CNSHDV: Tương tác protein

Chúng tham gia cấu trúc của tế bào, là những enzym xúc tác cho các quá trình sinh lí sinh hóa xảy ra trong tế bào, protein còn tham gia các quá trình vận chuyển, bảo vệ, điều khiển, là n

CEMINAR CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT

TƯƠNG TÁC PROTEIN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

ỨNG DỤNG

Protein 1 Protein 2

Thực hiện: HOÀNG HỮU TÌNH

Lớp: ĐỘNG VẬT K17

MỞ ĐẦU

• Protein là một hợp chất đại phân tử được tạo thành

từ rất nhiều các đơn phân là các axit amin

• Trong tế bào động vật, protein có vai trò hết sức quan trọng Chúng tham gia cấu trúc của tế bào, là những enzym xúc tác cho các quá trình sinh lí sinh hóa xảy ra trong tế bào, protein còn tham gia các quá trình vận chuyển, bảo vệ, điều khiển, là nơi dự trữ chất dinh dưỡng, nhận biết các lọai phân tử khác nhau, chịu trách nhiệm về sự vận động của động vật ở mức tế bào và cơ thể Các chức năng này có thể do một hoặc nhiều phân tử protein đặc hiệu đảm nhiệm Sự tương tác giữa các protein chính vì thế rất quan trọng đối với các hoạt động sống của tế bào.

“Tương tác protein, phương pháp

nghiên cứu và ứng dụng”.

• Tương tác protein có thể diễn ra giữa các protein với nhau hoặc cũng có thể giữa phức hợp protein với các chất khác trong tế bào Sự tương tác này tác động đến các hoạt động của tế bào dẫn đến những biểu hiện ra bên ngoài của cơ thể sống.

• Nghiên cứu tương tác protein có ý nghĩa quan trọng nhằm xác định chức năng và sự tham gia của chúng vào một hay nhiều hoạt động sống cụ thể như quá trình phân chia tế bào, sao chép DNA, tổng hợp protein hay vận chuyển tín hiệu

NỘI DUNG

thấy các protein thể hiện chức

năng khi tương tác với nhau

• Mạng PPIs thường được biểu

diễn bằng một đồ thị mà mỗi

cạnh là một protein và mỗi

đỉnh là một tương tác

Hình 2 Một mạng tương tác

protein-protein

• Ngày nay, dữ liệu về protein và tương tác giữa chúng của các cơ thể sống rất nhiều, và được

bổ sung thường xuyên bởi các phòng thí nghiệm trên toàn thế giới

protein và hơn 12.000 tương tác [Natasa Przulj 2003] Nhưng lượng dữ liệu này vẫn được bổ sung hàng ngày

cơ thể sống khác nhau đang được nhiều nhà khoa học quan tâm, vì khi so sánh các mạng tương tác này có thể tìm ra được những đặc điểm chung giữa các loài hoặc tìm ra được vai trò của các protein trong một cơ thể sống

II Phương nghiên cứu tương tác protein

Phương pháp:

• Protein nghiên cứu được cố

định trên một chất mang (ví

dụ: Agarose, Sephadex)

• Sau đó mẫu chứa protein

tương tác được cho đi qua

cột và chúng bị giữ lại

• Các protein bám này được

tách ra khỏi cột bằng các

dung dịch thích hợp như:

SDS, muối NaCl, dung môi

hữu cơ

• Người ta đã sử dụng phương

pháp này để tách các protein

tương tác với RNAaza từ 25

năm trước đây.

2.1 Sắc kí ái lực (Affinity chromatography)

protein ligand

Hình 3 Phương pháp sắc kí ái lực

2.2 Kết tủa miễn dịch (Immunopricipitate)

• Phương pháp kết tủa miễn dịch dựa vào phản ứng kháng nguyên với kháng thể

(Sepharose) gắn với protein A tương tác với kháng thể để kết tủa phức hệ kháng nguyên - kháng thể đồng thời kéo theo các protein khác tương tác với protein nghiên cứu

• Các protein kết tủa cũng sẽ được tách ra

để nghiên cứu.

2.3 Tạo liên kết chéo (Cross-linking)

• Với phương pháp này thì liên kết chéo giữa các protein tương tác với nhau nhờ một tác nhân (ví dụ gluceraldehite) Sau

đó phức hệ được tách ra và dùng điện di hai chiều phân tích để phát hiện khả năng hai protein có tương tác với nhau hay không.

2.4 Sử dụng kỹ thuật di truyền (Using

genetic engineering): hệ thống lai kép

(Two hybride system).

