguồn khác nhau đều cấu tạo từ amylose và amylopectin Các loại

tinh bột giống nhau về thành phần nhưng tỉ lệ amylose và amylopectin khác nhau Tỉ

lệ giữa hai loại polysaccharide trong một số loại hạt được trình bày trong bảng 3

Bảng 3 Tỉ lệ amylose và amylopectin của các loại hạt

Tỉ lệ (%) Tinh bột

(Tú, Lê Ng ọc 2003 Luận văn tốt nghiệp Trường ĐHCT)

Tuy có sự khác biệt như vậy nhưng đa phần tinh bột đều chứa khoảng 20-30%

amylose và 70 - 80% amylopectin

 Amylose: được cấu tạo từ những gốc glucose (C6H10O5) và liên kết với nhau bởi

nối α-1,4-glucoside nên tạo thành mạch thẳng Số gốc glucose trong phân tử amylose

có thể từ 200-1000 và tương ứng với phân tử lượng 34200-162000

Amylose dễ tan trong nước nóng và tạo nên độ nhớt của dung dịch Nó hầu như không

có khả năng khử vì trong mỗi phân tử amylose chỉ có một nhóm aldehyde tự do

 Amylopectin: cấu tạo từ những gốc glucose nhưng ngoài các nối α-1,4, trong

phân tử amylopectin có gốc glucose còn nối với nhau bởi các nối α-1,6 thường rất ít

so với nối α-1,4 nhưng rất bền Mạch chính của amylopectin có khoảng 400 - 2000

gốc glucose, các mạch nhánh bao gồm 15 - 18 gốc và cách đều 8 - 9 gốc Tùy theo

loại nguyên liệu, số gốc glucose trong phân tử amylopectin có thể từ 600 - 6000,

tương đương với phân tử lượng 96120 - 961200

Tinh bột là chất keo háo nước điển hình nhưng không hòa tan trong nước lạnh, trong

rượu và ete Trong nước nóng sẽ hút nước, trương nở và tạo dạng gel Mức độ trương

nở phụ thuộc vào nhiệt độ Khi tăng nhiệt độ (60 - 850C), dịch tinh bột sẽ biến thành

dạng keo Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân do liên kết

glucoside bị phân giải Sự thủy phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra theo hai mức

độ: dịch hóa và đường hóa Kết quả của sự dịch hóa là tạo ra sản phẩm trung gian

dextrin, khi dextrin tiếp tục bị đường hóa thì sản phẩm sẽ là maltose và glucose

b Glycogen

Glycogen (tinh bột động vật) là chất dự trữ đối với mọi cơ thể cũng như một số nấm

men và vi khuẩn Nó được cơ thể chuyển hóa và sử dụng từ từ Enzyme amylase có

vai trò quan trọng trong sự chuyển hóa glucide ở tế bào động vật và vi sinh vật

Glycogen có cấu tạo nhánh và có công thức chung là (C6H10O5)n Nó được cấu tạo từ

các gốc glucose liên kết với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside, ở vị trí phân nhánh

glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,6-glucoside Glycogen có sự phân nhánh nhiều

hơn amylopectin của tinh bột, có phân tử lượng khoảng 2 - 3 triệu

2.2.3 Đặc tính và cơ chế tác dụng của enzyme amylase

a α-amylase

Đặc tính α-amylase

Trong phân tử α-amylase có ít nhất một ion Ca2+ có tác dụng làm bền cấu trúc bậc 2, 3

của phân tử enzyme, α-amylase khá giàu tyrosine, tryptophan nhưng ít methionine

α-amylase sẽ hoàn toàn mất hết khả năng thủy phân cơ chất nếu bị loại bỏ hết ion

Ca2+ Chúng được hoạt hóa bởi ion đơn trị nếu có nguồn gốc động vật và vi sinh vật

Nếu có nguồn gốc thực vật thì được hoạt hoá bởi ion hóa trị II Hoạt hoá bởi ion hoá

trị I như sau: Cl->Br->I- Chúng bị kìm hãm bởi ion kim loại nặng như Cu2+, Hg2+, …

Protein của α-amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline Vì vậy, nó kém

bền trong môi trường acid nhưng khá bền nhiệt (bền nhất trong hệ enzyme amylase)

Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống

nhau Nhiệt độ, pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ malt khác với vi sinh vật

Bảng 4 Khả năng chịu nhiệt của enzyme amylase trong vi khuẩn, malt đại mạch và nấm mốc

Nguồn gốc Nhiệt độ tối thích pH tối thích

(Ngu ồn: Hoa, 2006)

Cơ chế tác dụng của α-amylase

α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside của cơ chất một cách

ngẫu nhiên và là enzyme nội, α-amylase không chỉ có khả năng thủy phân hồ tinh bột

mà còn thủy phân cả những hạt tinh bột còn nguyên vẹn

 Sự thủy phân tinh bột của α-amylase trải qua nhiều giai đoạn

 Giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): tinh bột bị thủy phân thành các dextrin

phân tử lượng thấp Độ nhớt của hồ tinh bột giảm dần

 Giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): dextrin tiếp tục bị thủy phân tạo thành các

tetra và trimaltose, disaccharide và monosaccharide

Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh tạo thành

oligosaccharide gồm 6 - 7 gốc glucose, sau đó các mạch này bị phân cắt dần và bị

phân giải chậm đến maltose Sau thời gian thủy phân amylose, sản phẩm bao gồm

87% maltose và 13% glucose

Dưới tác dụng của amylase, amylopectin bị phân giải khá nhanh nhưng vì

α-amylase không cắt được liên kết α-1,6-glucoside nên dù có kéo dài thời gian thủy

phân nhưng sản phẩm sau cùng có khoảng 72% maltose, 19% glucose, dextrin phân tử

thấp và izomaltose là 8%

Sản phẩm do α-amylase tạo thành gồm dextrin, đường maltose và một ít đường khử

a, Cơ chế tác dụng của enzym α-amylase lên mạch amylose

b, Cơ chế tác dụng của enzym α-amylase lên mạch amylopectin

b β-amylase

Đặc tính β-amylase

β-amylase là một loại albumin Tâm xúc tác của nó chứa gốc – SH, - COOH cùng với

vòng imidazol của các gốc histidin

β-amylase chỉ phổ biến trong thực vật đặc biệt có nhiều trong hạt nảy mầm Trong vi

khuẩn không có β-amylase

β-amylase rất bền khi không có ion Ca2+, bị kìm hãm bởi ion kim loại nặng như: Cu2+,

Hg2+, ure, iod, ozon, …

β-amylase bị vô hoạt ở 700C

Cơ chế tác dụng của β-amylase

β-amylase là một enzyme ngoại phân Tiến trình phân giải bắt đầu từ đầu không khử

của các nhánh ngoài cùng của cơ chất β-amylase cắt liên kết α-1,4-glucoside nhưng

khi gặp liên kết α-1,4-glucoside đứng kế cận α-1,6-glucoside thì nó ngưng tác dụng

