phần thực nghiệm luận văn thạc sỹ khoa học hóa học

phần thực nghiệm luận văn thạc sỹ khoa học hóa học

4.PHAN

THUC

NGHIEM

Trước khi khảo sát định tính và trích ly cô lập các hợp chất trong cây Hoa

Kim Cương, chúng tôi chuẩn bị các phương tiện hóa chất và kỹ thuật sau:

$& Tỉnh chế dung môi và chuẩn bị các thuốc thử

- Dung môi: eter dầu hỏa, benzen, cloroform, etil acetat, aceton, metanol déu

được làm khan bằng Na;SO,

- Thuốc thử: để hiện hình các vết chất hữu cơ trên bản mồng, phun xịt bằng acid sulfric đậm đặc và dùng hơi iod Ngoài ra, các thuốc thử phục vụ cho phần khảo

sát định tính, sẽ được mô tả cụ thể trong từng phản ứng định tính ở phần sau

% Thiết bị chính và kỹ thuật tiến hành:

Cột sắc ký (silica gel nhanh - khô): là những phếu lọc xốp có đường kính

khác nhau (tùy thuộc vào lượng cao sắp khảo sát) được gắn vào hệ thống rút khí

để tạo áp suất kém thông qua một bình tam giác có cổ ngang, nạp từ từ silica gel (60H loại đùng cho sắc ký lớp mỏng, Merck) vào cột, ép nhẹ đều tay lớp silica gel này, dưới sự trợ giúp của máy hút chân không để cho cột chặt đêu Khi chiều

cao lớp silica gel trong cột đạt khoảng 4,5 - 5cm thì tiến hành bão hòa cột, bằng

cách, cho dung môi kém phân cực nhất trong số các hệ dung môi sắp đùng để giải ly (dùng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng để lựa chọn các hệ dung môi này), đi qua

cột đến khi nào lớp silica gel trong cột trở thành một khối đồng nhất và khi rút

khô dung môi mà lớp silica gel này không bị nứt gấy Sau đó, các mẫu cao sẽ được nạp lên đầu cột và tiến hành giải ly

Kỹ thuật sắc ký cột nhanh - khô nói trên, được sử dụng nhiều lần để trích

ly, cô lập các hợp chất hữu cơ

Ngoài ra, chúng tôi còn dùng một số thiết bị kỹ thuật khác đã được nêu

trong phần nghiên cứu và kết quả

4.1 ĐỊNH TÍNH CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ

Như đã được nêu ở phần nghiên cứu và kết quả: trong cây cổ nói chung, thường có chứa các hợp chất hữu cơ như: sterol, triterpen, alcaloid, flavon, tanin, glycosid, saponin và để định tính các loại hợp chất hữu cơ này chúng tôi dựa

vào những phản ứng hóa học đặc trưng cho từng loại hợp chất ở khả năng tạo màu hoặc tạo kết tủa với các thuốc thử

4.1.1 Điều chế các loại cao

Từ 1200g bột nguyên liệu khô ngâm trích trong etanol, lọc, cô quay thu

hổi dung môi, thu được 80,83g cao etanol

Trích pha rắn silica gel trên cao etanol bằng cách nạp cột (sắc ký cột khô nhanh), giải Iy lần lượt bằng các đơn dung môi từ không phân cực đến phân cực:

eter dầu hỏa, cloroform, metanol Dung dich giải ly được hứng vào các lọ, mỗi lọ

50ml, các lọ cho sắc ký lớp mồng giống nhau được gộp chung thành một phân

đoạn Thu hồi dung môi, thu được các loai cao: cao eter dầu hỏa (3,52g), cao cloroform A (5,87g), cao cloroform B (12,68g) và cao metanol (35,27g)

4.1.2 Đính tính sterol và triterpen; bằng phản ứng với các thuốc thử Liebermann Burchard, Salkowski va Noller

© Tạo mẫu thi: Lay 0,1gam mau méi loại cao hòa tan trong 20ml dung môi cloroform, sau 1 giờ lọc lấy dich loc để làm mẫu thư

© Thuéc thd Liebermann Burchard: Anhidrid acetic (20ml), acid sulfuric dam dac (Iml)

- Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm dùng làm ống chuẩn

- Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm khác, thêm từ từ thuốc thử vào, nhận

thấy hỗn hợp chuyển sang màu lục đậm, hông, cam hoặc đổ bến trong một thời gian chứng tỏ có sterol

e Thuốc thử Salkowski: Anhidrid acetic đậm đặc

Tiến hành cách thử như trên, nhận thấy xuất hiện màu nâu đất hay màu

xanh chuyển dẫn sang nâu chứng tỏ trắc nghiệm dương tính

© Thuốc thử Noller: Clorur tionil (1ml), Sn (0,5g)

Cũng tiến hành cách thử như trên, nhận thấy xuất hiện màu đỏ thẩm chứng tỏ trắc nghiệm dương tính

4.1.3 Định tính flavonoid: bằng phản ứng Shibata (phản ứng Cianidin), phản

ứng với HạSO¿ đậm đặc

¢ Tao mau thi: Lay 0,5gam cao mỗi loại, cho 20ml nước vào một becher, đun

cách thủy trong 5 phút, để nguội, lọc lấy dịch lọc để làm mẫu thử

¢ Thực hiện phản ứng Shibata (hay còn gọi là phản ứng Cianidin) với thuốc

thử gồm HCI đậm đặc, bột Mg kìm loại và alcol isoamil

- Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm dùng làm ống chuẩn

- Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm khác, thêm 5 giọt dung dịch HCl dam

đặc và 3 đến 5 hạt Mg kim loại (khoảng 0,1 g), để yên cho đến khi đung dịch hết

sui bọt Đun nóng và nhỏ từ từ alcol isoamil dọc theo thành ống nghiệm, sẽ thấy xuất hiện một vòng tròn trên bể mặt dung dịch, lúc đầu màu hồng nhạt từ từ đổi màu đỏ tím, chứng tổ có sự hiện điện của flavono¡d

«_ Thực hiện phản ứng thử với H;SOa đậm đặc

- Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm dùng làm ống chuẩn

- Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm khác, thêm từng giọt H;ạSO¿ đậm đặc

Hỗn hợp từ vàng đậm đổi sang đa cam chứng tổ có sự hiện diện của flavonoid 4.1.4 Dinh tính tanin: bằng các thuốc thử cho phẩn ứng màu và trẩm hiện như: Stasny, acetat chì hoặc FeCl; 1%

© Tao mau thử: Lấy 0,5gam cao mỗi loại, đun với 30ml nước trong thời gian khoảng 5 phút Lọc lấy dịch lọc để làm mẫu thử

e Thuốc thử Stiasny: 20ml dung dịch formol 36%, 10ml HCI đậm đặc.

~ Cho 2m] mẫu thử vào một ống nghiệm dùng làm ống chuẩn,

- Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm khác, thêm 1ml thuốc thử, đun nóng,

thấy xuất hiện khối vô định hình màu nâu xám chứng tỏ trắc nghiệm dương tính

+ Thuốc thử acetat chì: Dung dịch acetat chì bão hòa trong nước

- Cho 2ml] mẫu thử vào một ống nghiệm dùng làm ống chuẩn,

- Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm khác, thêm từng giọt acetat chì, nhận

thấy xuất hiện trầm hiện vàng nâu dạng bột chứng tổ trắc nghiệm dương tính

®© Thuốc thử FeCl; 1%:

- Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm dùng làm ống chuẩn

- Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm khác, thêm từng giọt FeCl; 1%, nhận

thấy dung dịch trong ống nghiệm chuyển sang màu xanh đen hoặc xanh lục

chứng tỏ trắc nghiệm dương tính

4.1.5 Dinh tinh glycosid

- Phần đường của glycosid được định tính dựa vào thuốc thử Tollens

- Phần aglicol được định tính dựa vào các thuốc thứ Baljet và Molish

© _ Tạo mẫu thử: có hai cách để tạo mẫu thử

- Đối với cao eter dầu hỏa: ngâm cao với alcol edil, lọc lấy địch lọc làm mẫu thử

- Đối với mẫu cây khô: cân 10 gam bột khô, tận trích bằng alcol etil Lọc lấy

địch trích và thêm vào đó dung địch acetat chì 10%, lắc đều, để yên Sau đó, thêm dung địch Na;SO¿ vào để loại trừ lượng chì thừa Lọc trầm hiện PbSO¿, lấy

dịch lọc này hòa thêm alcol etil 95% va lọc lại để lấy phần dịch làm mẫu thử

(Qui trình thực hiện được trình bày trong sơ đồ 2 - sơ đổ SOOS)

