Kĩ thuật di truyền pdf

Các phân tử enzim này nhận ra và cắt đứt ADN ở những nuclêôtit xác định nhờ đó người ta có thể tách các gen mã hoá những prôtêin nhất định.. Việc cắt đứt ADN vòng của plasmit cũng được

KI THUẬT DI TRUYỀN

I/ Khái niệm kĩ thuật di

truyền

1.Định nghĩa

Kĩ thuật di truyền là kĩ thuật

thao tác trên vật liệu di

truyền dựa vào những

hiểu biết về cấu trúc hoá

học của các axit nuclêic và

di truyền vi sinh vật.

II/ KỸ THUẬT CẤY GEN

th th c khu n ể ư ẩ

5

Plasmit là gì ?

- Plasmit : Plasmit là những cấu trúc nằm trong

tế bào chất của vi khuẩn Tuỳ loài vi khuẩn, mỗi tế bào chứa từ vài plasmit đến vài chục plasmit

- Plasmit chứa ADN dạng vòng, gồm khoảng từ

8.000 – 200.000 cặp nuclêôtit ADN của plasmit tự nhân đôi độc lập với ADN nhiễm sắc thể.

3 Các khâu chủ yếu của kỹ thuật cấy gen :

Kĩ thuật cấy gen có 3 khâu chủ yếu:

+ Tách ADN nhiễm sắc thể của tế bào cho và tách plasmit ra

khỏi tế bào.

+ Cắt và nối ADN của tế bào cho vào ADN plasmit ở những

điểm xác định, tạo nên ADN tái tổ hợp.

- Thao tác cắt tách đoạn ADN được thực hiện nhờ enzim cắt (restrictaza) Các phân tử

enzim này nhận ra và cắt đứt ADN ở những

nuclêôtit xác định nhờ đó người ta có thể tách các gen mã hoá những prôtêin nhất định Việc cắt đứt ADN vòng của plasmit cũng được thực hiện do enzim cắt còn việc ghép đoạn ADN

của tế bào cho vào ADN plasmit thì do enzim nối (ligaza) đảm nhiệm.

+ Chuyển ADN tái tổ hợp vào tế bào nhận, tạo điều

kiện cho gen đã ghép được biểu hiện.

Plasmit mang ADN tái tổ hợp được chuyển vào tế bào nhận bằng nhiều phương pháp khác nhau.

Vào tế bào nhận, nó tự nhân đôi, được truyền qua các thế hệ tế bào sau qua cơ chế phân bào và tổng hợp loại prôtêin đã mã hoá trong đoạn ADN được ghép.

- Tế bào nhận được dùng phổ biến là vi khuẩn đường ruột E.Coli

Tế bào E.Coli sau 30 phút lại tự nhân đôi Sau 12 giờ, 1 tế bào ban đầu sẽ sinh ra 16 triệu tế bào, qua đó các plasmit trong chúng cũng được nhân lên rất nhanh và sản xuất ra một lượng lớn các chất tương ứng với các gen đã ghép vào plasmit.

 Tế bào nhận được dùng phổ biến là vi khuẩn đường ruột

E.Coli Tế bào E.Coli sau 30 phút lại tự nhân đôi Sau 12 giờ,

1 tế bào ban đầu sẽ sinh ra 16 triệu tế bào, qua đó các plasmit trong chúng cũng được nhân lên rất nhanh và sản xuất ra một lượng lớn các chất tương ứng với các gen đã ghép vào

plasmit.

 Trong kĩ thuật cấy gen người ta còn dùng thể thực khuẩn làm thể truyền Nó gắn đoạn ADN của tế bào cho vào ADN của nó

và trong khi xâm nhập vào tế bào nhận nó sẽ đem theo cả

đoạn ADN này vào đó.

KỸ THUẬT CẤY GEN

Enzim cắt Enzim cắt

Gắn đoạn bị cắt vào plasmit nhờ enzim nối

– Tách ADN nhiễm sắc thể của tế bào cho,tách

plasmit ra khỏi tế bào

– C t và n i ADN của tế bào cho và ADN plasmit C t và n i ADN của tế bào cho và ADN plasmit ắ ắ ố ố

ở những điểm xác định,tạo ADN tái tổ hợp.