• Năm 1989, Stan Field lần đầu tiên giới thiệu phương pháp sử dụng kỹ thuật di truyền để nghiên cứu tương tác protein có tên là hệ thống lai kép (Two hybride system)

• Phương pháp này có nhiều ưu việt hơn hắn các phương pháp khác Đặc biệt là độ chính xác và

độ nhạy cao mà không phương pháp nào có thể đạt được.

2.4 Sử dụng kỹ thuật di truyền

Nguyên lý của phương pháp :

• Việc hoạt động của promotor cho gen “báo cáo” (reporter genes) phụ thuộc vào hai nhân tố phiên mã:

- Nhân tố hoạt hoá promotor AD (Activation Domain)

- Nhân tố bám vào sợi ADN để cho ARN polymeraza bắt đầu quá trình phiên mã BD (DNA Binding Domain)

• Như vậy khi có mặt cả hai nhân tố AD và BD thì quá trình phiên mã và dịch mã của gen ‘báo cáo” xảy ra, còn khi chỉ có một trong hai nhân tố trên thì sản phẩm của gen ‘báo cáo” không được tổng hợp

2.4 Sử dụng kỹ thuật di truyền

Phương pháp:

• Người ta tách gen mã hoá cho hai nhân tố và gắn vào hai vectơ tách dòng riêng rẽ Muốn nghiên cứu tương tác protein X và Y người ta tiến hành tách dòng gen mã hoá cho hai protein này và lần lượt gắn vào hai vectơ AD và BD Sau đó hai vectơ cùng được biến nạp vào dòng tế bào biểu hiện gen

• Kết quả là tạo ra các protein lai ( fussion protein) AD-X và BD-Y Nếu hai protein X và Y có tương tác với nhau thì cả AD và BD cùng hoạt hoá promotor

và sản phẩm của gen “báo cáo” được phát hiện Ngược lại, nếu hai protein X và Y không tương tác với nhau thì tác động của chúng đối với promotor

là riêng rẽ do đó không có sản phẩm của gen “báo cáo”.

• Phương pháp lai kép được ứng dụng rộng rãi

để nghiên cứu tương tác protein trong một số trường hợp sau:

- Nghiên cứu tương tác hai protein.

- Nghiên cứu tương tác giữa các đoạn peptit chức năng (domain) khác nhau của một protein với các protein khác.

- Nghiên cứu sàng lọc (screening) từ thư viện gen để tìm kiếm các protein tương tác với một protein đã biết.

III Ứng dụng kỹ thuật hệ thống lai kép với tế bào chủ là nấm men để nghiên cứu các protein tương tác với photphataza (TTP30)

3.1 Vật liệu và dòng tế bào dùng cho nghiên cứu

Viện CNSH thực vật, ĐHTH Munich Đức.

Plasmit pGAD424 mang Gal4-AD và Leu.

Leu., Trp., và His., thư viện gen (cDNA library) của Arabidopsis đã được gắn vào plapsmit pGAD424 mang gen Leu (Công ty clontech, USA) cung cấp.

Hoá chất dùng cho nghiên cứu

+ Sử dụng các cặp mồi dùng để tách dòng gen TTP30 và gắn vào vectơ pGBT9 như sau: F1, R1; F2; R2 và F3.

+ Các hoá chất khác dùng cho nghiên cứu đạt độ tinh khiết cho sinh học phân tử từ các nhà sản xuất Meck, Sigma.

+ Điều kiện phản ứng PCR: Hỗn dịch phản ứng 25

microlit: dNTP: 0,25 microMol., đệm tris: pH:8.0 10

mM, MgCl2:1mM, DNA mồi (primer) 50ng, DNA khuôn (template) 10-20ng), 94 o C: 45s, 55 o C: 45s,72 o C : 45s

Số chu kỳ lặp lại: 35.

III Ứng dụng kỹ thuật hệ thống lai kép với tế bào chủ là nấm men để nghiên cứu các protein tương tác với photphataza (TTP30)

• Kỹ thuật:

sạch DNA, cắt với enzim giới hạn, gắn vào vectơ và biến nạp E.coli theo các phương pháp

mô tả của Maniats.

Lithium acetat.

trên môi trường chọn lọc và sản phẩm của gen chỉ thị theo chỉ dẫn của Clontech

III Ứng dụng kỹ thuật hệ thống lai kép với tế bào chủ là nấm men để nghiên cứu các protein tương tác với photphataza (TTP30)

Các bước thực hiện và kết quả

- Thu nhận dòng gen mã hoá cho TTP30 bằng kỹ thuật PCR

Gen TTP30 đã được nghiên cứu tại Viện CNSH thực vật, ĐHTH Munich Kết quả nghiên cứu cho thấy sản phẩm của gen là protein có hai nhóm chức năng phân biệt là vị trí bám vào photphat: PB(435 bps) và vị trí có độ lặp lại cao của 4 axit amin TPR (550bps) Với mục đích tìm hiểu các protein tương tác với gen TTP30 cũng như với từng đoạn peptit PB và TPR người ta đã dùng phản ứng PCR để thu được các đoạn gen mong muốn.