Phần saccharide còn lại là dextrin phân tử lớn, có chứa nhiều liên kết α-1,6-glucoside

và được gọi là β-dextrin có màu tím đỏ với iod

β-amylase phân giải 100% amylose thành maltose, phân giải 54 - 58% amylopectin

thành maltose Sản phẩm tạo thành là đường maltose nên β-amylase còn được gọi là

enzyme đường hóa

Tác dụng của β-amylase lên tinh bột như sau:

Tinh bột Maltose (54-58%) + β-dextrin (42-46%)

Nếu tế bào bị thủy phân đồng thời bởi cả α-amylase và β-amylase thì lượng tinh bột

sẽ bị thủy phân 95% Cả hai enzyme này đều không cắt được nối α-1,6-glucoside

trong phân tử tinh bột Kết quả tác dụng của α-amylase và β-amylase ta thu được dịch

đường gồm 78 - 80% maltose và glucose, 20 - 22% là dextrin chứa tất cả các nối

α-1,6-glucoside

Hình 8 Cơ chế tác dụng của enzyme ββββ-amylase lên mạch tinh bột

a, Cơ chế tác dụng của enzyme β-amylase lên mạch amylose

b, Cơ chế tác dụng của enzyme β-amylase lên mạch amylopectin

β-amylase

c γ-amylase (Glucoamylase hay amyloglucosidase)

Đặc tính γγγγ-amylase

Đa số glucoamylase có hoạt lực cao nhất ở vùng pH = 3,5 - 5,5 và nhiệt độ 500C Nó

bền với acid hơn β-amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, aceton và không bền với

ion kim loại nặng: Cu2+,Hg2+, Có trong nấm mốc và một vài loại vi khuẩn Nó có

giá trị đặc biệt trong sản xuất rượu, chuyển những dextrin có phân tử cao không lên

men thành những hợp chất lên men được và do đó nâng cao được hiệu suất nấu rượu

từ các nguyên liệu là tinh bột

Enzyme này chứa nhiều trong một số nấm mốc như: A.usamii, A.niger, A.awamori,

Rhizopus delamar và nấm men Endomycopsip, … Enzym này có nhiều tên gọi khác

nhau như: α-1,4:1,6-glucan-4:6-glucohydrolase, glucoamylase, amyloglucosidase,

takaamylase β, γ-amylase, maltulase, … Glucoamylase là enzym ngoại bào exoenzym

Cơ chế tác dụng của γγγγ-amylase

Glucoamylase không chỉ có khả năng phân cắt nối α-1,4-glucoside mà còn phân cắt

được cả nối α-1,6-glucoside và biến 100% tinh bột thành đường glucose Khi thủy

phân liên kết α-1,4-glucoside trong chuỗi polysaccharide, glucoamylase tách lần lượt

từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo ra glucose Chúng không

thuỷ phân được các dextrin vòng

Ngoài các liên kết α-1,4-glucoside và α-1,6-glucoside, glucoamylase còn có khả năng

thủy phân các liên kết α-1,2-glucoside và α-1,3-glucoside

Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, amylopectin,

dextrin, panose, isomaltose và maltose thành glucose mà không cần có sự tham gia

của các loại enzyme amylase khác Glucoamylase thủy giải các polysaccharide có

phân tử lớn nhanh hơn so với các chất có phân tử nhỏ Các polysaccharide có nhánh

như amylopectin, glucogen, β-dextrin bị glucoamylase thủy phân khá nhanh

Hình 9 Cơ chế cắt của enzyme amylase lên mạch tinh bột

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme amylase

a Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính enzyme amylase

Cơ chế tác dụng của enzyme amylase vào cơ chất trải qua ba giai đoạn:

E + S ES P + E

Trong đó: E: Enzyme; S: cơ chất; P: sản phẩm

 Giai đoạn 1: enzyme sẽ tương tác

với cơ chất để tạo thành phức hợp

enzyme - cơ chất ES

 Giai đoạn 2: phức hợp enzyme - cơ

chất sẽ được tách ra

 Giai đoạn 3: enzyme sẽ được giải

phóng và hoạt động tự do, cơ chất sẽ

chuyển thành sản phẩm

Hiện tượng trên được xem xét trên cơ sở

phản ứng chỉ có một cơ chất duy nhất Ở

trường hợp này sẽ xảy ra ba giai đoạn khác biệt:

1- Ở giai đoạn đầu, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng (V) phụ thuộc tuyến

tính với nồng độ cơ chất

2- Ở giai đoạn kế tiếp, tốc độ phản ứng cực đại và nó hoàn toàn không phụ thuộc vào

nồng độ cơ chất

3- Ở giai đoạn tiếp theo, nếu nồng độ cơ chất vượt qua ngưỡng cực đại của tốc độ

phản ứng thì tốc độ phản ứng không có khả năng tăng theo Ở giai đoạn này các

enzyme đã bão hoà cơ chất do đó nó không thể có tốc độ phản ứng cao hơn được

b Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

amylase đến tốc độ phản ứng

Trong trường hợp thừa cơ chất, nồng độ

enzyme tăng sẽ làm tăng tốc độ phản

c Ảnh hưởng của các chất kìm hãm đến hoạt tính enzyme amylase

Trong các phản ứng enzyme, một số chất như những ion kim loại, các chất vô cơ,

hữu cơ, … có khả năng kìm hãm tốc độ phản ứng enzyme Các chất này có thể kìm

hãm thuận nghịch hay không thuận nghịch, làm yếu hoặc chấm dứt hoàn toàn tác dụng

của enzyme nhưng lại không bị enzyme làm thay đổi tính chất hoá học, cấu tạo hoá

học và tính chất vật lý của chúng, …

Nhóm các chất kìm hãm cạnh tranh

Các chất kĩm hãm (I) cạnh tranh thường có cấu trúc không gian tương tự cấu trúc

không gian của cơ chất (S) Do đó, chúng có khả năng kết hợp với enzyme (E) ở trung

tâm hoạt động của enzyme Kết quả là một số chỗ kết hợp cần thiết ở enzyme bị chất

kìm hãm chiếm mất Do đó cơ chất mất một phần khả năng tương tác, làm cho tốc độ

phản ứng không tăng Phản ứng cạnh tranh có thể biểu thị như sau:

Tốc độ phản ứng

E + I EI

E + S ES E + P

Nhóm các chất kìm hãm không cạnh

tranh

Các chất kìm hãm không cạnh tranh tham gia kết hợp với enzyme ở một vị trí không

phải trung tâm hoạt động của enzyme, mà là ở một vị trí ngoài trung tâm hoạt động

của enzyme Người ta còn gọi vị trí này là trung tâm kìm hãm của enzyme

Khi chất kìm hãm kết hợp với enzyme ở vùng ngoài trung tâm hoạt động của enzyme

sẽ làm thay đổi cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động của enzyme Như vậy

phức hợp này sẽ làm thay đổi theo hướng không có lợi cho hoạt động xúc tác của

enzyme, chúng sẽ làm giảm tốc độ phản ứng của enzyme

Sau khi kết hợp với chất kìm hãm để tạo thành phức hợp EI, chúng vẫn có khả năng

kết hợp với cơ chất để tạo thành một

phức hợp EIS như phản ứng sau:

E + S = ES E + P

E + I = EI

ES + I = EIS

EI + S = EIS

Kiềm hãm bởi sản phẩm của phản ứng

Các sản phẩm được tạo thành do các phản ứng enzyme tham gia có thể trở thành chất

kìm hãm tốc độ của chính phản ứng đó

Thí dụ: nếu có một phản ứng kiểu:

S1 + S2 = P1 + P2

Do tính thuận nghịch của phản ứng trên, các enzyme có ái lực với P1 và P2 tương

đương với S1 và S2 Trong trường hợp như thế P1 + P2 được coi như chất kìm hãm với

Nếu có cơ chất thứ hai tham gia vào và nó có khả năng đính vào một vị trí nào đó trên

phức hệ ES (ngoài vùng xúc tác) làm cho chúng không hoạt động, khi đó phức hệ này

được coi như chất kìm hãm

ES + S = ESS

d Ảnh hưởng của các chất hoạt hoá đến hoạt tính enzyme amylase

Chất hoạt hoá là những chất có tac dụng làm cho enzyme amylase từ trạng thái không

hoạt động hoặc hoạt động yếu trở nên mạnh hơn

Hình 12 Chất kìm hãm cạnh tranh

Hình 13 Chất kìm hãm không cạnh tranh

Các chất hoạt hoá enzyme có thể là các anion, các ion kim loại ở ô thứ 11 đến ô thứ 55

trong bảng tuần hoàn Mendeleev, các chất hữu cơ có cấu trúc phức tạp làm nhiệm vụ

chuyển hydro, các chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phần tử tiền enzyme,

các chất có khả năng phục hồi nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme

e Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme amylase

Bản chất enzyme là protein Do đó, nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến cấu trúc của

chúng Tốc độ của phản ứng enzyme chỉ

có thể tăng ở giới hạn nhiệt độ nào đó

khi mà protein chưa bị phá vỡ cấu trúc

Vượt qua nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng

enzyme sẽ giảm và dẫn đến mức triệt

tiêu Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản

ứng enzyme cao nhất được gọi là nhiệt

độ tối ưu

Nếu đưa nhiệt độ cao hơn mức nhiệt độ

tối ưu, hoạt tính của enzyme sẽ bị giảm

Khi đó enzyme không có khả năng phục

hồi lại hoạt tính

Nhiệt độ tối ưu của enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, kim loại,

pH, …

f Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính

enzyme amylase

pH thường ảnh hưởng đến mức độ ion

hoá cơ chất, enzyme và ảnh hưởng đến

độ bền của protein enzyme

2.3 LÝ THUYẾT LÊN MEN RƯỢU

2.3.1 Khái quát quá trình lên men rượu

Lên men rượu là một quá trình sinh hóa phức tạp, tác nhân của quá trình lên men rượu

trong sản xuất là các loại nấm men Saccharomyces Thực chất của quá trình lên men

rượu chính là quá trình trao đổi chất nhờ tác dụng của các enzyme tương ứng gọi là

chất xúc tác sinh học (được sinh ra từ sự trao đổi chất để duy trì sự sống của nấm

men) Trong quá trình lên men rượu, nguyên liệu là tinh bột cần phải qua quá trình

đường hóa bằng hệ enzyme amylase để chuyển tinh bột thành đường glucose, sau đó

glucose tiếp tục lên men yếm khí để chuyển hóa thành C2H5OH (rượu etylic hay còn

gọi là etanol), khí CO2 và đồng thời giải phóng năng lượng Phương trình tổng quát về

quá trình lên men rượu như sau:

C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + 674 Kcal

Tốc độ phản ứng

Nhiệt 0 C

Hình 14 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng enzyme

Tốc độ phản ứng

pH

Hình 15 Ảnh hưởng của pH đến tốc độ phản ứng enzyme

Ngoài sản phẩm chính là cồn etylic trong quá trình lên men còn tạo thành khí CO2,

glyxerin, một vài loại cồn bậc cao, các acid hữu cơ như acid succinic, … và sinh khối

nấm men tích tụ đồng thời với sự hình thành các sản phẩm Do đó làm giảm chất

lượng tinh khiết của rượu etylic

Sản phẩm thu được sau quá trình lên men có tỷ lệ như sau: 44,4% rượu etylic, 46,6%

CO2, 3,3% glyxerin, khoảng 0,6% acid succinic và 5,1% các sản phẩm khác

Tùy theo sản phẩm tích tụ sau quá trình lên men, người ta chia làm nhiều kiểu lên men

khác nhau Tuy nhiên có hai hình thức lên men chính: lên men yếm khí và hiếu khí

 Lên men hiếu khí: là sự thủy phân đường có mặt của O2 như các quá trình lên

men acid acetic, citric, …

 Lên men yếm khí: là sự thủy phân đường không có sự hiện diện của O2 như quá

trình lên men lactic, lên men rượu, butylic, …

Trong quá trình lên men người ta chia làm hai thời kỳ chính:

 Thời kỳ phát triển sinh khối: giai đoạn này với sự có mặt của O2, tế bào nấm men

phát triển sinh khối (gia tăng kích thước và số lượng)

 Thời kỳ lên men chuyển đường thành rượu và CO2: giai đoạn này nấm men hấp

thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình để thực hiện xúc tác

sinh hóa trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống tạo thành rượu và CO2

2.3.2 Cơ sở lý luận của quá trình lên men rượu

a Cơ chế của quá trình lên men rượu

Để lên men rượu, người ta cho vào môi trường một lượng tế bào nấm men nhất định

Tùy theo phương pháp lên men mà lượng nấm men cho vào khác nhau Thông thường

khi lên men, lượng tế bào nấm men phải đạt được > 100 triệu tế bào trong 1 ml dịch

lên men Do diện tích bề mặt của tế bào nấm men rất lớn nên khả năng hấp thụ các

chất dinh dưỡng rất mạnh Đường lên men và các chất dinh dưỡng khác trong môi

trường lên men trước tiên được hấp thụ trên bề mặt của nấm men sau đó khuyếch tán

qua màng vào bên trong tế bào nấm men, rượu và CO2 sẽ được hình thành

Rượu etylic tạo thành khuyếch tán ra môi trường bên ngoài qua màng tế bào nấm men

Rượu hòa tan vô hạn trong nước nên khuyếch tán rất nhanh vào môi trường CO2 cũng

hòa tan vào trong môi trường nhưng sự hòa tan không lớn Ở áp suất 800 mmHg, nhiệt

độ 25 - 300C là 0,856 - 0,837 lít CO2 trong một lít nước Vì thế CO2 sinh ra trong quá

trình lên men sẽ khuyếch tán vào môi trường và nhanh chóng đạt được trạng thái bão

hòa Khi bão hòa CO2 bám vào xung quanh tế bào nấm men hình thành những bọt khí

Tế bào nấm men thường dính liền với nhau, bọt khí sinh ra ngày càng nhiều và lớn

dần lên hình thành túi lớn, đến lúc nào đó có sự chênh lệch giữa khối lượng riêng của

môi trường và tế bào nấm men sẽ nổi lên trên bề mặt Khi đến bề mặt, do có sự thay