* Cắt: Enzim cắt (restrictaza)

* Nối: Enzim nối (ligaza)

– Chuy n ADN tái t h p vào t bào nh n, tạo Chuy n ADN tái t h p vào t bào nh n, tạo ể ể ổ ợ ổ ợ ế ế ậ ậ

điều kiện cho gen đã ghép được biểu hiện

SƠ ĐỒ

ADN thể thực khuẩn đứt ADN tế bào cho

Enzim nối

Enzim cắt Enzim cắt

III/ PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

1 Nguyên tắc của phương pháp PCR:

ADN polymerase thực hiện tổng hợp mạch mới từ AND mạch khuôn

cần sự hiện diện của mồi chuyên biệt

Mồi: đoạn AND ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của

mạch khuôn

Nhiệt độ nóng chảy của mồi: Tm (ở nhiệt độ này, 50 % ADN mạch đôi

bị tách mạch thành mạch đơn) T m = 4(G + C) + 2(A + T) °C

Nếu cung cấp 2 mồi chuyên biệt (mồi xuôi và mồi ngược) bắt cặp bổ

sung với 2 đầu của một trình tự ADN, ADN polymerase sẽ xúc tác tổng hợp đoạn ADN nằm giữa 2 mồi

Các bước của phản ứng:

Là một chuỗi nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 bước:

Bước 1: Biến tính (denaturation)

ADN được biến tính ở nhiệt độ cao, thường là 94 – 950C, trong thời gian 30s – 1 phút

Bước 2: Bắt cặp mồi (hybridization)

Nhiệt độ cần cho sự bắt cặp mồi với ADN mạch khuôn là T a

(Ta thấp hơn Tm khoảng 50C)

Bước 3: Kéo dài (elongation)

Nhiệt độ được tăng lên đến 720C, để ADN polymerase hoạt động kéo dài mạch

- PCR có thể thực hiện trên các mẫu không được bảo quản tốt.

 Enzyme :

- Enzyme polymerase đầu tiên chịu nhiệt được tách chiết từ

Thermus aquaticus là Taq polymerase.

- Enzyme Pfu ADN polymerase thu nhận từ vi khuẩn Pyroccus furiosus có khả năng chịu nhiệt cao hơn, có hoạt tính 3’-5’ exonuclease.

- Tth polymerase, tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng phiên mã ngược khi có RNA và Mn2+, khi có ADN và Mg2+ thì enzyme này thực hiện khuếch đại ADN.

 Mồi và nhiệt độ lai T a

- Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất, quyết định tính đặc hiệu của phản ứng.

- Khi thiết kế mồi cần chú ý: thành phần GC, khả năng bắt cặp bổ sung giữa “mồi xuôi” và “mồi ngược”, khả năng tạo cấu trúc “kẹp tóc”.

- Tm của 2 mồi không cách biệt quá xa.

- Mồi đặc trưng cho trình tự ADN cần khuếch đại và không bắt cặp với trình tự khác trên gen.

 Các thành phần khác của phản ứng:

- dNTP: thường sử dụng ở nồng độ là 20 -200 µM đối với mỗi loại.

4 Ứng dụng của phương pháp PCR

- Tạo số lượng lớn bản sao ADN  dòng hóa gene, giải trình tự, lập bản đồ di truyền, sản xuất mẫu dò…

- Biến đổi một trình tự ADN: thêm vị trí của enzyme cắt hạn chế,

gây tạo đột biến trên ADN, thêm trình tự promoter, trình tự gắn

- Nhân bản không đặc hiệu:

- Các sai sót do Taq polymerase

5 Các dạng khác của PCR:

- RT –PCR (reverse transcriptase –PCR): RNA  cADN  ADN

- RT – PCR (Realtime PCR – PCR định lượng): xác định hàm lượng sản phẩm PCR tạo ra ở từng thời điểm

quang

25

IV/ ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT DI

TRUYỀN

Công nghệ sinh học (Biotechnology) sử dụng các

tế bào sống để tạo ra các nguyên liệu hữu dụng cho con người:

–Nấm nen được dùng sản xuất bia, rượu vang; vi

khuẩn được dùng sản xuất cheese, yogurt, v.v

–Các vi khuẩn được dùng sản xuất các chất kháng

–TPA là một enzyme xúc tác sự biến đổi

plasminogen trong máu thành plasmin Plasmin

là một protein có khả năng hòa tan cục máu (clot)

29

Hết bài