công nghệ sinh học - văc xin ăn được ppt

Hiệu quả của vắc-xin còn tùy thuộc vào thời gian bảo vệ: trí nhớ miễn dịch có thểtồn tại suốt đời nhưng sự sản xuất kháng thể thì không nếu không được tái kích thích.Đột biến

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

Tiêm chủng là một trong những trang bị tối cần thiết để một đứa trẻ lớn lên an toàn

và khoẻ mạnh, tuy nhiên bất kỳ một đứa trẻ nào, (và ngay những trẻ đã lớn) đều rất “sợ”chỉ cần nghĩ đến việc phải tiêm thuốc Vì đường tiêm thường gây cảm giác đau cho người

sử dụng, cộng thêm số lượng virút gây bệnh nguy hiểm ngày càng nhiều kéo theo sốlượng mũi tiêm cũng tăng lên và mỗi lần tiêm vào mỗi chỗ khác nhau của cơ thể Chưa

kể đến việc bảo quản, vận chuyển với điều kiện nghiêm ngặt đối với các Vắc-xin Giảiquyết hết tất cả những vấn đề này các nhà khoa học của chúng ta đã tạo ra một cái gọi là

“Vắc-xin ăn” Nó có thể dùng thay thế cho việc tiêm nhưng hiệu quả miễn dịch vẫn đượcđảm bảo

Ở nước ta, Vắc-xin ăn có lẻ là một cụm từ khá mới mẻ nhưng đối với các nước pháttriển trên thế giới thì nó không có gì xa lạ, bởi từ những năm đầu thập niên 90 người ta đãtạo thành công những “cây Vắc-xin ăn” đầu tiên

Tuy nhiên cho đến nay việc Nghiên cứu và phát triển Vắc-xin ăn vẫn còn đang làmột phương hướng nghiên cứu rất mới của công nghệ sinh học, đặc biệt là ở những nướcđang phát triển và những nước nghèo, nơi mà vấn đề miễn dịch thường là mối quan tâmlớn

Nghiên cứu và phát triển Vắc-xin ăn cần sự kết hợp đồng thời giữa lĩnh vực miễndịch học và thực vật học Do vậy việc nghiên cứu, phát triển và thử nghiệm Vắc-xin ănthông qua cây trồng chuyển gen vẫn còn nhiều hạn chế, tuy nhiên cũng đã thu đượcnhững nhiều thành tựu to lớn

Qua bài tiểu luận này tôi muốn cung cấp thêm một số thông tin cơ bản về lĩnh vựcmới này, nhằm giúp những người quan tâm có thể tham khảo thêm Chính vì vậy tôi chọn

đề tài “Công nghệ sản xuất Vắc-xin ăn được” nhằm đáp ứng những nhu cầu trên.

từ vaccinia, loại virus gây bệnh đậu bò nhưng khi đem chủng cho người lại giúp ngừađược bệnh đậu mùa (tiếng Latinh vacca nghĩa là "con bò cái") Việc dùng vắc-xin đểphòng bệnh gọi chung là chủng ngừa hay tiêm phòng hoặc tiêm chủng, mặc dù vắc-xinkhông những được cấy (chủng), tiêm mà còn có thể được đưa vào cơ thể qua đườngmiệng.

* Cơ chế hoạt động của vắc-xin

Hệ miễn dịch nhận diện vắc-xin là vật lạ nên hủy diệt chúng và "ghi nhớ" chúng Vềsau, khi tác nhân gây bệnh thực thụ xâm nhập cơ thể, hệ miễn dịch đã ở tư thế sẵn sàng

để tấn công tác nhân gây bệnh nhanh chóng hơn và hữu hiệu hơn (bằng cách huy độngnhiều thành phần của hệ miễn dịch, đặc biệt là đánh thức các tế bào lympho nhớ) Đâychính là các ưu điểm của đáp ứng miễn dịch đặc hiệu

* Các loại vắc-xin

Vắc-xin có thể là các virus hoặc vi khuẩn sống, giảm độc lực, khi đưa vào cơ thểkhông gây bệnh hoặc gây bệnh rất nhẹ Vắc-xin cũng có thể là các vi sinh vật bị bất hoạt,chết hoặc chỉ là những sản phẩm tinh chế từ vi sinh vật

* Ba loại vắc-xin kinh điển

Nuôi cấy virus cúm (chủng gây đại dịch năm 1918) phục vụ nghiên cứu và sản xuấtvắc-xin:

