Tái lập trình nhân (NUCLEAR REPROGRAMMING) ppt

Tái lập trình nhân là lấy nhân từ một tế bào đã xác định của cơ thể tế bào sinh dưỡng như tế bào da và chuyển nó vào một tế bào gốc đã được loại bỏ nhân, khi đó, tế bào chuyển nhân thu đ

TÁI LẬP TRÌNH NHÂN

(NUCLEAR REPROGRAMMING)

I TÁI LẬP TRÌNH TẾ BÀO SINH DƯỠNG

1 Khái niệm

Tái lập trình nhân là thuật ngữ dùng mô tả kỹ thuật cho phép thay đổi tiềm năng phát triển hay định hướng của tế bào Tái lập trình nhân là lấy nhân từ một tế bào đã xác định của cơ thể (tế bào sinh dưỡng như tế bào da)

và chuyển nó vào một tế bào gốc đã được loại bỏ nhân, khi đó, tế bào chuyển nhân thu được có khả năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau

Có 2 hướng tái lập trình nhân là chuyển nhân vào tế bào sinh dưỡng

(somatic cell nuclear transfer SCNT) và tạo từ tế bào iPS (induced

pluripotent stem cells)

2 Các hình thức chuyển nhân

a Chuyển nhân tế bào sinh dưỡng

Là phương pháp chuyển nhân của một tế bào sinh dưỡng vào một tế bào

phôi đã lấy nhân Khi đó, nhân của tế bào được chọn sẽ tái lập trình lại trong điều kiện tế bào chất của tế bào nhận

Hạn chế của phương pháp này là tiềm năng của phôi và hiệu quả tạo dòng thấp Hơn nữa có nhiều sự bất bình thường ở thế hệ tạo dòng, đồng thời có

những hạn chế về mặt xã hội khi thực hiện trên người

b Dung hợp tế bào

Tiến hành dung hợp tế bào biệt hóa và tế bào toàn năng có thể hình thành một tế bào vạn năng có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào nhưng

c Dịch chiết tế bào

Những tế bào thấm được có thể thu nhận dịch chiết của những tế bào vạn năng Tế bào được xử lý với những marker vạn năng tái biểu hiện và tái biệt hóa thành những dòng khác nhau

Phương pháp này có những biểu hiện hạn chế của tế bào ngườn ban đâu

và việc tái lập trình chỉ xảy ra ở mưc độ giới han thấp

d Cấy ghép tế bào

Sự biểu hiện ngoài nhân của các gene kiểm soát quá trình tái lập trình có thể vai trò như đối với những tế bào vạn năng giúp quá trình xảy ra và hình thành những tế bào vạn năng mới

Tuy nhiên, việc tái kích hoạt những gene chuyển vị có thể là xuất hiện các oncogen làm chết cá thể con vì ung thư

II CÁC YẾU TỐ KIỂM SOÁT QUÁ TRÌNH TÁI LẬP TRÌNH

Phương pháp tách chiết tế bào (cell extract) và chuyển nhân (nuclear

transfer) cho thấy có sự tổ chức lại chromatin, sự cải biên DNA và histone trong tái lập trình tế bào sinh dưỡng

Một nghiên cứu khác cho thấy có sự liên quan giữa việc tái hoạt động bất thường của gene Oct-4, Nanog và Sox2 trong blastocyst được tạo dòng từ tế bào sinh dưỡng và sự phát triển bất thường của dòng Ngược lại, những dòng

từ nguồn ES (embryo sterm), EG (embryo germ), EC (embryo carcinoma) thì biểu hiện gene Oct-4 và hiệu quả tạo dòng tăng hơn

Ngày nay, người ta đã bắt đầu từng bước hiểu về cớ chế trong nhân và ngoài nhân duy trì tình trạng chưa biệt hóa của những tế bào gốc phôi trong khi cho phép những tế bào này duy trì sự cân bằng với những tế bào khác trong sự phát triển của tế bào sinh dưỡng

Rất nhiều yếu tố đều hòa của tiến trình này được ghi nhận bao gồm cả các yếu tố môi trường ngoại bào cũng như các yếu tố trong nhân và ngoài nhân

1 Các yếu tố ngoài tế bào

Các yếu tố ngoài tế bào tham gia điều hòa quá trình tái lập trình nhân bao gồm một phức hợp các yếu tố hoạt động theo những con đường hoạt hóa riêng, đan xen nhau, chủ yếu là từ những tín hiệu truyền tin qua màng

