CNSHDV: Tái lập trình nhân tế bào tạo tế bào gốc Pluripotent

Các nhân tố xác định Thực tế là nhân tế bào soma có thể được tái lập trình bằng cách chuyển vào tế bào trứng hoặc dung hợp với các tế bào gốc phôi, điều này đòi hỏi tế bào trứng và tế bà

Trang 1

TÁI LẬP TRÌNH NHÂN BẰNG CÁC NHÂN TỐ XÁC ĐỊNH

Trang 2

CẤU TRÚC BÀI BÁO CÁO PHẦN I MỞ ĐẦU

PHÂN II NỘI DUNG

1 Các nhân tố xác định

2 Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent

3 So sánh phương pháp sử dụng nhân tố xác định với các phương pháp khác.

PHẦN III KẾT LUẬN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Trang 3

PHẦN I: MỞ ĐẦU

Tế bào gốc phôi hứa hẹn là nguồn cung cấp tế bào cho các liệu pháp cấy ghép tế bào, có thể trong tương lai được sử dụng để điều trị các bệnh khác nhau và thương tích Tuy nhiên, như trong trường hợp cấy ghép nội tạng, từ chối miễn dịch sau khi cấy ghép là một vấn đề vướng mắc với loại trị liệu này Hơn nữa, việc sử dụng các phôi người hiện nay gặp phải những khó khăn nghiêm trọng về mặt đạo đức Những vấn đề này có thể được khắc phục nếu tế bào pluripotent được tạo ra từ các tế bào soma của bệnh nhân Có 3 phương pháp khác nhau nhằm tạo tế bào pluripotent từ tế bào cơ thể là: phương pháp chuyển nhân, phương pháp dung hợp tế bào và phương pháp tái lập trình nhân bằng các nhân tố xác định Trong phạm vi của bài tiểu

luận này chỉ xin đề cập đến phương pháp thứ 3: Phương pháp

tái lập trình bằng các nhân tố xác định.

Trang 4

PHẦN I: MỞ ĐẦU

Hình 1: Các phương pháp tái lập trình nhân tế bào soma

Trang 5

Phần II: Nội dung

1 Các nhân tố xác định

Thực tế là nhân tế bào soma có thể được tái lập trình bằng cách chuyển vào tế bào trứng hoặc dung hợp với các tế bào gốc phôi, điều này đòi hỏi tế bào trứng và tế bào gốc phôi phải chứa nhân

tố phục hồi Các nhân tố phục hồi này có thể tương tác với nhau

để duy trì khả năng tạo tế bào pluripotent trong các tế bào gốc phôi Dưới đây là một số nhân tố thường được sử dụng trong việc tái lập trình nhân tế bào

Trang 6

1.1 Oct3/4 (POU5F1).

POU5F1 là một yếu tố phiên mã thuộc nhóm POU, đặc biệt là trong các tế bào gốc phôi,phôi sớm và các tế bào mầm, và thường được lựa chọn là Oct3

(Okamoto et al 1990) hoặc Oct4 (Scholer et al 1989). Vô hiệu hóa Oct3/4, phôi

sẽ chết trong tử cung của con cái mang (Nichols et al 1998), mặc dù các phôi

này có thể đạt tới giai đoạn phôi nang, nuôi cấy in vitro các khối nội bào của hợp

tử chỉ làm thay đổi sản phẩm của phôi nang thành dòng dưỡng bào, và Oct3/4 biến các tế bào ES biệt hóa thành các dưỡng bào, trong khi đó các tế bào đối chứng có mặt Oct3/4 lại có thể duy trì trạng thái tế bào gốc pluripotent (Niwa

et al 2000). Tương tự như vậy, vô hiệu hóa Oct3/4 bằng siRNA trong tế bào ES người làm cho những tế bào này biệt hóa thành dòng dưỡng bào (Zaehres et al.