- Vắc-xin bất hoạt là các vi sinh vật độc hại bị giết bằng hóa chất hoặc bằng nhiệt.Thí dụ: các vắc-xin chống cúm, tả, dịch hạch và viêm gan siêu vi A Hầu hết các vắc-xinloại này chỉ gây đáp ứng miễn dịch không hoàn toàn và ngắn hạn, cần phải tiêm nhắcnhiều lần

- Vắc-xin sống, giảm độc lực là các vi sinh vật được nuôi cấy dưới những điều kiệnđặc biệt nhằm làm giảm đặc tính độc hại của chúng Vắc-xin điển hình loại này thườnggây được đáp ứng miễn dịch dài hạn và là loại vắc-xin được ưa chuộng dành cho người

lớn khỏe mạnh Các vắc-xin ngừa bệnh sốt vàng, sởi, bệnh ban đào và quai bị đều thuộcloại này.

Các "toxoid" là các hợp chất độc bị bất hoạt trích từ các vi sinh vật (trong trườnghợp chính các độc chất này là phương tiện gây bệnh của vi sinh vật) Thí dụ: các vắc-xinngừa uốn ván và bạch hầu

- Vắc-xin sống ngừa bệnh lao không phải là dòng vi khuẩn lao gây bệnh, mà là mộtdòng lân cận được gọi là BCG

* Một số loại vắc-xin mới đang nghiên cứu

Các vắc-xin này còn được xem là vắc-xin của tương lai, có 6 hướng phát triển chínhhiện nay:

- Sử dụng các phụ gia (adjuvant) mới, nhằm gây ra loại đáp ứng miễn dịch mongmuốn Thí dụ, chất nhôm phosphate và các oligonucleotide chứa CpG demethyl hóa đưavào vắc-xin khiến đáp ứng miễn dịch phát triển theo hướng dịch thể (tạo kháng thể) thay

- Anti-idiotype: idiotype là cấu trúc không gian của kháng thể tại vị trí gắn khángnguyên, đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng Anti-idiotype là các kháng thể đặc hiệuđối với idiotype, do đó anti-idiotype xét về mặt đặc hiệu lại tương tự với kháng nguyên.Vậy, thay vì dùng kháng nguyên X làm vắc-xin, người ta dùng idiotype anti-anti-X

- Vắc-xin ADN: ADN của tác nhân gây bệnh sẽ được biểu hiện bởi tế bào ngườiđược chủng ngừa Lợi thế của ADN là rẻ, bền, dễ sản xuất ra số lượng lớn nên thích hợpcho những chương trình tiêm chủng rộng rãi Ngoài ra, vắc-xin ADN còn giúp địnhhướng đáp ứng miễn dịch: tác nhân gây bệnh ngoại bào được trình diện qua MHC loại II,dẫn đến đáp ứng CD4 (dịch thể và tế bào) Khi kháng nguyên của tác nhân đó được chính

cơ thể người biểu hiện, nó sẽ được trình diện qua MHC loại I, lúc này đáp ứng miễn dịch

tế bào qua CD8 được kích thích Tuy nhiên phương pháp này là con dao hai lưỡi bởi lẽ tếbào mang ADN lạ có nguy cơ bị nhận diện là "không ta", sinh ra bệnh tự miễn

- Sử dụng véc-tơ tái tổ hợp – dùng các vi khuẩn thuần tính hoặc các tế bào trình diện

kháng nguyên như tế bào tua được chuyển gen để biểu hiện kháng nguyên mong muốn.

* Vắc-xin dùng để điều trị

Một trong những hướng nghiên cứu mới là miễn dịch liệu pháp, bao gồm miễn dịchliệu pháp thụ động và chủ động (tức vắc-xin liệu pháp) Người ta hy vọng là phươngpháp này sẽ chữa được những bệnh như ung thư, AIDS và bệnh Alzheimer

- Hiệu quả của vắc-xin cũng khó đánh giá chính xác Kết quả nghiên cứu trên độngvật không thể áp dụng 100% cho loài người, vì những đặc điểm riêng của từng loài Trên

lý thuyết, phương pháp duy nhất để chứng minh hiệu quả là lấy 2 nhóm người, một nhómđược tiêm chủng, một nhóm không rồi truyền mầm bệnh cho cả hai nhóm để xem kếtquả Dĩ nhiên phương pháp này không thể sử dụng được vì trái đạo đức Do đó, người tabiến hóa đi một chút, cũng chia ra 2 nhóm được chủng và không được chủng như trênnhưng không truyền bệnh mà chỉ quan sát sự nhiễm bệnh qua các ngã thông thường Hạnchế của phương pháp này là nếu một vắc-xin tỏ ra có hiệu quả, người ta không thể triểnkhai nghiên cứu trên quy mô rộng để tính chính xác hiệu quả vì như thế một số lớn quầnchúng sẽ bị thiệt thòi do không được bảo vệ