Một số yếu tố cơ bản được biết như sau:

a LIF (leukemia inhibitort factor): là một protein thuộc họ cytokine vai trò cho phép phôi duy trì tính toàn năng LIF là protein hòa tan và được tiết vào trong serum, trong điều kiện nuôi cấy có bổ sung LIF trong serum cũng cho kết quả tương tự

Cơ chế hoạt động của LIF là bằng cách liên kết với LIFR-gp130

heterodimer tại bề mặt tế bào và hoạt hóa tín hiệu truyền tin Stat3 Sau khi được hoạt hóa, Stat3 sẽ tự phosphoryl hóa và dimmer hóa chính nó trước khi chuyển vị vào bên trong nhân và tại đây, nó hoạt động như là một yếu tố phiên mã Hiện nay, đích cuối của Stat3 ở vùng downstream vẫn chỉ biết một phần là c-Myc

b BMP4 là protein thuộc họ TGFβ, BMP4 có khả năng liên kết với

receptor kinase của serine hoặc threonine Vùng downstream của BMP4 là protein SMAD Chức năng của BMP4 là kiểm soát biệt hóa tế bào hơn là kích hoạt tự sinh

2 Các gene kiểm soát quá trình tái lập trình trong và ngoài nhân

Có 3 gene điều hòa này mã hóa cho yếu tố điều hòa phiên mã quan trọng

mà ở những tế bào chưa được biệt hóa không thể hiện bao gồm Oct4, Sox2

và Nanog

Nhóm protein Polycomb (PcG) là những yếu tố kìm hãm phiên mã mà chức năng của nó là duy trì sự đồng nhất tế bào trong suốt thời kỳ phát triển cuối thông qua những cải biên ngoài nhân (epigenetic modification) của cấu trúc chromatin Bằng chứng cho thấy rằng protein PcG có chức năng kìm

hãm phiên mã những gene phát triển trong tế bào ES, biểu hiện của nó có thể xem như một promoter biệt hóa

Nhiều gene đích Oct4, Soc2 và Nanog được xác định cũng là gene đích PcG, quá trình cải biên chromatin có thể diễn ra liên quan đến sự điều hòa 3 gene chìa khóa này

Điều thú vị là cấu trúc chromatin liên quan với rất nhiều gene chìa khòa này lại liên quan đến domain bivalent bao gồm cả kìm hãm những điểm methyl hóa lysine số 27 của histone H3 và kích hoạt methyl hóa lysine số 4 của histone H3 domain bivalent này thì biến mất trong những tế bào đã biệt hóa, nó được cho là một mấu chốt quan trọng trong việc duy trì sự phát triển tính vạn năng của tế bào ES

Do đó, yếu tố toàn năng Oct4, Sox2 và Nanog hoạt động phối hợp cùng PcG để làm im lặng những tác nhân điều hòa phát triển ở trạng thái đa năng, trong khi những gene tương tự, mở những tác nhân điều hòa ngoài nhân hoạt động phiên mã chuẩn bị biệt hóa Khi những yếu tố điều hòa phiên mã cho tính toàn năng và tự tái sinh trên tế bào ES được hiểu rõ ở mức độ phân tử thì nhiều khả năng tái lập trình nhân trên một loại tế bào thành tế bào khác bằng hoạt động của hệ thống những yếu tố điều hòa này

Hình sau cho thấy con đường tác động của các yếu tố liên quan trong tái lập trình

Oct4, Sox2 và Nanog là những chìa khóa cho quá trình toàn năng Trong

đó Oct4 (cũng được họi là Pout5f1) và Nanog được xác định là những yếu tố then chốt

a Gen Oct 4

Oct-4 còn được gọi là Pou5f1, là protein liên kết với DNA vai trò là yếu

tố kích hoạt hoặc ngăn cản sự phiên mã của vài gene, đặc biệt là những gene biểu hiện trong suốt giai đoạn phát triển đầu của phôi, do đó oct-4 có vai trò quan trọng trong giai đoạn đầu phát triển và biệt hóa tế bào

Cấu trúc không gian của Oct4

Oct4 điều hòa biểu hiện gene bằng tương tác với những yếu tố khác trong nhân, bao gồm hộp phiên mã yếu tố Sox2

