Chương 3: Phương pháp nghiên cứu mô học ppt

Mục tiêu cố định mẫu: Ngăn chặn sự hoại tử và tan rã  Làm các tổ chức mô giữ vững cấu trúc trong suốt quá trình xử lý và nhuộm mẫu bằng nhiều loại hóa chất khác nhau...  Đối với loại

CHƯƠNG 3

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU MÔ HỌC

 Tại sao phải nghiên cứu mô học?

 Vai trò của mô học trong công tác nghiên cứu về thủy sản như thế

nào?

 Mô học hiện nay đã phát triển như thế nào?

Lịch sử nghiên cứu mô học

19

Phát triển nhiều kĩ thuật mới

Phương pháp nghiên cứu mô học

 Qui trình cơ bản trong nghiên cứu

1 Cố định mẫu:

Tại sao phải cố định mẫu?

 Mẫu mô hay cơ quan của cá hoặc tôm

sau khi tách ra khỏi cơ thể sẽ chết đi và trải qua quá trình hoại tử và nhanh

chóng tan rã (trump et al., 1980)

 Vì vậy cần phải ngăn chặn sự hoại tử và

tan rã đó bằng việc cố định nhanh và ít gây ra sự thay đổi cấu trúc nhất

Mục tiêu cố định mẫu:

 Ngăn chặn sự hoại tử và tan rã

 Làm các tổ chức mô giữ vững cấu trúc trong suốt quá trình xử lý và nhuộm mẫu bằng nhiều loại hóa chất khác nhau

 Một mẫu mô được cố định tốt khi

những tế bào cấu tạo nên mô đó

vẫn giữ nguyên hình dáng, thể hiện được nhiều chi tiết và cấu trúc,

đồng thời giữ được mối liên quan

tương hỗ trong tế bào và mô giống như còn sống

 Mô có thể được cố định bằng nhiều phương pháp:

 Vật lí : nhiệt độ

 Hóa học: các loại hóa chất

 Các loại hóa chất cố định

 Bouin:

 AFA Davidson:

 Formol trung tính (10%):

 Đối với loại dung dịch cố định có khả năng ngấm kém, chiều dày mẫu mô không quá 1-2mm

 Nếu dung dịch có khả năng ngấm mạnh và sâu thì chiều dài của nó không quá 5mm

 Thể tích dung dịch cố định: thể tích dung dịch cố định cần lớn hơn nhiều

so với thể tích mẫu mô (ít nhất 50 lần)

 Thời gian cố định: thời gian cố định phụ thuộc vào từng loại dung dịch

cố định, thường dao động từ 2-4h

 Nhiệt độ cố định: Nhiệt độ cao làm tăng và lạnh làm chậm khả năng

ngấm của dung dịch cố định Đối với loại dung dịch cố định dễ bay hơi

nên tiến hành ở nhiệt độ thấp

 Quá trình pha hóa chất cố định nên thực hiện trong tủ hút

 Sau khi cố định thì mẫu cần phải

được rửa (dung dịch cố định có thể làm thay đổi tính bắt màu của tế

bào)

 Thời gian rửa bằng với thời gian cố định

 Có thể rửa bằng nước hoặc cồn

Cắt tỉa, định hướng mô

 Mục đích: Định hướng những mô

cần quan sát

 Mẫu mô có thể được cắt bỏ những phần không cần thiết, giúp tiết kiệm thời gian trong quan sát

Qui trình xử lý mẫu

1. Loại nước

2. Làm trong mẫu

3. Ngấm paraffin

1 Loại Nước

 Việc khử nước phải đảm bảo nguyên tắc là loại bỏ hết nước trong mô mà không làm tế bào bị biến dạng hoặc không làm vị trí của thành phần cấu tạo tế bào trong mô bị thay đổi

 Quá trình loại nước được thực hiện bằng cách nhúng mẫu mô qua hàng loạt các dung dịch cồn có nồng độ

từ thấp đến cao Thời gian khử nước tùy theo độ dày của mẫu mô

Ví dụ: xử lí mẫu qua cồn

50-70-95-100

2 Làm trong mẫu

 Mục đích:Do paraffin không thể hòa tan vào cồn nên cần một dung môi vừa có khả năng hòa tan cồn và

paraffin

 Có nhiều loại dung môi làm trong

mẫu: chloroform, xilen…

 Các dung môi này thường có chỉ số khúc xạ cao

3 Ngấm paraffin

 Mẫu được ngâm trong các lọ

paraffin nóng chảy (57-600) với thời gian thay đổi 1-3h tùy theo kích

thước mẫu mô

 Đối với những mẫu mô ngấm chậm phải kéo dài thời gian nâm trong

paraffin có thể từ 6-12h

 Thông thường trong các qui trình

mẫu thường được chuyển qua nhiều dung dịch paraffin

 Mục đích: dung môi của paraffin

trong miếng mô được đẩy ra hết

ĐÚC KHỐI

 Mục đích: Để cố định mẫu

 Đối với mẫu cắt lạnh thì khối được đúc bằng gelatin hay agar thay vì bằng paraffin