Bởi vậy, khi một vắc-xin được xem là có hiệu quả, người ta đem tiêm chủng chomọi người và quan sát sự giảm số người mắc bệnh Tuy nhiên, ngay cả khi một bệnh cóchiều hướng giảm xuống, người ta cũng không biết vai trò thật sự của vắc-xin, thí dụ tầnsuất bệnh lao đã giảm rất nhiều, nhưng vai trò của các biện pháp vệ sinh, cách ly nguồnlây cũng rất đáng kể (Để hiểu rõ hơn cách đánh giá hiệu quả, xem thêm bài khoa họcthống kê.)

Tính kém hiệu quả của vắc-xin có thể biểu hiện về mặt chất (đáp ứng miễndịch không thích hợp) hoặc về mặt lượng (không có đáp ứng miễn dịch)

* Nguyên nhân gây kém hiệu quả về lượng:

Các "lỗ hổng" trong kho tàng miễn dịch: trên lý thuyết, các tế bào lympho B có thểtạo ra hơn 1012 loại kháng thể đặc hiệu, còn lympho T có thể nhận diện trên 1015 khángnguyên khác nhau, những con số này tuy rất lớn nhưng không phải là vô hạn, hệ miễndịch không thể chống lại mọi thứ

Hiệu quả của vắc-xin còn tùy thuộc vào thời gian bảo vệ: trí nhớ miễn dịch có thểtồn tại suốt đời nhưng sự sản xuất kháng thể thì không nếu không được tái kích thích.Đột biến của tác nhân gây bệnh: đây là cơ chế sinh tồn của các tác nhân gây bệnh.Đột biến đẩy hệ miễn dịch vào một cuộc rượt đuổi trường kỳ Tiêu biểu cho cơ chế này

là HIV, virus sốt xuất huyết, virus cúm với nguy cơ đại dịch cúm gia cầm hiện nay

* Nguyên nhân gây kém hiệu quả về chất:

Vai trò của phụ gia: để giảm tác dụng không mong muốn của vắc-xin, người tathường tinh lọc các chế phẩm, nhưng có những vắc-xin quá tinh khiết lại trở nên kémhiệu quả Đó là do hệ miễn dịch muốn được kích hoạt, phải nhận được một tín hiệu báonguy, tín hiệu này thường không phải là kháng nguyên dùng làm vắc-xin Để khắc phục,người ta dùng một số loại phụ gia trong chế phẩm vắc-xin Thí dụ phụ gia Freund, nhômhyđrôxít, nhôm phosphate hoặc trộn lẫn các văc-xin với nhau

Loại phản ứng miễn dịch và hiện tượng chuyển hướng miễn dịch: đối với các tácnhân gây bệnh ngoại bào, đáp ứng miễn dịch dịch thể là thích hợp (loại đáp ứng này được

sự hỗ trợ của các tế bào lympho Th1) Ngược lại, đáp ứng miễn dịch tế bào (cần sự hỗ trợcủa lympho Th2) lại hữu hiệu cho các tác nhân gây bệnh nội bào Do đó, nếu vắc-xin gâyđược đáp ứng miễn dịch nhưng không đúng loại đáp ứng nên có, hiệu quả cũng khôngđược bảo đảm Th1 và Th2 có xu hướng khắc chế lẫn nhau Vắc-xin kinh điển có xuhướng tạo đáp ứng Th1 Do đó đối với những bệnh do tác nhân nội bào nhưnhiễm leishmania, miễn dịch đặc hiệu sau lành bệnh lại tốt hơn vắc-xin, vì vắc-xin lại gâyhiệu quả ngược, kiềm hãm phản ứng bảo vệ

* Tai biến khi dùng vắc-xin

Có hai loại tai biến: nhiễm bệnh và các bệnh miễn dịch

Nhiễm bệnh

Vắc-xin sống, giảm độc lực có thể gây bệnh cho người bị suy giảm miễn dịch

Nguy cơ hồi phục của tác nhân vi sinh: một tác nhân bị làm giảm độc lực tìm lạiđược độc tính của mình Nguy cơ này ở vắc-xin ngừa bại liệt là 10-7, nghĩa là cứ 10 triệu

trẻ em uống vắc-xin Sabin thì có 1 em bị tai nạn loại này Điều không may này khôngngăn cản được việc sử dụng vắc-xin này bởi lẽ tỷ lệ đó được xem là chấp nhận được.Nguy cơ nhiễm các tác nhân gây bệnh khác vào trong chế phẩm vắc-xin Điều nàycó thể hạn chế bằng các quy trình sản xuất, bảo quản và sử dụng chặt chẽ.