2005). Ngược lại, tăng Oct3/4 lên gấp đôi trong các tế bào ES gây ra sự biệt hóa

thành nội bì và trung bì nguyên thủy (Niwa et al 2000) Do đó, hàm lượng Oct3/4

rất quan trọng, quyết định số phận của các tế bào trong các tế bào ES

Trang 7

1.2 Sox2

Sox2 là một yếu tố phiên mã thuộc nhóm Sox (SRY-related HMG-box)

có trong các tế bào ES, phôi sớm, các tế bào mầm và tế bào gốc thần kinh Vô hiệu hóa Sox2, phôi sẽ chết ở giai đoạn phát triển ngoại bì nguyên thủy (Avilion et al 2003) Hợp tử có thể phát triển thành phôi nang với hình thái bình thường, nhưng các tế bào chưa phân hóa không tăng lên khi phôi nang được nuôi cấy in vitro, và chỉ có lớp dưỡng bào

và nội bì nguyên thủy được tạo ra Phá vỡ Sox2 ở các tế bào ES chuột bằng cách loại trực tiếp có điều kiện hoặc RNAi dẫn đến sự biệt hóa rất nhanh (Ivanova et al 2006; Masui et al 2007) Những dữ liệu này chứng minh rằng Sox2 là không thể thiếu đối với việc duy trì khả năng tạo ra tế bào pluripotent trong cả phôi sớm và các tế bào ES Một protein thuộc nhóm Sox khác, Sox15, cũng có hàm lượng cao trong các

tế bào ES, nhưng vai trò của nó vẫn chưa được đánh giá rõ ràng

(Maruyama et al 2005).

Trang 8

1.3 Nanog

Nanog là một protein homeobox, đặc biệt có mặt trong các tế bào pluripotent và bên trong khối tế bào của phôi giai đoạn phôi nang

(Chambers et al 2003; Mitsui et al 2003) Vô hiệu hóa Nanog

phôi bị phá vỡ các tổ chức mô ngoài phôi tại E5.5, không thể thấy rõ lá mặt hoặc ngoại bì nguyên thủy (Mitsui et al 2003)

Thiếu Nanog phôi nang vẫn có hình thái bình thường, nhưng khối nội bào chỉ tạo ra các tế bào nội bì đỉnh và không có các tế bào có

nguồn gốc từ ngoại bì khi phôi nang được nuôi cấy in vitro Tế

bào ES có thể thiếu Nanog, nhưng chúng có xu hướng biệt hóa thành dòng nội bì ngoài phôi ngay cả khi có mặt của LIF (yếu tố

ức chế bệnh bạch cầu) Một nhóm khác báo cáo rằng ngay cả với

dị hợp tử Nanog cũng làm cho các tế bào ES không ổn định, dễ

bị tổn thương và tự động phân hóa (Hatano et al 2005)

Trang 9

Phần II: Nội dungRNAi-mediated loại bỏ Nanog đã dẫn tới sự biệt hóa đối với cả tế bào ES ở chuột (Hough et al 2006; Ivanova et al 2006) và người (

Hyslop et al 2005; Zaehres et al 2.005) Quan trọng hơn, sự có

mặt của Nanog ở các tế bào ES chuột cho phép các tế bào này tự đổi mới khi không có LIF Tương tự như vậy, sự có mặt của Nanog trong tế bào ES người kích hoạt sự tăng trưởng mà không có dưỡng bào nào (Darr et al 2006) Ngoài ra, sự có mặt của Nanog trong tế

bào ES cho thấy hoạt động tái lập trình tăng lên rõ rệt sau khi dung hợp với các tế bào soma (Silva et al 2006) Sự biểu hiện của Nanog được điều hòa bởi Oct3/4 và Sox2 (Kuroda et al 2005; Rodda

et al 2005; Wu da & Yao 2005) và bị ngăn chặn bởi p53 (Lin et al

2005), GCNF (Gu et al Năm 2005) và TCF3 (Pereira et al 2006)

Phân tích gen kết tủa kháng nguyên trên nhiễm sắc thể chứng minh rằng Oct3/4, Sox2 và Nanog chia sẻ nhiều gen đích ở tế bào ES ở

cả chuột và người (Boyer et al 2005; Loh et al 2006)