 Trở ngại chính trong quá trình đúc khối paraffin là làm miếng mô co lại, nguyên nhân là do nhiệt độ

nóng chảy của paraffin (Bennett et al., 1976)

 gan cá hồi nếu được đúc khối theo

kĩ thuật thường sử dụng là paraffin thì mức độ co của mẫu so với ban đầu khoảng 25%

 trái lại nếu đúc khối bằng glycol

methacrylate thì mẫu mô chỉ co lại khoảng 1-2%

 Khi cần phân tích các thể huyền phù trong tế bào bằng kính hiển vi

quang học thì một số qui trình xử lý mẫu sẽ được thay đổi

 Thí dụ: nghiên cứu tế bào máu …

CẮT MẪU

 Mục đích của bước này là nhằm cắt mẫu mô thành những lát cắt thật mỏng có khả năng cho ánh sáng

xuyên qua để có thể quan sát được bằng kính hiển vi

 Có 2 phương pháp cắt mẫu thường được áp dụng

 Cắt lạnh:

 Cắt mô đúc trong khối paraffin:

 Điểm khác biệt của hai phương pháp này:

 Nhiệt độ:

 Dung dịch cố định

 Hình dạng mẫu khi cắt

Dán lát cắt vào lame

 Tùy theo mục đích mà lựa chọn độ dài của dãy băng Sau khi dãy băng được lấy ra thì đặt chúng vào nước

có nhiệt độ 400-440C đễ làm căng

mặt băng

 Có nhiều cách để dán lát cắt vào

phiến kính, cách thông dụng nhất là dán bằng dung dịch Mayer’s

albument hoặc gelatin

 Cách chuẩn bị dung dịch để dán

mẫu:

(i) Mayer’s albumen: lòng trắng

trứng+ glycerol (1:1)+thymol

crystal Lọc qua giấy lọc thô

(ii) Gelatin: 1% gelatin+1%

potassium dichromate (1:1) Cho dung dịch vào chậu nước

(0.002%)

NHUỘM MÀU

Mục đích: quan sát tế bào rõ hơn

 Có nhiều phương pháp để nhuộm mẫu

 Loại bỏ paraffin: Do paraffin rất khó thấm được các loại thuốc nhuộm, nên cần phải loại chúng ra khỏi mẫu Xylen là hóa chất thường được sử dụng cho mục đích này

 Loại xylen bằng cồn tuyệt đối: Xylen

không hòa tan được vào các dung dịch có dung môi là nước nên cần phải loại xylen bằng cồn tuyệt đối

 Xử lý mẫu qua cồn với nồng độ giảm dần

Làm cho mẫu ngậm nước: là bước trung gian để chuyển mẫu về cùng điều kiện với dung môi hòa tan loại thuốc nhuộm được

sử dụng đầu tiên Thông thường nước cất được sử dụng cho mục đích này

 Nhuộm màu: mẫu được nhuộm bằng 1

dung dịch hoặc bằng nhiều loại thuốc

nhuộm khác nhau Thời gian nhuộm có

thể từ vài phút đến vài giờ tùy thuộc vào loại thuốc nhuộm

 Khử nước: Hầu hết các trường hợp, lát mẫu cắt trong paraffin phải được

cố định bảo quản trong một môi

trường có thể hòa tan với xylen

 Làm trong mẫu: cho mẫu qua xylen

để loại cồn

 Đóng khung: Thường sử dụng keo Canada để dán lamelle vào phiến kính.

Kĩ thuật nhuộm mẫu bằng Hematoxylin và

Eosin

1. Phiến mẫu sau khi loại paraffin sẽ

làm ngậm nước theo các bước:

 Nhúng phiến mẫu vào xylen 2-3

phút

 Chuyển sang xylen sạch 1-2 phút

 Chuyển lần lượt sang các dung

dịch cồn 95%, 70% và 50% 1 phút cho mỗi dung dịch

 Rửa mẫu trong nước cất

2. Chuẩn bị phẩm nhuộm

 Hematoxylin: Hòa tan 1g

hematoxylin trong 750ml Thêm

vào 0.2g Sodium iodate; 1g acid

citric và 50g chloral hydrate Thêm nước vào cho đủ 1L

 Dung dịch chuẩn 1% eosin: 1g

 Nhúng phiến mẫu trong

Hematoxylin 15 phút

 Rửa phiến mẫu dưới vòi nước 20

phút

 Nhúng phiến mẫu vào dung dịch

nhuộm eosin từ 15 giây đến 2 phút tùy vào mức độ bắt màu của mẫu

3. Chuyển phiến mẫu sang 2 lần cồn

95% (chuyển sang dung dịch mới cho mỗi lần lập lại), mỗi lần 2 phút

để rửa hết eosin thừa

4. Quan sát phiến mẫu bằng kính

hiển vi, mẫu đạt yêu cầu khi mẫu trong và tế bào chất bắt màu từ

hồng nhạt đến cam

5. Rửa phiến mẫu lại trong cồn 95%

sau đó chuyển phiến mẫu sang 2 lần cồn tuyệt đối, mỗi lần 2 phút

 Làm trong mẫu bằng xylen 2 lần

mỗi lần 2 phút Sau khi nhuộm, dán phiến kính mỏng lên

6. Với phương pháp nhuộm này, nhân

tế bào sẽ có màu xanh dương

Vùng tế bào chất với lưới nội chất

có màu xanh nhạt hay tím Phần tế bào chất còn lại sẽ có màu hồng

sậm