đổi đột ngột sức căng bề mặt nên chúng bị vỡ ra làm cho khí CO2 bị phóng thích ra

bên ngoài Lúc này do khối lượng riêng của nấm men đủ lớn trở lại nên chúng sẽ chìm

xuống Quá trình này diễn ra liên tục nên tế bào nấm men vốn từ trạng thái tĩnh

chuyển sang trạng thái chuyển động, làm gia tăng khả năng tiếp xúc giữa tế bào nấm

men và môi trường, điều này làm cho quá trình trao đổi chất diễn ra nhanh hơn, mạnh

mẽ hơn, khi đó sẽ làm tăng nhanh quá trình lên men

Khí CO2 ức chế quá trình lên men, nhưng trong quá trình thoát khí làm tăng khả năng

lên men của nấm men Kích thước, vật liệu chế tạo của thiết bị lên men, các chất hòa

tan mang điện tích, các vật lơ lửng khác hiện diện trong dịch lên men, khi lên men đều

ảnh hưởng dến sự thoát khí CO2 nên cũng ảnh hưởng đến quá trình lên men

b Động học của quá trình lên men rượu

Tốc độ của quá trình lên men có thể xác định trực tiếp bằng cách theo dõi sự thay đổi

của hàm lượng đường trong dịch lên men, hoặc gián tiếp xác định lượng rượu tạo

thành và lượng CO2 thoát ra trong một đơn vị thời gian Cũng có thể xác định nhanh

tốc độ lên men bằng cách đo nồng độ biểu kiến của nồng độ dịch lên men

Quá trình lên men chia làm 3 thời kỳ chính:

 Thời kỳ đầu: khoảng 60 giờ kể từ khi cho nấm men tiếp xúc với dịch lên men

Sự lên men xảy ra rất chậm, đường lên men không đáng kể

 Thời kỳ 2: đây là thời kỳ lên men chính Chiếm khoảng 60 - 120 giờ sau thời kỳ

đầu Sự phát triển của nấm men và sự lên men sau mỗi giờ tăng nhanh đáng kể và đạt

đến trị số cực đại

 Thời kỳ cuối: đây là giai đoạn lên men phụ xảy ra rất chậm đồng thời là thời kỳ

ổn định tạo mùi cho sản phẩm Tùy theo phương pháp lên men, loại sản phẩm mà thời

gian lên men phụ kéo dài khác nhau không quan sát được

Thời kỳ lên men chính là thời kỳ biến đổi sâu sắc các thành phần trong dịch lên men

Chúng ảnh hưởng đến kết quả của quá trình lên men Trong giai đoạn này, trong điều

kiện lên men bình thường sau mỗi giờ nồng độ đường trong dịch lên men sẽ giảm đi

khoảng 1 độ (Brix, %) tùy loại sản phẩm, dây chuyền sản xuất

Sự tồn tại của thời kỳ lên men cuối là đặc trưng đối với quá trình lên men dịch đường

hóa từ nguyên liệu chứa tinh bột

Trong dịch lên men nếu biểu thị hàm lượng đường có trong dịch lên men là 100% thì

4-6% là dạng chất không tan, 75-77% được chuyển thành maltose và 19% là dextrin

Trong giai đoạn lên men, sự đường hóa cũng xảy ra nhưng rất chậm và không hoàn

toàn, đặc biệt khó khăn đối với tinh bột không hòa tan Do đó tốc độ lên men trong

thời kỳ này không phụ thuộc vào số lượng tế bào nấm men mà chủ yếu phụ thuộc vào

sự thủy phân hàm lượng dextrin không lên men còn lại Tuy vậy chính những loại

đường không lên men này sẽ tạo thành vị ngọt cho sản phẩm Như vậy chu kỳ lên men

dịch đường hóa tinh bột phụ thuộc vào thời gian lên men cuối hay phụ thuộc vào khả

năng đường hóa của phức hệ enzyme amylase Rất nhiều thí nghiệm cho thấy càng

kéo dài thời gian lên men cuối thì càng gia tăng hiệu suất của quá trình lên men

Tuy vậy tùy theo sản phẩm của sự lên men, nồng độ glucid của sự đường hóa, phương

pháp lên men, nhà sản xuất cũng sẽ tạo ra một quy trình sản xuất riêng biệt với chất

lượng và thành phần mong muốn của họ

c Cơ chế quá trình chuyển hóa các chất trong lên men rượu nếp than

Các quá trình vi sinh vật

Thực chất của quá trình này là quá trình sinh sản và sinh trưởng của vi sinh vật Quá

trình này xảy ra rất nhanh ở giai đoạn đầu lên men, khi ta cho bánh men thuốc bắc vào

nguyên liệu lên men Sự phát triển mạnh các vi khuẩn ở giai đoạn này, kéo theo sự tạo

thành một số acid hữu cơ Kết quả là pH môi trường giảm xuống tạo điều kiện thuận

lợi cho các loài nấm mốc phát triển Song song đó các loài nấm men bắt đầu phát

triển, tuy tốc độ phát triển của chúng có yếu hơn sự phát triển của nấm mốc

Các loài nấm mốc chỉ phát triển mạnh trong giai đoạn đường được tạo thành Hay

đúng hơn là cuối của giai đoạn nấm mốc phát triển

Việc phân ra các giai đoạn phát triển của vi khuẩn, nấm mốc và nấm men một cách

thật rõ ràng là điều rất khó khăn Vì thực tế sự phát triển của các loài vi sinh vật trong

khối lên men diễn ra đồng thời Chỉ có một điều khẳng định là sự phát triển đó thường

không cùng một mức độ Sự phát triển của một số vi khuẩn, nấm mốc đòi hỏi sự tồn

tại trong môi trường một lượng O2 nhất định Chính vì thế các loài vi sinh vật này phát

triển mạnh ở giai đoạn đầu Nấm men cũng cần sự có mặt của O2 để tăng sinh khối

Tuy nhiên mức độ đó không cao như của nấm mốc Mặt khác nấm men phát triển cần

đường, do đó nó cần phải có thời gian để nấm mốc chuyển hóa đường từ tinh bột

Các quá trình sinh hóa

Trong quá trình lên men rượu nếp than xảy ra ba quá trình sinh hóa cơ bản

 Quá trình chuyển hóa đường và các thành phần khác thành các acid hữu cơ

Trong đó có hai quá trình tạo acid hữu cơ cơ bản Đó là quá trình tạo acid acetic và

quá trình tạo acid lactic Quá trình tạo acid lactic mạnh hơn quá trình tạo acid acetic

Cả hai quá trình này xảy ra với cường độ không mạnh vì giai đoạn đầu lượng đường

trong khối lên men chưa cao nên việc chuyển hóa đó không xảy ra mạnh

 Quá trình chuyển hóa tinh bột thành đường

Do sự phát triển của nấm mốc và sự phát triển của nấm men Endomycopsis, tinh bột

được chuyển thành đường Các loài nấm mốc và nấm men này trong quá trình phát

triển tạo ra rất nhiều enzyme amylase, glucoamylase Các enzyme này hoạt động rất

thuận lợi trong giai đoạn đầu và được kéo dài suốt thời gian sau này Bản chất của các

enzyme này là các enzyme cảm ứng, do đó nguyên liệu là loại chứa nhiều tinh bột,

kích thích quá trình sinh tổng hợp rất mạnh mẽ Điểm quan trọng thứ hai cần đề cập