Trang 10

1.4 c-Myc

c-Myc là một yếu tố phiên mã mở khóa helix-loop-helix/leucine (chuổi leucine xoắn – vòng – xoắn) liên kết với protein của chính nó, Max c-Myc được điều hòa bởi STAT3 (Kiuchi et al năm 1999) và đóng vai trò quan trọng trong việc

tự đổi mới và duy trì khả năng tạo tế bào pluripotent ở các tế bào ES chuột

(Cartwright et al, 2005): sự biểu hiện ổn định của c-Myc gây ra tự làm mới của các tế bào ES chuột mà không cần LIF, trong khi đó, các dạng trái ngược của c- Myc gây ra sự biệt hóa ngay cả khi có mặt của LIF GSK3β điều hòa ngược hoạt động của c-Myc bằng cách phosphoryl hóa phụ thuộc vào sự suy giảm của proteasome (Sears et al, 2000). Vì vậy, c-Myc là một mục tiêu chung cho cả LIF và tín hiệu dẫn đường Wnt c-Myc gắn trong hệ gen ở nhiều vị trí khác nhau (Fernandez et al 2003; Li et al 2003; Cawley et al năm 2004) đã cho chúng ta

ý tưởng làm thay đổi cấu trúc nhiễm sắc thể (Knoepfler et al 2006) và kích hoạt

sự biểu hiện của một số miRNA (O'Donnell et al 2005).

Trang 11

Phần II Nội dung

1.5 Klf4

Klf4 là một nhân tố phiên mã Kruppel-like (còn được gọi nhân tố enriched Kruppel-like, GKLF) (Rowland et al 2005). Ban đầu được xác định là một nhân tố ức chế khối u trong các bệnh ung thư đường tiêu hóa

gut-(Zhao et al 2004; Wei et al, 2005). Một mô hình loại bỏ có điều kiện có vai trò hỗ trợ cho Klf4 trong bệnh ung thư đường tiêu hóa (Katz et al 2005).

Tuy nhiên, Klf4 biểu hiện quá nhanh trong ung thư tế bào biểu bì hình vảy

và bệnh ung thư vú (Foster et al 1999, 2000) Hơn nữa, sự cảm ứng của Klf4 trong keratinocytes là cơ sở ngăn chặn sự chuyển đổi giữa 2 quá trình phân chia và biệt hóa và bắt đầu chứng loạn sản tế bào biểu bì hình vảy

(Foster et al, 2005). Vì vậy, Klf4 được kết hợp với việc ức chế khối u và sự phát sinh ung thư Biểu hiện lạc vị trí của Klf4 ngăn cản sự tăng nhanh số lượng tế bào, nhưng nếu chỉ cắt bỏ một trong các gen đích của nó, p21, là đủ

để trung hòa hiệu ứng kìm hãm tế bào của Klf4 Trong tế bào đã loại bỏ p21, Klf4 tiến hành sự gia tăng tế bào bằng cách điều hòa p53

(Rowland et al 2005) Điều này có thể là một lý do giải thích cho chức năng kép của Klf4 trong các bệnh ung thư

Trang 12

Ngoài những biểu hiện của nó được biết đến ở đường tiêu hóa, tinh hoàn và da, người ta còn tìm thấy Klf4 biểu hiện cao trong

các tế bào ES chuột chưa biệt hóa (Tokuzawa et al 2004) Người

ta cũng đã thấy STAT3 bất hoạt trong tế bào ES chuột làm giảm một cách đột ngột sự biểu hiện của Klf4 và sự kìm hãm biểu hiện của Klf4 cho phép sự tự đổi mới không phụ thuộc vào LIF

(Tokuzawa et al 2004) Một kết quả nghiên cứu khác cũng cho

biết hiệu quả tích cực của Klf4 trong sự tự đổi mới của các tế bào

ES chuột (Li et al 2005), và Klf4 đã được biết đến như là một

yếu tố kết hợp với Oct3/4 và Sox2 để kích hoạt lõi promoter

Lefty1 (Nakatake et al 2.006).

Trang 13

2 Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.