© Thuốc thử Tollens: AgNO; trong dung dịch amoniac

„ Cách pha thuốc thử Tollens: Thêm dung dịch NH,OH đậm đặc vào 10ml dung dịch AgNOs 5% đến khi có trầm hiện AgOH vừa xuất hiện bị tan Tiếp tục thêm

1 giọt NaOH 10%, nếu có trầm hiện thì thêm NH„OH cho tan trầm hiện

-Cach thit: Cho 2m thuéc thử vào một ống nghiệm, thêm 5 giọt dung dịch mẫu

thử, lắc nhẹ vài giây rồi để yên, thấy có một lớp gương sáng bạc bám lên thành

ống nghiệm Nếu không thấy phản ứng ở nhiệt độ thường thì nhúng ống nghiệm

vào nước nóng Đôi khi lớp gương không hình thành được do ống nghiệm không

sạch hoặc phản ứng chưa đủ thì vẫn có bạc kim loại màu xám đen kết tủa cho

thấy trắc nghiệm dương tính

© Thuốc thử Baljet (định tính vòng lacton 5 cạnh): Acid picric trong alcol etil

20% (20ml), NaOH 5% (10ml)

- Cho 2ml thuốc thử vào một ống nghiệm dùng làm ống chuẩn

- Cho 2ml thuốc thử vào một ống nghiệm khác, rỗi thêm 2ml mẫu thử, đun nhẹ, hỗn hợp chuyển dẫn sang màu da cam, có xuất hiện một ít kết tủa chứng tô trắc

nghiệm dương tính

e_ Thuốc thử Molish: Thimol xanh 2% (1- 2 giọt), 1ml HạSO¿ đậm đặc

- Cho 2ml thuốc thử vào một ống nghiệm dùng làm ống chuẩn

- Cho 2ml thuốc thử vào một ống nghiệm khác, cho từ từ mẫu thử vào, hỗn hợp

từ tím hồng đổi sang mầu đỏ, có kết tủa, chứng tỏ trắc nghiệm dương tính

4.1.6 Định tính alcaloid: dựa trên cdc phan ứng tạo thành trầm hiện với các thuốc thử: Bouchardat, Mayer, Hager, Dragendorff và Bertrand

Có ba phương pháp xác định sự hiện điện của alcaloid

- Phương pháp Harold - St John (1959) dùng bột cây khô

- Phương pháp Debray (1961) dùng mẫu cây tươi

- Phương pháp Scheuer (1962) dùng cao alcol

Ở đây chúng tôi áp dụng phương pháp Scheuer

© Tạo mẫu thử;

Cân 2 gam mẫu thử bột cây khô, trích bằng 150ml dung môi alcol etil 95%

sau 2 giờ Lọc lấy dịch alcol, cô cạn dung môi dưới áp suất kém thu được cao

alcol, hòa tan cao này trong hỗn hợp eter etil: cloroform (1:1) và HCI 1% Lấy địch acid này làm mẫu thử,

©_ Thuốc thử Bouchardat: 1; (2,5g); KI (5g); nước cất (100m])

- Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm dùng làm ống chuẩn,

- Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm khác, rồi nhỏ từ từ thuốc thử vào, nhận

thấy có kết tủa nâu sậm hay vàng đậm rõ rệt ngay tức khắc, kết tủa bền, không

tan trong thuốc thử dư, chứng tỏ trắc nghiệm dương tính

©_ Thuốc thử Mayer: HgCl; (1,36g); KI (5g); nước cất (100ml)

- Héa tan HgCly trong 60m! nuéc, hòa tan KĨ trong 4Ôml nước

- Trộn đều hỗn hợp, để yên, lọc Lấy dịch lọc này làm thuốc thử

Tiến hành cách thử tương tự như thuốc thử Bouchardat, nhận thấy xuất

hiện kết tủa màu trắng chuyển sang vàng nâu, chứng tổ trắc nghiệm đương tính

e Thuốc thử Hager: Dung dịch acid picric bão hòa trong nuớc

Cũng tiến hành cách thử tương tự như thuốc thử Bouchardat, nhận thấy

xuất hiện nhiều kết tảa vàng, chứng tỏ trắc nghiệm dương tính

e® Thuốc thử Dragendorff: Bi(NO;); (8g); HNO; 30% (20 - 25ml); KI (28g); HC! 6N (khoảng 10ml); NaOH 6N (5ml) và nước cất (100m]),