đến là các enzyme này chịu sự điều khiển bởi sản phẩm cuối cùng là glucose Bình

thường thì glucose sẽ ức chế phản ứng thủy phân tinh bột Nhưng các loài nấm mốc

Mucor rouxi, Rhizopus delemar, các loài nấm men thuộc Endomycopsis vừa có khả

năng sinh tổng hợp enzyme amylase, glucoamylase vừa có khả năng chuyển hóa

đường để tạo thành cồn Kết quả là lượng đường glucose được tạo thành bao nhiêu,

ngay lập tức được chuyển hóa hết thành cồn, một phần được phục vụ cho sinh sản và

phát triển của chính các loài vi sinh vật đó Do đó trong khối lên men này thường

không xảy ra cơ chế kìm hãm ngược bởi glucose

 Quá trình chuyển hóa đường thành cồn

Quá trình này được thực hiện bởi:

 Saccharomyces sp

 Mucor và Rhizopus sp

 Endomycopsis sp

Trong đó các loài nấm men Saccharomyces đóng vai trò cơ bản

Song song với quá trình này là các quá trình chuyển hóa đường, các acid hữu cơ thành

các sản phẩm phụ khác

Điều đặc biệt lưu ý là tất cả các quá trình chuyển hóa được xảy ra xen kẽ nhau, hỗ trợ

nhau và tạo nên một quá trình hài hòa, để cuối cùng tạo ra sản phẩm ta thu được

không chỉ có nước và cồn mà là một hỗn hợp sản phẩm bao gồm rất nhiều thành phần

khác nhau Chính vì thế rượu nếp than là một loại rượu có hương vị đặc biệt và giá trị

cảm quan khác rất riêng

2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu

a Ảnh hưởng của nồng độ dịch lên men

Nồng độ dịch lên men là cơ chất của quá trình lên men Nếu nồng độ dịch đường quá

cao sẽ dẫn đến làm tăng áp suất thẩm thấu và làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của

nấm men Kết quả là rượu hình thành nhiều sẽ ức chế không những các tạp khuẩn mà

cả nồng độ dịch đường cũng tạo điều kiện cho lên men vi khuẩn phát triển mạnh ở giai

đoạn đầu Mặt khác đường nhiều sẽ dẫn đến tổn thất hoặc phải kéo dài thời gian lên

men Ngược lại nếu nồng độ dịch đường thấp sẽ không kinh tế vì sẽ làm giảm năng

suất thiết bị lên men

Bình thường trong dịch lên men thường có nồng độ chất khô từ 16 - 18% (tùy theo

mức độ thuần khiết), tương đương với 13 - 15% đường đối với quá trình lên men rượu

và khoảng 10% đường đối với lên men lactic

b Ảnh hưởng của nồng độ enzyme và lượng tế bào nấm men

Trong trường hợp có đầy đủ hoặc thừa cơ chất, tốc độ phản ứng enzyme tỷ lệ thuận

với nồng độ enzyme Nồng độ enzyme càng lớn bao nhiêu thì lượng cơ chất bị biến

đổi càng nhiều bấy nhiêu Tuy nhiên cũng có trường hợp khi nồng độ enzyme tăng

quá cao, tốc độ phản ứng bị chậm lại Nhìn chung tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến

tính với lượng enzyme theo phương trình tổng quát sau:

V = K [E]

Trong đó: V: vận tốc phản ứng

K: hằng số tốc độ phản ứng

E: nồng độ enzyme

Ngoài ra số lượng tế bào nấm men cho vào dịch lên men cũng ảnh hưởng rất lớn đến

quá trình lên men Nếu số lượng tế bào nấm men cho vào thích hợp thì quá trình lên

men diễn ra tốt, hiệu suất thu hồi cao, chất lượng sản phẩm tăng lên Nếu lượng men

cho vào ít quá thì quá trình lên men diễn ra chậm, sinh khối tế bào nấm men thấp là

điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát triển Ngược lại nếu số lượng tế bào nấm men

quá nhiều thì môi trường dịch lên men không đủ chất dinh dưỡng cho tế bào nấm men

phát triển, tế bào nấm men sẽ bị chết, làm cho sản phẩm có mùi vị lạ, lãng phí đi một

lượng men không có ích

c Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng rất lớn tới quá trình lên men Mỗi loại vi sinh vật đều có

nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của mình Đối với nấm men saccharomyces, nhiệt độ

tối ưu nằm trong giới hạn 28 - 320C Tuy nhiên nếu bắt đầu lên men ở nhiệt độ thấp thì

khả năng lên men sẽ cao và kéo dài hơn Mặt khác nếu có điều kiện làm lạnh dịch

đường tới 20 - 220C sẽ hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn Sau 8 - 10 giờ, nhiệt

độ lên men sẽ đến 28 - 300C, tiếp dó cần làm lạnh để ổn định nhiệt độ trong giới hạn

tối ưu Ở nhiệt độ cao, hoạt tính của nấm men sẽ giảm nhanh nhưng chủ yếu là dễ bị

nhiễm lactic và nấm men hoang dại Ở nhiệt độ 300C, men hoang dại phát triển nhanh

hơn saccharomyces từ 2 - 3 lần, còn ở nhiệt độ 35 - 380C chúng phát triển nhanh đến 6

- 8 lần Mặt khác, khi lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo nhiều este, aldehyde và tổn thất

rượu theo CO2 sẽ tăng

Đối với quá trình lên men thì nấm men sẽ chịu được giới hạn nhiệt độ khá rộng từ 1 -

450C Nếu nhiệt độ quá 500C thì nấm men sẽ chết

Tuy nhiên nhiệt độ ngoài ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng và phát triển của nấm

men, còn gây nên một số phản ứng phụ như: gây nên sự bay hơi làm tổn thất cồn, mất

hợp chất gây mùi thơm, hình thành nên các sản phẩm phụ khác khi lên men ở nhiệt độ

quá cao Do đó thường tiến hành lên men ở nhiệt độ thích hợp để tránh hiện tượng tổn

thất cồn do bay hơi, giữ được mùi thơm đặc trưng của rượu và tránh được sự phát

triển của vi sinh vật ưa nhiệt

d Ảnh hưởng của pH

Nồng độ H+ trong canh trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men Chúng

có khả năng làm thay đổi điện tích các chất của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ

thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men Mỗi vi

sinh vật chỉ có thể hoạt động tốt trong trạng thái ion nhất định - trạng thái này lại phụ

thuộc vào pH của canh trường

Nấm men có thể phát triển trong môi trường có chỉ số pH = 2 - 8 nhưng thích hợp nhất

là trong khoảng pH = 4 - 4,5 Vi khuẩn bắt đầu phát triển ở pH = 4,2 và cao hơn Khi

pH < 4,2 chỉ có nấm men phát triển Trong điều kiện lên men rượu, pH tối ưu để tạo

alcol etylic là 4,5 - 5,0 Đối với dịch đường từ nguyên liệu tinh bột thường khống chế