III Ứng dụng kỹ thuật hệ thống lai kép với tế bào chủ là nấm men để nghiên cứu các protein tương tác với photphataza (TTP30)

• Khi dùng cặp mồi F1 và R1, nhận được gen đầy đủ chứa cả hai vị trí PB và TPR (1050 bps) và khi dùng các cặp mồi F2, R2 và F3, R1 sẽ thu được các phần gen riêng biệt cho PB và TPR Kết quả điện di sản phẩm PCR được trình bày ở hình3.

Hình 3: Sản phẩm PCR của gen TTP30 và các đoạn PB,TPR

Gắn sản phẩm PCR vào vectơ pGBT9 và biến nạp vào dòng tế bào nấm men HF7C.

Các đoạn mồi đều mang vị trí cắt

của enzim giới hạn SmaI Người ta đã

tiến hành cắt riêng rẽ các sản phẩm

PCR và vectơ pGBT9 với SmaI Sản

phẩm PCR và vectơ tinh sạch lại được

gắn với nhau nhờ ligaza (MPI) và

được biến nạp vào E.coli (DH5anpha)

Sau đó nuôi cấy E.coli chứa plasmit

pGBT9 mang các đoạn gen nghiên

cứu , tiến hành tách plasmit và biến

nạp vào dòng tế bào nấm men HF7C

Trên môi trường chọn lọc khuyết

dưỡng triptophan người ta thu được

dòng tế bào biến nạp Sử dụng kỹ

thuật PCR để kiểm tra các đọan gen

đã được gắn vào vectơ pGBT9, kết

quả kiểm tra được trình bày ở hình 4.

Hình 4: Kết quả kiểm tra bằng PCR các đoạn gen sau khi gắn vào vectơ pGTB9 và biến nạp vào HF7C

• Người ta đã tiến hành tách plasmit pGAD424 mang cDNA biến nạp vào tế bào nấm men HF7C

đã chứa plasmit pGBT9 mang các đoạn gen tương ứng TTP30, PB, TPR ở trên Các thể biến nạp được phát hiện trên các môi trường chọn lọc: MT1 không chứa Leu và Trip (phát hiện hiệu quả và tần số biến nạp), môi trường MT2 không chứa Leu, Trip và His (phát hiện dòng gen mã hoá cho protein tương tác với TTP30) theo sơ đồ 1.

Tuyển chọn dòng gen mã hoá cho protein tương tác với TTP30

Sơ đồ 1: Biến nạp plasmit pGAD424 gắn với cDNA vào dòng

nấm men HF7C mang pGBT9 có chứa TTP30, PB, TPR.

• Kết quả thí nghiệm cho thấy các dòng tế bào đều cho tần số biến nạp cao khi phát hiện trên môi trương MT1 Trên môi trường MT2 chỉ nhận được 5 khuẩn lạc với dòng tế bầo mang gen TTP30 trong khi đó không nhận được thể biến nạp nào với 2 dòng tế bào còn lại (PB và TPR) Để khẳng định các thể biến nạp thu được

betagalactosidaza và chỉ có hai thể biến nạp có hoạt tính Đồng thời đã dùng phản ứng PCR để phát hiện đoạn gen cDNA khi dùng primer của plasmit pGAD424 kết quả được trình bày ở hình 5.

Hình 5: Kết quả xác định hoạt độ betagalactosidaza và phản ứng

PCR của hai thể biến nạp thu được

IV Ứng dụng

4.1 Phương pháp mới dự đoán ung thư vú

• Ung thư vú là một trong những dạng ung thư gây chết người, với khoảng 465.000 người tử vong mỗi năm.

• Việc đánh giá các protein khác nhau phản ứng trong các khối u có thể giúp dự đoán cơ hội cứu sống bệnh nhân bị ung thư vú và giúp các bác sĩ điều trị cho các bệnh nhân này tốt hơn

• Các nhà nghiên cứu đã phân tích mạng lưới hoạt động của các protein – các hợp chất hóa học cần thiết cho các quy trình tế bào – trong các mô ung thư vú của

khoảng 350 phụ nữ ở Mỹ và Châu Âu Họ thấy rằng

những phụ nữ được cứu sống có một tổ chức hệ thống protein trong các tế bào ung thư khác với những

người tử vong.

