Polymerase, PCR là gì? pdf

KỸ THUẬT PCR Polymerase chain reaction-Phản ứng chuỗi polymerase PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, được dịch ở một vài sách là Phản ứng chuỗi trùng hợpcũng có sá

Polymerase, PCR là gì?

DNA polymerase (ADN polymeraza) là một enzyme tham gia chính vào quá trình nhân đôi DNA Những enzyme này xúc tác cho quá trình polymer hóa các deoxiribonucleotide dựa trên trình tự của một chuỗi DNA khác Sợi DNA mới được tạo thành sẽ bổ sung với sợi DNA khuôn theo nguyên tắc bổ sung

KỸ THUẬT PCR (Polymerase chain reaction-Phản ứng chuỗi polymerase)

PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, được dịch ở một vài sách là Phản ứng chuỗi trùng hợpcũng có sách gọi là "phản ứng khuếch đại gen"

PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E coli hay nấm men

PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác định huyết thống

Quá trình phát hiện kỹ thuật PCR

Vào một buổi tối cuối tuần của tháng 4 năm 1983, trong lúc đang lái xe trên đường

ở gần vùng đồi núi của California, một ý tưởng loé lên trong đầu của Kary Mullis khi ông phải lùi xe lại do chạy lố đường, hình ảnh hai làn bánh xe mới tách khỏi hai làn bánh xe cũ: « Dùng nhiệt độ tách sợi đôi ADN thành hai mạch đơn » Lúc

đó Kary Mullis chỉ là một nhà hoá sinh học bình thường, đang làm việc trong một phòng thí nghiệm nhỏ

Từ ý tưởng đó, Kary Mullis đã phát minh ra kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi polymerase) vào năm 1985, tạo nên một cuộc cách mạng lớn trong đời sống khoa học Chỉ sau 8 năm (1993), K Mullis đã được trao giải Nobel về hoá học nhờ phát minh này

PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một phần

Đó có thể là một gen đơn, hay một phần của gen Trái với sinh vật sống, quy trình PCR có thể copy một mảnh DNA ngắn, có thể lên đến 10kb (kb = 1 kilobasepair = kilo cặp base = 1000 cặp base) DNA là một sợi đôi, và vì vậy nó được đo với DNA bổ sung gọi là cặp base Một vài phương pháp có thể copy một mảnh kích thuớc lên đến 40kb ít hơn nhiều so với nhiễm sắc thể DNA trong tế bào eukaryote – ví dụ như tế bào người chứa hơn 3 tỉ cặp base

Như đã thực hành hiện nay, PCR cần rất nhiều thành phần Những thành phần đó là: - DNA mẫu (template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại - Cặp mồi(primer), để xác định điểm bắt đầu và kết thúc vùng cần khuếch đại (xem phần tiếp theo về mồi) - DNA-polymerase enzym xúc tác cho việc nhân lên của DNA - Nucleotides (ví dụ dNTP)là nguyên liệu cho DNA-polymerase để xây dựng DNA mới - Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa học cho DNA-polymerase

Phản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt Đây là máy đun nóng và làm nguội trong ống phản ứng ở nhiệt độ chính xác cho mỗi phản ứng Để ngăn ngừa

sự bay hơi của hỗn hợp phản ứng, phần nắp đậy của máy PCR cũng được đun nóng, trường hợp lượng dung dịch phản ứng quá ít, người ta cho một lớp dầu (natural oil) lên trên bề mặt hỗn hợp phản ứng Năm 2004, giá máy khoảng 2500 USD

RT - PCR

Virus không có các ADN nên cần có một giai đoạn tạo các ADN bổ sung từ các ARN Để làm được điều này ta dùng các enzyme sao chép ngược gọi là Transcriptase inverse (Retrotranscriptase ) RT – PCR (Reverse transcription - PCR) là phương pháp để phát hiện các ARN của virus

Hiện nay các phòng thí nghiệm trên thế giới và Việt Nam đang phát triển các phương pháp mới: Real Time RT-PCR, Multiplex PCR,…PCR có thể tiến hành ở

các phòng thí nghiệm thông thường còn RT-PCR thường chỉ được thực hiện tại các phòng thí nghiệm có tổ chức chặt chẽ

Virus H5N1 trong các mẫu có tỉ lệ rất nhỏ do đó rất khó phát hiện, tuy nhiên nếu dùng các phương pháp nuôi cấy rất nguy hiểm vì dễ gây phát tán virus Hiện nay

để phát hiện virus H5N1 trong mẫu cần khoảng 5-7 tiếng Các nghiên cứu hiện nay đa số tìm cách giảm thời gian này

Một phương pháp cải tiến là dùng một số đoạn ADN mồi đặc hiệu:

Ví dụ các đoạn mồi đặc hiệu của Enders K.O Ng, Peter K.C Cheng,Antia Y.Y

Ng, T.L Hoang, Wilina W.L Lim