ở pH = 4,8 - 5,2, nhằm kết hợp giữ cho enzyme amylase tiếp tục chuyển hóa tinh bột

và dextrin thành đường lên men được Nếu tăng pH thì dễ bị nhiễm khuẩn, glyxerin sẽ

tạo nhiều hơn và do đó làm giảm hiệu suất lên men Chính vì vậy trong lên men rượu,

để ngăn ngừa khả năng nhiễm khuẩn (lactic, nấm men hoang dại,…) người ta thực

hiện trong giới hạn pH = 3,8 - 4,0 Tuy nhiên trong thực tế có những loài vi khuẩn do

quen dần (thuần hóa) với độ pH thấp nên ngoài việc ứng dụng điều chỉnh pH thích

hợp còn phải kết hợp sử dụng các chất sát trùng Khi pH = 8 thì nấm men phát triển

rất kém, ngược lại vi khuẩn phát triển rất mạnh Ở pH = 3,8 nấm men phát triển mạnh

thì hầu như vi khuẩn chưa phát triển

Để tạo pH thích hợp trong môi trường nuôi cấy nấm men (kể cả lên men) người ta có

thể bổ sung vào môi trường một loại acid thích hợp nào đó sao cho anion của acid

không gây ảnh hưởng mạnh mẽ đến trung tâm hoạt động của nấm men, không ảnh

hưởng đến chất lượng rượu thành phẩm và sức khoẻ người tiêu dùng

e Ảnh hưởng của nồng độ rượu

Thường trong dịch lên men có khoảng 4 - 6% rượu Nồng độ rượu sinh ra có ảnh

hưởng đến tốc độ và khả năng phát triển của nấm men Nồng độ rượu ảnh hưởng đến

tốc độ phát triển riêng của nấm men còn phụ thuộc vào thời gian, số lượng tế bào và

nguyên liệu chuẩn bị môi trường nuôi cấy Cùng một thời gian nuôi cấy, số lượng tế

bào nấm men cho vào bằng nhau, điều kiện nuôi cấy giống nhau thì nồng độ rượu ban

đầu 1% chưa có ảnh hưởng đến tốc độ và khả năng phát triển của nấm men, từ 4 - 6%

đã có ảnh hưởng xấu

f Ảnh hưởng của một số hóa chất và chất sát trùng

Trong điều kiện sản xuất dù có vệ sinh sạch đến mấy cũng khó đảm bảo vô trùng tuyệt

đối, vì vậy cần phải dùng chất sát trùng để ngăn ngừa và hạn chế tạp khuẩn Có thể

dùng nhiều hóa chất khác nhau như: formon, Na2SiF6, NaF, CaOCl2,… các muối kim

loại nặng, các tia cực tím, … đều ảnh hưởng rất lớn đến quá trình hoạt động sống của

nấm men Tùy theo chất lượng của hóa chất mà dùng nhiều hay ít, sao cho hạn chế

được sự phát triển của tạp khuẩn nhưng không làm ảnh hưởng xấu tới hoạt dộng của

nấm men

Khi sử dụng formon, Na2SiF6, nồng độ không được vượt quá 0,02% so với dịch lên

men Tùy theo tính chất và mức độ phân ly của mỗi acid mà tác hại của chúng lên nấm

men sẽ không giống nhau Ngoài các hóa chất kể trên, trong dịch đường lên men luôn

chứa một lượng furfurol, melanoidin, đều ít nhiều ảnh hưởng đến hoạt động của nấm

men

2.4 QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT RƯỢU NẾP THAN

2.4.1 Qui trình sản xuất rượu nếp than

Rượu nếp than được sản xuất theo một qui trình rất đặc biệt Sản phẩm cuối cùng của

công nghệ sản xuất rượu nếp than không phải là sản phẩm qua chưng cất như rượu cao

độ thường thấy ở qui trình sản xuất công nghiệp hoặc qui trình sản xuất thủ công của

rượu đế Rượu nếp than là sản phẩm của quá trình lên men không chưng cất nguyên

liệu nếp than mà thành Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột nếp bị thủy phân

thành đường maltose và glucose, đường tạo thành qua giai đoạn thủy phân tiếp tục

được nấm men Saccharomyces chuyển hóa thành rượu và CO2 Sản phẩm rượu nếp

than không qua giai đoạn chưng cất nên vẫn còn giữ được mùi thơm đặc trưng và có

hậu vị hơi ngọt, đắng nhẹ Đặc biệt sản phẩm còn có màu nâu đỏ tự nhiên do nguyên

liệu hình thành nên rất hấp dẫn và tạo nên nét đặc trưng riêng cho sản phẩm rượu nếp

than

Tùy theo yêu cầu của người sản xuất và người tiêu dùng, sản phẩm rượu nếp than có

thể được chia thành hai loại sau: rượu nếp than trong và rượu nếp than có xác

Dưới đây là qui trình công nghệ sản xuất rượu nếp than:

2.4.2 Thuyết minh qui trình

Xử lý nguyên liệu

Chọn nguồn nguyên liệu có chất lượng tốt, không bị sâu mọt và ổn định về các thành

phần như: màu sắc, hàm lượng tinh bột, … để đảm bảo chất lượng rượu thành phẩm

Nguyên liệu được ngâm vào nước và làm sạch để tách các chất bẩn bám vào nguyên

liệu Đồng thời quá trình ngâm còn có mục đích là làm mềm gạo, làm gạo trương nở

để dễ nấu chín sau này

Nấu chín

Tinh bột của nếp than có màng tế bào bảo vệ nên enzyme amylase không thể tiếp xúc

trực tiếp được Mặt khác, tinh bột sống không hòa tan trong nước, do vậy khi đường

hóa enzyme amylase tác dụng vào rất chậm Do đó mục đích của công đoạn nấu là

nhằm phá vỡ màng tế bào của tinh bột, tạo điều kiện biến tinh bột từ trạng thái không

hòa tan thành trạng thái hòa tan trong dung dịch, giúp cho quá trình tiếp xúc giữa

enzyme amylase và tế bào tinh bột được dễ dàng, làm tăng nhanh hiệu quả của quá

trình đường hóa tiếp sau đó Sau khi nấu hàm lượng ẩm trong nguyên liệu phải đạt 60