2.1 Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 4 yếu tố

Để thử nghiệm các nhân tố kích hoạt khả năng tạo tế bào pluripotent, các nhà khoa học đã phát triển một hệ thống trong đó khả năng tạo tế bào pluripotent có thể được phát hiện bằng sự biểu hiện của gen chỉ thị

Fbx15 được biểu hiện một cách đặc biệt trong các tế bào ES và phôi sớm,

nhưng không cần cho sự tự đổi mới và phát triển của các tế bào ES

(Tokuzawa et al 2003). Họ đã chèn β-geo (một sự kết hợp của gen kháng

β-galactosidase và neomycin) vào locus Fbx15 ở chuột bằng cách tái kết

hợp tương đồng Các tế bào ES từ hợp tử tương đồng có β-geo (Fbx15 βgeo/ βgeo ) đã được đề kháng với một nồng độ cực cao của G418 (lên đến 12 ml

mg -1 ), trái lại các tế bào soma của chuột có nguồn gốc từ Fbx15 βgeo/βgeo đã nhạy cảm với sự lựa chọn này Do đó, nó vẫn có thể xảy ra ngay cả với

sự cảm ứng cục bộ của khả năng tạo tế bào pluripotent cũng làm cho các

tế bào soma kháng G418 ở nồng độ bình thường (0,3 mg ml -1 )

Trang 14

Họ đã đưa thêm yếu tố MEFs vào gen Fbx15βgeo/βgeo bằng vector retrovirus và nuôi cấy chúng trong tế bào ES với môi trường có chứa G418 Với bất cứ yếu tố đơn lẻ nào, cũng không thu được khuẩn lạc kháng G418 Tuy nhiên, bằng cách kết hợp bốn yếu tố (Oct3/4, Sox2, c-Myc và Klf4), họ đã thu được nhiều khuẩn lạc kháng G418 Các tế bào này giống như các tế bào ES cả về hình thái và khả năng phân chia Hơn nữa, khi cấy vào tế bào trần của chuột, các tế bào gốc pluripotent (iPS) được tạo ra có chứa mô sẹo của tất cả ba lá mầm Do đó, các tế bào pluripotent có thể được tạo

ra từ nguyên bào sợi chỉ bằng việc sử dụng một vài yếu tố xác định (Takahashi & Yamanaka 2006)

Trang 15

Các tế bào iPS với lựa chọn Fbx15 không góp phần tạo ra dòng mầm hoặc trưởng thành, cho thấy sự tái lập trình của chúng chỉ xảy

ra cục bộ Gần đây, Các nhóm nghiên cứu báo cáo rằng đã cải thiện đáng kể chất lượng của các tế bào iPS (Maherali et al 2007; Okita et al 2007; Wernig et al 2007) Cả ba nhóm nghiên cứu đều

sử dụng bốn yếu tố như nhau, nhưng Nanog được sử dụng như là một yếu tố chỉ thị Các tế bào iPS với lựa chọn Nanog cho thấy nhiều mẫu gen đã biểu hiện tương tự như trong các tế bào ES hơn khi lựa chọn Fbx15 Các tế bào iPS được cải thiện này cũng đã góp phần tạo ra dòng mầm và trưởng thành Những dữ liệu này cho thấy nếu kết hợp chính xác bốn yếu tố thì có thể tạo ra các tế bào pluripotent không hề khác biệt so với các tế bào ES

Trang 16

Sử dụng bốn yếu tố nào để tạo ra tế bào pluripotent vẫn là một câu hỏi khó trả lời Trong mô hình của Yamanaka và cộng sự thì c-Myc đóng vai trò rất quan trọng Như là một gen giả ung thư mạnh, c-Myc góp phần vào sự gia tăng nhanh chóng của các tế bào iPS Ngoài ra, bằng cách gắn vào nhiều vị trí của bộ gen và bổ sung các phức hợp histon acetylase, c- Myc sẽ làm mở các nhiễm sắc thể (Adhikary & Eilers 2005) Tuy nhiên, biểu hiện của một mình c-Myc trong nguyên bào sợi sẽ khiến apoptosis hoặc thoái hóa phụ thuộc vào p53 Nhóm nghiên cứu đã chủ trương dùng Klf4 để vô hiệu hóa hiệu ứng bất lợi của c-Myc bằng cách trấn áp p53 Sau đó Oct-3/4 và Sox2 được gắn đến các vị trí mục tiêu của chúng và nhằm tạo tế bào pluripotent bằng cách tăng cường gen stemness và gen trấn áp sự biệt hóa Gần đây Niwa và cộng sự cho thấy Klf4 cũng có chức

năng như một đồng nhân tố của Oct-3/4 and Sox2 (Nakatake et al 2006).