Ở phôi động vật hữu nhũ thì có 2 lớp tế bào trong giai đoạn phôi 64 tế bào, lớp ngoài là lá phôi (trophetoderm) phát triển thành nhau thai vá các bộ phận khác nuôi thai, lớp trong phát triển thành phôi được gọi là ICM (inner cell mass) Những tế bào ICM có thể phân lập và nuôi cấy invitro thành tế bào gốc phôi ES (embryo stem cell) ES là những tế bào toàn năng có khả năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau tương ứng trong nhiều loại

mô khác nhau của cơ thể Và oct-4 chỉ biểu hiện trong những tế bào chưa được đánh dấu biệt hóa có nhiều tiềm năng phát triển như tế bào ES và tế bào EG (embryo germ) Oct-4 duy trì tiềm năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau cho tế bào gốc phôi, tuy nhiên khi phôi làm tổ bào tử cung, oct-4 mất đi, và các tế bào đi vào biệt hóa cho ra hơn 200 loại tế bào khác có trong cơ thể

Sự biểu hiện của ost-4 gene được duy trì trong những tế bào gốc có thể tự tái sinh, tuy nhiên, trong tế bào phát triền của nội bì và ngoại bì thì lượng oct-4 khá cao và ngược lại trong tế bào lá phôi

Bảng so sánh hàm lượng như sau:

Phôi thiếu oct-4 phát triển được tới giai đoạn blastocys nhưng bị lỗi sau khi cấy ghép Phân tích sâu hơn cho thấy blastocys chứa tế bào lá phôi mà thiếu tế bào ICM Đa số các phôi được tạo dòng bị lỗi đều cho thấy có sự biểu hiện của oct-4 ở cả tế bào lá phôi và tế bào TCM hoặc là thiếu vắng sự biểu hiện ở cả 2 lớp tế bào này

Mức độ cân bằng giữa Oct4 và yếu tố phiên mã Cdx2 (caudal-type

homeodomain) chịu ảnh hưởng lẫn nhau Oct4 liên quan đến thiết lập ICM, nơi mà Cdx2 cần để phát triển lá nuôi phôi Còn lớp tề bào bên ngoài thì Oct4 lại biến mất, đồng thời Cdx2 cũng có rất hạn chế

b Gene Sox2

Sox 2 (SRY-type high mobility group box 2) là một protein thuộc họ gồm

20 protein có cấu trúc tương tự như motif liên kết DNA box HMG Tuy nhiên,Sox2 có vai trò quan trọng trong sự vạn năng của tế bào Yếu tố điều

Gene Sox 2 là một gene khuyết intron nằm trên 1 gene gọi là Sox2OT (phiên mã trùng lắp Sox2 – Sox2 overlapping transcrip), có 317 amino acid, 34,4 kDa Domain HMG chứa yếu tố phiên mã kiểm soát khả năng toàn năng cũng như vạn năng của tế bào Domain HMG liên kết linh động với DNA mà không có trình tự đặc hiệu và có thể làm uốn cong DNA, hạn chế yếu tố điều hòa sau dịch mã gắn vào

Phức hợp theo tỷ lệ Sox2:Oct4 là quan trọng nhất trong hệ thống điều hòa gene Sox2 và Oct4 thể hiện đồng thời rất sớm trong phôi, ngay từ giai đoạn phôi morula Chúng được tìm thấy trong TCM của blstocyst của phôi tiền cấy ghép, trong lá mặt (epiblast), mô được biệt hóa trong phôi và tế bào gốc sau cấy ghép blastocyst

Điều quan trọng của Sox2 và Oct4 là khả năng điều hòa của nó cùng với c-Myc và Klf4 hoặc Nanog và Lin28 làm ngăn cản sự biệt hóa tế bào sinh dưỡng thành tế bào gốc toàn năng iPS (induced pluripotent stem cells) có những đặc điểm tương tự như tế bào gốc phôi

c Nanog

Tế bào thiếu Nanog sẽ biệt hóa tùy ý trong lớp nội bào nguyên thủy

Ngược lại, nếu biểu hiện quá sẽ kích thích sự tự tái sinh độc lập với yếu tố ngăn chặn Cytokine leukemia (cytokine leukemia inhibitory foctor LIF), chức năng được hoạt hóa bởi yếu tố phiên mã Stat3

Mặc dù con dường LIF-Stat3 có thể bỏ qua trong tế bào ES người, nhưng những phân tích chức năng cho thấy sự tương tự như vậy giữa Oct4 và

Nanog trong những tế bào này Do đó, Oct4, Sox2 và Nanog được xem là

những biểu hiện sớm nhất của gene nhằm duy trì sự toàn năng Tuy nhiên,

nghiên cứu gần đâycũng cho thấy chúng có con đường riêng mà củng điều

hòa những mục tiêu chung khác trong genome Sự cân bằng nhỏ giữa những yếu tố điều hòa này có thể quyết định số phận của tế bào