Sau khi làm nguội, rắc men thuốc bắc đã được nghiền mịn vào, trộn đều và cho vào hũ

có miệng nhỏ, không đậy nắp trong thời gian 3 giờ để tiến hành ủ mốc Khoảng thời

Xử lý Nấu chín Làm nguội

Phối trộn Nghiền mịn

gian này nhằm cung cấp O2 cho quá trình tăng sinh khối của vi sinh vật Sau đó bổ

sung thêm enzyme amylase vào theo tỷ lệ thích hợp, đậy hũ lên men lại và tiến hành

lên men

Trong thời gian tiến hành ủ mốc thì lượng enzyme amylase do nấm mốc sản sinh ra

cùng với lượng enzyme amylase bổ sung vào thì tinh bột sẽ bị thuỷ phân một phần tạo

rượu và CO2 Do đó khi dịch đường lên men được khoảng 3 ngày thì tiến hành chan

nước (nước đun sôi để nguội) theo tỷ lệ nguyên liệu : nước là 1 : 2 nhằm mục đích là

làm loãng dịch lên men để hạ thấp nồng độ rượu vì nếu nồng độ rượu quá cao sẽ ức

chế quá trình lên men, mặt khác tạo điều kiện cho enzyme amylase tiếp xúc với tinh

bột dễ dàng hơn nhờ đó mà nâng cao hiệu suất thu hồi rượu

Lên men chính

Tiến hành lên men ở nhiệt độ thường Trong thời gian này sẽ có ba quá trình song

song xảy ra, tức nhiên là mức độ các quá trình đó có khác nhau Ba quá trình đó là quá

trình tăng sinh khối của vi sinh vật, quá trình đường hóa và quá trình rượu hóa

Lên men phụ và ổn định

Sau khi lên men chính, hàm lượng cồn trong dịch lên men đạt khoảng 7-10%V Với

lượng cồn này rất khó bảo quản và chất lượng rượu không cao Do đó, ta phải cho

thêm cồn vào để tăng hàm lượng cồn trong sản phẩm, làm gia tăng khả năng bảo quản

sản phẩm và làm cho rượu ổn định trong giới hạn nhất định Có thể cho thêm đường

vào để điều vị cho sản phẩm

Sau khi cho cồn vào (lượng cồn cho vào tùy theo yêu cầu của người sản xuất và người

tiêu dùng), rượu nếp than được tồn trữ ít nhất là 6 tháng để tiếp tục quá trình lên men

phụ Do rượu nếp than là sản phẩm không qua quá trình chưng cất nên trong quá trình

lên men chính tạo thành nhiều sản phẩm rượu bậc cao, aldehyde, … ảnh hưởng xấu

đến chất lượng sản phẩm như gây đắng, rượu có mùi lạ, … Vì vậy kéo dài thời gian

lên men phụ nhằm tạo thời gian dài cho quá trình chuyển những hợp chất rượu bậc

cao, aldehyde thành những hợp chất tạo mùi và hương cho sản phẩm

Thành phẩm

Rượu nếp than có hai dạng: rượu nếp than đục và rượu nếp than trong:

Đối với rượu nếp than trong: sau thời gian lên men chính, tiến hành lọc bằng

vải lọc để bỏ phần xác, đồng thời để tách các phần tử không tan và các phần kết tủa

trong quá trình lên men ra khỏi dịch lên men Sau đó để lắng tự nhiên nhằm tiếp tục

tách các phần tử có kích thước nhỏ không tan và các phần kết tủa còn sót lại trong

dịch lên men sau quá trình lọc Dịch lên men sau khi qua hai công đoạn lọc, lắng ta sẽ

thu được một dung dịch lên men trong suốt gọi là rượu nếp than trong

Đối với rượu nếp than đục: sau thời gian lên men chính, để nguyên xác

Cả hai loại rượu trên đều có màu sắc và mùi vị đặc trưng riêng của nguyên liệu đưa

vào sản xuất Rượu nếp than khi đạt được một số chỉ tiêu nhất định thì đem đi phân

phối

CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

3.1.1 Thời gian địa điểm

Thời gian: từ ngày 26/2/2007 đến ngày 25/5/2007

Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bộ Môn Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp và

Sinh Học Ứng Dụng - Trường Đại Học Cần Thơ

3.1.2 Nguyên vật liệu

Gạo nếp than được mua ở chợ An Hòa - Quận Ninh Kiều – TP Cần Thơ, chọn gạo nếp

than có hạt đồng đều, không bị lộn gạo hoặc nếp khác, nếp than chỉ có một màu tím

đậm Nếp sử dụng trong suốt quá trình thí nghiệm phải mua một lần để tránh sai số

Chế phẩm enzyme glucoamylase được đặt mua từ công ty hoá chất Sài Gòn, có nguồn

gốc từ vi sinh vật, nhiệt độ tối thích là 600C, pH tối thích là 3.5 – 5.5

Bánh men thuốc bắc: sử dụng men thuốc bắc Hải Anh Quang, có địa chỉ nơi sản xuất

in trên bao bì là: 39 Ấp 3 - Trần Văn Mười – Xã Xuân Thới Thượng - Huyện Hóc

Môn – TPHCM (ĐT: 08.7129144, 0913.912753) Men thuốc bắc phải có chứa các vi

sinh vật có khả lên men và các vị thuốc bắc có tỷ lệ thích hợp giữa các thành phần để

tạo hương cho sản phẩm

3.1.3 Thiết bị - dụng cụ

 Nồi cơm điện

 Chiết quang kế cầm tay

 Cân phân tích

 Thiết bị đo độ hấp thụ màu

 Một số dụng cụ cần thiết khác trong phòng thí nghiệm

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2.1 Phương pháp lấy mẫu

a Phương pháp lấy mẫu

Nguyên liệu được chọn như đã trình bày ở phần nguyên vật liệu, bố trí một dãy thí

nghiệm với cùng một nguồn nguyên liệu

b Phương pháp nghiên cứu

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 4 nhân tố với 3 lần lặp lại Kết quả được

tính toán bằng thống kê và phân tích phương sai, kiểm định LSD hoặc Duncan

3.2.2 Phương pháp phân tích

Hình 20.Thiết bị đo độ hấp thụ màu

Hình 19.Thiết bị đo pH Hình 18 Cân phân tích

a Xác định khả năng thuỷ phân của enzyme glucoamylase

Khả năng thuỷ phân của enzyme glucoamylase có thể được xác định bằng hai phương

pháp:

Kiểm tra hoạt tính của enzyme glucoamylase

Kiểm tra hàm lượng đường của dịch thuỷ phân

Tuy nhiên phương pháp xác định hoạt tính của enzyme glucoamylase rất phức tạp và

khó thực hiện, trong giới hạn của đề tài này chỉ tiến hành theo phương pháp kiểm tra

hàm lượng đường của dịch thuỷ phân

Lượng đường sinh ra trong dịch thủy phân có thể được biểu thị bằng hàm lượng chất

khô hòa tan có trong dịch đường Lượng đường sinh ra nhiều hay ít sẽ thay đổi tuyến

tính với hàm lượng chất khô hòa tan Do đó có thể căn cứ vào sự thay đổi hàm lượng

chất khô hòa tan trong dịch lên men để kết luận về khả năng thủy phân tinh bột của

nguồn chế phẩm enzyme glucoamylase sử dụng

Mặt khác lượng đường sinh ra trong dịch đường hóa sẽ được nấm men sử dụng trực

tiếp để lên men tạo thành rượu Do đó có thể xác định khả năng thủy phân của enzyme

glucoamylase dựa vào hiệu suất thu hồi rượu

b Nồng độ chất khô hòa tan của dịch đường và dịch lên men

hòa tan, chủ yếu là tinh bột tan, dextrin và đường oligo có số gốc glucose khác nhau