Trang 17

Tuy nhiên, hiện nay chúng ta vẫn không biết liệu bốn yếu tố này có thể tạo ra các tế bào iPS từ các tế bào soma của người hay không

Có thể bổ sung các yếu tố để tạo ra các tế bào iPS của người, nhưng cần thêm nhiều nghiên cứu để xác định có hay không trường hợp này Ngoài ra, việc sử dụng các vectơ retrovirus và các gen giả ung thư c-Myc đặt ra mối quan tâm về sự an toàn phải được giải quyết trước khi áp dụng đối với các tế bào iPS của người trong y học tái tạo Trong thực tế, chúng tôi thấy rằng khoảng 20% các con chuột bắt nguồn từ việc lựa chọn Nanog có các tế bào iPS phát

triển khối u (Okita et al 2007) Vì thế, cần loại bỏ các c-Myc của

retrovirus trước khi ứng dụng lâm sàng

Trang 18

Tái lập trình các tế bào soma của chuột và người thành tế bào pluripotent, đã có thể thành công với bốn yếu tố là: Oct4, Sox2, c-Myc và Klf4 Xem xét sự có mặt không đúng chỗ của c-Myc là nguyên nhân gây ra khối u ở thế hệ con cháu thứ 2

và bản thân các retrovirus có thể xen vào các gen gây đột biến, các thế hệ của tế bào iPS được tạo ra với một số lượng tối thiểu của các yếu tố có thể đẩy nhanh các ứng dụng lâm sàng của phương pháp này Người ta đã nhận thấy rằng tế bào gốc thần kinh trưởng thành ở chuột thể hiện mức Sox2 và c-Myc nội sinh cao hơn tế bào gốc phôi, và Oct4 ngoại sinh cùng với Klf4 hoặc c-Myc là đủ để tạo

ra các tế bào iPS từ tế bào gốc thần kinh Những tế bào iPS được tạo ra từ hai yếu tố tương tự như tế bào gốc phôi ở mức độ phân tử, đã góp phần vào việc phát triển của dòng mầm, và các mẫu biến dị Cá nhà khoa học đề xuất rằng, trong việc tạo ra tế bào iPS, số yếu tố tái lập trình có thể được giảm xuống khi sử dụng các tế bào soma với mức độ biểu hiện nội sinh của các yếu tố được bổ sung phù hợp.

Trang 19

Các tế bào soma của chuột và người có thể được lập trình lại thành tế bào iPS thông qua sự biểu hiện của một tập hợp các yếu tố xác định (Oct4, Sox2, c-Myc và Klf4, cũng như Nanog và LIN28 của người) Có thể tạo ra các tế bào iPS từ nguyên bào sợi của chuột và người khi không có c-Myc của retrovirus, và do đó có ý kiến cho rằng biểu hiện nội sinh của c-Myc có thể

có một vai trò trong quá trình tái lập trình Tế bào gốc thần kinh (NSC) biểu hiện Sox2 nội sinh, có thể có chức năng trong việc duy trì tính đa năng của NSCs, và Sox2 đã được đề xuất trong việc duy trì tế bào pluripotent bằng cách điều hòa sự biểu hiện của Oct4 NSCs đã được tạo ra từ việc chuyển gen Oct4-GFP (OG2)/ROSA26 của heterozygous ở não chuột trưởng thành, protein huỳnh quang màu xanh lá cây (GFP) được biểu hiện dưới sự kiểm soát của promoter Oct4 (Oct4-GFP) và chuyển gen lacZ của Escherichia coli

từ locus ROSA26 (ROSA26 lacZ) Các NSCs được tạo ra có khả năng tự đổi mới và có tính đa năng.

Định dạng
Số trang	38
Dung lượng	1,96 MB