Sự cân bằng giữa Nanog và yếu tố phiên mã Gata4, Gata6 cũng cần cho

sự phát triển nội bỉ nguyên thủy có Gata 4 hoặc Gata6 thì có sự biết hóa tế bào thành tế bào nội bì nguyên thủy, điều này đồng nghĩa với thiếu Nanog Bảng sau cho thấy kết quả phân tích những yếu tố phiên mã trong tế bào vạn năng ES và sự phát triển của phôi

III TÁI LẬP TRÌNH NGOÀI NHÂN (EPIGENETIC)

Việc tái cấu trúc chromatin cùng với sự tái lập một chương trình biểu hiện gene mới mà đặc trưng theo từng dòng tế bào

Sự cải biên bao gồm methyl hóa DNA và histone tại một số vị trí, acetyl hóa, phosphoryl hóa và ubiquitine hóa Histone

Quá trình methyl hóa DNA liên quan đến việc gắn 1 nhóm methyl vào vị trí 5’ của cystone, phần không mã hóa của nucleoside để dành cho việc biểu hiện gene

Hình v
cytosine và 5-methyl cytosine

Methyl hóa xảy ra trong vùng chromosome giàu trình tự

cytosine-guanosine lặp lại, thường ở đầu 5’ của gene Quá trình này ở tế bào sinh dưỡng gần như duy trì trong mỗi chu kỳ phân bào Sự thay đổi mức độ

methyl hóa này thì phụ thuộc độ tuổi, hoặc sự bất thường của tế bào

Hầu hết tất cả các cải biên ngoài nhân đều liên quan đến sự methyl hóa DNA, cụ thể là sự methyl hóa protein histone, một protein cấu trúc của

DNA

Những phân tích gần đây về toàn bộ chức năng của chromatin cho thấy một sự liên hệ chức năng cao của protein cấu trúc chromatin là histone H1 và HP1 (heterochromatin associated protein) khi so sánh giữa chromatin của

Thay cho vị trí của histone H3 là histone H1, liên kết cứng hơn trong

chromatin của những tế bào ES biệt hóa Điều này cho thấy protein cấu trúc liên kết lỏng lẻo với chromatin trong tế bào vạn năng, nên có khả năng tái sắp xếp lại cấu trúc chromatin trong quá trình biệt hóa

Tương tự như vậy, gene đặc hiệu mô được cho là im lặng trong tế bào chưa biệt hóa có thể ít nhiều biểu hiện trong tế bào ES Có một domain

bivalent vừa ngăn cản histone H3-K27me3 (methyl hóa lysine 27 của histone 3) vừa kích hoạt H3-K4me3 làm cải biên những vùng rộng lớn những gene quan trọng mà bình thường im lặng trong tế bào ES trở thành hoạt động dưới quá trình biệt hóa Điều quan trọng là không phải tất cả những gene đặc hiệu

mô đều có những domain bivalent này, và cấu trúc chromatin cơ bản trong những gene này và sự tái cấu trúc của nó trong sự vạn năng còn những đặc trưng khác hơn nữa

Quá trình tái lập trình phôi tế bào động vật hữu nhũ trong tạo dòng xảy ra vào 2 thời điểm Một là ngay sau khi thụ tinh, hay ngay sau khi dung hợp 2

tế bào với nhau, và được gọi là tái lập trình tiền cấy ghép (preimplantation reprogramming) Quá trình này hầu như liên quan trực tiếp trong tạo dòng và hầu hết là có những khuyết điểm trong quá trình phát triển dòng trưởng

thành

Hai là trong suốt quá trình hình thành giao tử đực và cái, được gọi là tái lập trình giao tử (gametogenic reprogramming), tuy nhiên trường hợp này chỉ được nghiên cứu trong tạo dòng sản phẩm hữu tính

Sự tái lập trình ngoài nhân không phù hợp dẫn đến những hậu quả bất thường nguy hiểm đến sức khỏe động vật phát triển bằng kỹ thuật chuyển nhân Phôi từ nguồn tế bào chuyển nhân phải được demethyl hóa đặc trưng

và có mức độ methyl hóa cao trong nhân cho để duy trì tính vạn năng Sự phân chia sớm bị sai lệch của phôi chuyển nhân chiếm tỷ lệ cao có thể do thiếu sự dimethyl hóa này

Tóm lại sự tái lập trình trong quá trình chuyển nhân là một tiến trình phức tạp của cả hệ thống các tín hiệu trong và ngoài tế bào cũng như trong và ngoài nhân Cho đến nay, chỉ một số cơ chế được hiểu, còn lại là những dự