Ngoài ra còn chứa một lượng chất hoà tan khác như: protein, chất khoáng Các chất

này mang tên chung là chất hoà tan hay chất khô của dịch đường và dịch lên men và

được đo bằng chiết quang kế cầm tay (Brix kế) ở điều kiện 200C

Tiến hành: Dùng đũa thuỷ tinh nhỏ một giọt dịch trong của dịch đường hóa

hay dịch lên men lên chiết quang kế để đo nồng độ chất khô hòa tan của dịch đường

Nếu khi đo nhiệt độ khác 200C thì cần hiệu chỉnh theo phụ lục B

c Xác định nồng độ rượu

Lượng rượu tạo thành (độ rượu) có thể xác định gián tiếp bằng cách chưng cất

màu anthocyan, khoáng, … và các chất không hoà tan khác như: dextrin, tạp chất, …

do đó rất khó có thể xác định độ rượu trực tiếp bằng cách đo tỷ trọng

rượu của dịch lên men bằng cách lấy dịch lên men đem chưng cất Sau đó dùng cồn kế

để đo tỷ trọng của rượu đã chưng cất Từ đó tính được lượng rượu tạo thành

Muốn đo độ rượu bằng cồn kế ta tiến hành như sau:

- Rót rượu vào ống đo đặt thẳng đứng, ống đo phải sạch, khô và phải tráng qua

dung dịch đo Nhiệt độ khi đo cần làm lạnh hoặc gia nhiệt đến xấp xỉ 200C

- Từ từ nhúng thước đo vào, buông tay để thước nổi tự do rồi đọc kết quả Đọc

2 đến 3 lần lấy kết quả trung bình Khi đọc phải đặt mắt ngang tầm mực chất lỏng và

không đọc ở phần lồi (hoặc lõm) Trong mỗi dung dịch đều chứa các chất hoạt động

bề mặt và do đó làm ảnh hưởng tới sức căng bề mặt, chỉ số đọc được trên thước đo,

dẫn đến làm tăng hoặc giảm so với nồng độ thực tế

d Kiểm tra các chỉ tiêu hoá lý

Rượu sau khi lên men cần phải theo dõi các chỉ tiêu hoá lý sau:

pH: đo bằng pH kế

Hàm lượng chất khô: đo bằng chiết quang kế

Màu sắc: đo bằng thiết bị đo độ hấp thụ màu

e Đánh giá cảm quan sản phẩm

Đánh giá cảm quan sản phẩm bằng phương pháp cho điểm theo tiêu chuẩn Việt Nam

(TCVN 3251-79) Tiêu chuẩn này xây dựng trên một thang thống nhất có 6 bậc (từ 0

đến 5) và điểm 5 là cao nhất cho một chỉ tiêu

3.3 NỘI DUNG VÀ BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM

3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme glucoamylase bổ sung

đến hiệu suất thu hồi rượu

Mục đích: Tìm ra tỷ lệ enzyme glucoamylase bổ sung thích hợp để tăng tốc độ

đường hoá, giúp cho quá trình đường hoá diễn ra một cách triệt để và không bị lãng

phí đi một lượng enzyme glucoamylase không có ích do bổ sung quá nhiều Nhờ đó

mà nâng cao hiệu suất thu hồi rượu

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo phương

pháp thừa số 1 nhân tố, 3 lần lặp lại Mỗi mẫu sử dụng 100 gam gạo nếp than

 Nhân tố A: tỷ lệ enzyme thay đổi ở 4 mức độ

Sơ đồ thí nghiệm 1

Tiến hành thí nghiệm

 Nếp than được xử lý theo sơ đồ trên

 Chọn 4 bình tam giác, cho vào mỗi bình tam giác 200 gam xôi nếp than đã được

trộn men thuốc bắc với tỷ lệ 0,9%, muối 0,5% và tỷ lệ enzyme glucoamylase bổ sung

là A0 (0% ), A1 (0,3% ), A2 (0,5% ), A3 (1% )

 Để tự nhiên ngoài môi trường 2 giờ cho nấm mốc phát triển sinh khối

 Đậy bình tam giác lại bằng nút gòn

 Tiến hành đường hoá ở nhiệt độ phòng trong thời gian thích hợp (3 ngày)

 Chan nước theo tỷ lệ nguyên liệu : nước = 1 : 2

 Tiến hành lên men trong thời gian thích hợp (3 ngày)

 Kiểm tra độ Brix trong từng ngày lên men

 Kiểm tra pH ở các mốc thời gian 0 ngày, 3 ngày, 6 ngày

 Sau khi kết thúc quá trình lên men, tiến hành đo các chỉ tiêu: màu sắc (mật độ

quang A), nồng độ rượu, thể tích dịch lên men

 Lặp lại thí nghiệm thêm 2 lần nữa để có kết quả chính xác hơn

Để nguội (30 – 350C) Ngâm (2 giờ)

Trộn

Ủ mốc (3 ngày)

Lên men (3 ngày)

Enzyme amylase

Hình 21 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme

glucoamylase bổ sung đến hiệu suất thu hồi rượu

Muối (0,5%)

A3 Chan nước

Nguyên liệu : nước = 1 :

2

3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến khả năng thuỷ

phân của enzyme glucoamylase

Mục đích: Tìm ra nhiệt độ và pH thích hợp nhất cho khả năng thuỷ phân của

enzyme glucoamylase

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo phương

pháp thừa số 2 nhân tố, 3 lần lặp lại Mỗi mẫu sử dụng 100 gam nếp than

 Nhân tố B: nhiệt độ xử lý thay đổi ở 3 mức độ

B1: nhiệt độ phòng thí nghiệm

B2: nhiệt độ thích hợp cho nấm mốc Rhizopus trong men thuốc bắc phát triển

(35 – 380C)

B3: nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme glucoamylase 50 - 550C

 Nhân tố C: pH thay đổi ở 3 mức độ

C1: pH của dịch cháo

C2: pH = 5,6 (pH tối thích của enzyme glucoamylase trong nấm mốc)

C3: pH tối thích của enzyme glucoamylase nguồn (3,5 – 5,5)

Để nguội (30 – 350C) Ngâm (2 giờ)

Trộn

Ủ mốc (3 ngày) Chan nước Lên men (3 ngày)

Enzyme glucoamylase

W = 60-70%

T = 45-60 phút

0,9% men thuốc bắc

C2

Hình 22 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến

khả năng thuỷ phân của enzyme glucoamylase

C3

B1

B2B3

B2B3

Muối (0,5%) C1 B1 B2

B3

phân enzyme glucoamylase

Mục đích: Tìm nhiệt độ pH thích hợp cho khả thuỷ phân

enzyme glucoamylase...

Lên men (3 ngày)

Enzyme amylase

Hình 21 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ enzyme

glucoamylase bổ sung đến hiệu suất thu hồi rượu. ..

0,9% men thuốc bắc

C2

Hình 22 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ pH đến

khả thuỷ phân enzyme glucoamylase