- Hòa tan 8g Bi(NO3)2 trong 20 - 25 ml dung dich HNO; 30%

- Hòa tan 28g KI bằng 1ml dung địch HCI 6N, sau đó thêm 5 ml nước cất vào

Cho từ từ dung dịch Bi(NO¿); pha trong acid HNQa nói trên vào, rỗi thêm nước

cất cho đủ 100ml (dung dịch D)

Để tạo thuốc thử, lấy 2ml dung dịch D và thêm lần lượt 20ml nuớc cất,

5ml dung dịch HCI 6N và 5ml dung dịch NaOH 6N (nếu thấy xuất hiện kết tủa thì có thể thêm vài giọt dung dịch HCI 6N vào) Thuốc thử này phải được bảo

quần trong bóng tối ở 42C.

Cũng tiến hành cách thử tương tự như thuốc thử Bouehardat, nhận thấy

xuất hiện ngay tức khắc nhiều kết tủa màu vàng cam trong dung dịch màu đổ

gạch, chứng tỏ trắc nghiệm dương tính,

» _ Thuốc thử Bertrand: Acid silicotungstic (5g); nude cat (100ml)

- Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm dùng làm ống chuẩn

- Cho 2ml mẫu thử vào một ống nghiệm khác, rồi nhỏ từ từ thuốc thử vào, nhận thấy có kết tủa mầu vàng, chứng tổ trắc nghiệm dương tính

4.1.7, Đinh tính iridoid

® Tạomẫu thử: Lấy 0,5g cao cho vào LÔmi aicol etl, đun hoàn lưu, lọc Sau

đó, thêm vào dịch lọc 10ml nước cất, 2ml dung dịch acetat chì 2%, lọc lại lần

2 Cho H;SO¿ vào dịch lọc lần 2 để loại bổ chì thừa bằng kết tủa PbSO,, loc

bỏ kết tủa Dịch sau cùng này trong một ít alco]l etl dùng làm mẫu thử

e Thuốc thử Trim Hill: CH;COOH (10ml); CuSO, 2% (1ml); HCl dac (0,5ml)

Cho 2ml mẫu thử vào ống nghiệm rồi thém 1 - 2 giọt thuốc thử, đun nhẹ, nhận thấy dung dịch chuyển sang xanh lục, chứng tỏ trắc nghiệm dương tính

4.1.8 Dinh tinh saponin

Saponin là một nhóm chất glycosid có đặc tính chung là khi hòa tan vào

nước sẽ có tác dụng giảm sức căng bể mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt Căn

cứ vào chỉ số tạo bọt để xác định sự hiện của saponin

Dược điển Pháp định nghĩa chỉ số tạo bọt như sau:

Chi số tạo bọt là độ pha loãng của nước sắc nguyên liệu có cột bot cao 1cm, sau khi lắc trong ổng nghiệm tiến hành trong điều kiện qui định

Ðun sôi 1 gam bột nguyên liệu khô trong 100ml nước cất thời gian 30

phút, Lọc, để nguội, thêm nước vào cho đủ 100ml Lấy 10 ống nghiệm có chiều

cao 16cm, đường kính 16mm Cho vào các ống nghiệm lần lượt 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,

8, 9, 10ml nước sắc Thêm nước cất vào mỗi ống cho đủ 10 ml, bịt miệng ống

nghiệm và lắc từng ống theo chiều dọc trong 15 giây, mỗi giây lắc 2 lần Để yên

15 phút rỗi đo chiều cao các cột bọt

Nếu chiều cao cột bọt trong tất cả các ống nghiệm đề dưới 1cm, chỉ số bọt dưới 100 nghĩa là không có saponin