• Các nhà nghiên cứu cho biết việc theo dõi các hoạt động tương tác của các protein này giúp họ dự đoán rõ ràng hơn liệu các bệnh nhân có thoát khỏi bệnh ung thư vú hay không Jeff Wrana, người đứng đầu nghiên cứu này cho biết: “Chúng tôi nghiên cứu bệnh ung thư này bằng cách tìm hiểu các protein tương tác với nhau như thế nào Điều này giúp chúng tôi trực tiếp đưa ra các liệu pháp phù hợp

• Các nhà nghiên cứu quan sát tương tác của 30.000 protein, sau đó xác định một nhóm chính khoảng 250 protein quan trọng nhất liên quan tới việc dự đoán khả năng sống của bệnh nhân Nhiều protein trong số này điều tiết hoạt động của các protein khác Nếu một bệnh nhân được chẩn đoán

có các tương tác protein mang lại kết quả xấu, bác sĩ có thể tiến hành ngay liệu pháp điều trị tích cực với họ thông qua phẫu thuật, hóa trị và điều trị phóng xạ.

4.2 Bài toán dự đoán chức năng của protein dựa vào tương tác protein-protein

• Xác định chức năng của protein là một trong những vấn đề cơ bản của sinh học Có nhiều cách khác để xác định chức năng của protein chưa biết chức năng chúng ta tìm hiểu và đưa ra bài toán dự đoán chức năng của protein bằng cách phân cụm các protein dựa trên mạng tương tác của chúng.

• Phân cụm (clustering) dữ liệu là một kỹ thuật quan trọng trong phân tích dữ liệu và được áp dụng trong nhiều ngành khoa học khác nhau như: sinh học, tâm

lý học, y học…[Jiawei Han 2001].Phân cụm là chia dữ liệu thành các nhóm (groups) mà các đối tượng (objects) trong cùng một nhóm thì giống nhau (similary) theo một nghĩa nào đó và khác (dissimilary) với các đối tượng trong các nhóm khác Mỗi nhóm được gọi là một cluster Mỗi đối tượng được

mô tả bởi một tập các độ đo (measurement) hoặc bằng mối quan hệ với các đối tượng khác Cũng có rất nhiều định nghĩa về cluster, nhưng các định nghĩa sau đây được coi là điển hình [Anil K.Jain 1988]:

Hình 6 Các cụm dữ

liệu

4.3 Nghiên cứu virus khảm cây đậu đũa (cowpea mosaic

virus hay CMPV) tương tác với protein vimentin ở các tế bào mở ra khả năng dùng CMPV trong trị bệnh cho các động vật

có vú

• Mới đây, phó giáo sư Marianne Manchester và cộng sự

đã khám phá ra một loại virus khảm cây đậu đũa (cowpea mosaic virus hay CMPV) có khả năng bám vào một loại protein đặc trưng ở các tế bào động vật có vú Phát hiện này mở ra khả năng dùng CMPV trong trị bệnh.

• Manchester và nhóm của mình đã chứng minh CPMV tương tác với protein vimentin ở các tế bào (động vật) hữu nhũ Các tác giả đã nảy ra ý tưởng dùng virus này

để “mang” thuốc đến các khối u hoặc mô bệnh Nghiên cứu sinh hậu tiến sĩ Kris Koudelka cho biết cô phải thực hiện nhiều chuỗi thí nghệm đế thuyết phục chính bản thân mình và đồng nghiệp tin vào phát hiện mới Vimentin là một phần của khung xương tế bào (cytoskeleton) vốn tạo nên hình dạng tế bào Trong khi phần lớn vimentin nằm bên trong tế bào, một đoạn nhỏ của nó lồi ra trên bề mặt tế bào Chính cấu trúc vimentin

bề mặt này sẽ là đích đến của virus khảm đậu đũa.

• Tác nhân phân phối thuốc lý tưởng

Cấu trúc của CPMV, được khám phá bởi giáo sư John “Jack” Johnson tại Viện nghiên cứu Scripps, cho thấy virus là tác nhân phân phối thuốc lý tưởng CPMV có 300 vùng khác biệt trên bề mặt để đính các phân tử thuốc Ngoài ra, loại virus chỉ gây hại cho thực vật này chỉ có kích thước 30 nano-mét, cho phép nó di chuyển khắp nơi trong cơ thể.

Trên tạp chí khoa học Nature Medicine (2006), Manchester và cộng sự đã tiến hành đánh dấu huỳnh quang cho virus và tiêm chúng vào phôi gà

và phôi chuột Thí nghiệm nhằm tìm hiểu đích đến của virus trong cơ thể Kết quả: virus làm mạch máu sáng lên (do huỳnh quang) bằng cách bám vào các

tế bào nội mô bên trong thành mạch Tuy nhiên, Manchester và nhóm nghiên cứu muốn hiểu rõ hơn

về sự tương tác giữa virus với tế bào Câu hỏi đầu tiên được đặt ra là “virus bám vào loại protein nào của tế bào?”.