Nếu ống nghiệm thứ n có cột bọt cao 1cm thì chỉ số tạo bọt được tính như

0,01 xn

chỉ số tao bot =

Nếu ống số 1 và ống số 2 có cột bọt cao 1 em hoặc cả 10 ống đều có cột

bọt cao hơn 1 cm thì cần pha loãng để có chỉ số chính xác

Kết quả định tính sự hiện điện một số hợp chất hữu cơ trong cây Hoa Kim

Cương được trình bày trong bắng 6 ở phần nghiên cứu và kết quả

4.2 TRÍCH LY CÔ LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ

4.2.1 Sắc ký côt silica gel áp dụng trên cao eter dầu hỏa ở sơ đỗ 1

Cao eter đầu hỏa (3,52g) được nạp vào đầu cột silica gel Giải ly cột bằng

các hệ dung ly tăng dân tính phân cực từ eter dầu hỏa đến metanol Dung dịch

qua cột được hứng vào các lọ, mỗi lọ 50ml, những lọ cho sắc ký lớp mỏng giống nhau gộp chung thành 1 phân đoạn Kết quả sắc ký cột trình bày trong bảng 7

* Khảo sát phân đoạn D; của bảng 7

Phân đoạn D; (103 —> 176) của bảng 7 có trọng lượng 1,025g, ở đạng sáp, màu vàng nhạt Dùng n-hexan lạnh rửa nhẹ rồi tiến hành sắc ký điểu chế giải ly

bằng dung môi cloroform Thu được 0,025mg chất bột, màu trắng ngà, sắc ký lớp mồng cho một vết duy nhất, được đặt tên là hợp chất DIAM - ETER A

4.2.2 Sắc ký côt trên cao cloroform B của sơ đồ 1

Cao cloroform B (12,68g) được nạp vào đầu cột silica gel, lần lượt giải ly

bằng các hệ dung môi tăng dẫn tính phân cực, dung dịch giải ly được hứng vào

các lọ, mỗi lọ 50ml, các lọ cho sắc ký lớp mồng giống nhau gộp chung thành I phân đoạn Kết quả sắc ký cột được trình bày trong bảng 8

*Khảo sát trên phân đoạn C¿ của bảng 8

Phân đoạn C¿ của bằng 8 (46 — 197) có trọng lượng 2,832g ở dạng sệt,

mầu vàng nhạt Rửa bằng n-hexan lạnh, rồi tiến hành sắc ký điểu chế giải ly

bằng dung môi cloroform thì thu được 0,084g tỉnh thể hình kim không màu, sắc

ký lớp mỏng cho một vết duy nhất, được đặt tên là hợp chất DIAM - CLO A,

* Khảo sát trên phân đoạn E; của bing 8

Phân đoạn E; của bảng 8 (236 -> 317) là chất bột, màu xanh lá cây (3,665g), tiến hành sắc ký cột lần hai trên phân đoạn này

- Nạp cột phân đoạn E; Dung môi giải ly: benzen, cloroform, metanol,

- Kết quả sắc ký cột được trình bầy trong bảng 9

Phân đoạn Dạ của bảng 9 là chất bột màu trắng (2,405g) Tiến hành kết tinh lại nhiều lần trong hệ dung môi cloroform : metanol = 8 : 2, có xử lý bột

than, thu được 0,847g chất bột màu trắng, sắc ký lớp mỏng cho một vết tròn, màu đỏ cánh sen duy nhất, đặt tên là hợp chất DIAM -~ CLO B,

* Khảo sát trên phân đoạn G; của bảng 8

Phân đoạn G; của bang 8 (348 > 396) là chất bột mau trắng (1,020g)

Tiến hành sắc ký điểu chế giải ly trong hệ dung môi eter dầu hồa : etil acetat =

1:1, thì thu được chất bột, màu trắng (0,625g), sắc ký lớp mỏng cho một vết tròn duy nhất, màu đỏ cánh sen, chúng tôi đặt tên là hợp chất DIAM - CLO C

4.2.3 Sắc ký cột silica gel áp dung trên cao metanol của sợ đồ 1

Cao metanol (35,27g) được nạp vào đầu cột silica gel Sử dụng các hệ

dung ly tăng dẫn tính phân cực từ cloroform dén metanol, dung dịch qua cột được hứng vào các lọ, mỗi lọ 50ml, các lọ có sắc ký lớp mỗng giống nhau được gom

thành một phân đoạn Kết quả sắc ký cột được trình bày trong bảng 10.