Bệnh miễn dịch

Thử nghiệm vắc-xin phòng bệnh dại trên cừu cho thấy có xác suất gây EAE, mộtbệnh tự miễn trên hệ thần kinh khoảng 1/3000-1/1000.Lý do có thể là vắc-xin chiết xuất

từ não chó đã mang theo cả những mẩu protein của tế bào thần kinh, khi tạo miễn dịch,

cơ thể (được tiêm)đã tạo ra cả kháng thể chống lại cấu trúc thần kinh của mình

Vắc-xin ngừa ho gà có thể gây sốc kèm di chứng thần kinh với xác suất 10-4-10-6.Việc tinh lọc vắc-xin này làm tăng mức an toàn nhưng một lần nữa, giảm hiệu quả

* Chủng ngừa

- Chủng ngừa là cho vắc-xin tiếp xúc với hệ miễn dịch Tùy bản chất ký sinh, bệnhsinh của tác nhân gây bệnh cũng như của chế phẩm vắc-xin mà người ta dùng cácphương pháp khác nhau nhằm đạt hiệu quả cao nhất

- Chủng là cách tạo một vết rạch trên da (cho rớm máu) rồi cho tiếp xúc với vắc-xin.Phương pháp này trước đây được dùng cho vắc-xin đậu mùa và lao

- Tiêm dưới da, trong da v.v là phương pháp phổ thông nhất hiện nay, kể cả vắc-xinBCG phòng lao Không được tiêm vào mạch máu

- Uống vắc-xin là phương pháp dùng cho vắc-xin Sabin ngừa bệnh bại liệt

* Đánh giá hiệu quả và theo dõi

Trong một số trường hợp, thí dụ sau khi tiêm vắc-xin ngừa viêm gan siêu vi B,người ta còn làm xét nghiệm huyết thanh tìm hiệu giá kháng thể qua đó đánh giá hiệu quảcủa vắc-xin trên cơ thể người được tiêm (có tạo được đáp ứng miễn dịch hữu hiệukhông)

* Triển khai

Tổ chức Sức khỏe Thế giới (WHO) đã hỗ trợ nhiều chương trình tiêm chủng mởrộng trên phạm vi toàn cầu trong kế hoạch chăm sóc sức khỏe ban đầu Trong khuôn khổcác chương trình này, người ta đã đề xuất các lịch tiêm chủng đối với một số bệnh truyềnnhiễm nguy hiểm thường gặp

Một trong những mục tiêu của y sinh học hiện nay là đẩy mạnh nghiên cứu nhằmtìm ra các vắc-xin mới, hiệu quả với giá thành phù hợp cho mục tiêu phổ cập cho mọi

người, nhất là đối với những bệnh gây chết người nhiều như sốt rét hay những bệnh nan ynhư ung thư, AIDS.

2 Vắc-xin ăn được

Vắc-xin ăn được còn là Vắc-xin tiểu phần bao gồm một hoặc nhiều chuổi polypeptitcủa protein kháng nguyên trong vi sinh vật gây bệnh Người ta chọn lọc những gen mãhoá cho các thành phần này, đưa vào vectơ, dựa vào hệ thống di truyền thực vật đểkhuyếch đại gen và biểu hiện thành công kháng nguyên protein mong muốn trong các bộphận ăn được của thực vật, loại văccine này được cơ thể chấp nhận và nó bền vững trongdịch tiêu hoá đi qua đường tiêu hoá mà không bị phân huỷ

xin ăn được có hoạt tính tương tự như xin thông thưòng, chỉ khác là xin này được thực vật sản xuất trong những phần ăn được như lá, củ, quả, hạt Nổ lực sảnxuất Vắc-xin đầu tiên từ thực vật được ghi nhận vào năm 1990 khi công trình nghiên cứu

Vắc-biểu hiện protein kháng nguyên bề mặt A của vi khuẩn Streptococus mutans ở cây thuốc

lá

II CƠ SỞ KHOA HỌC

Với các tiến bộ khoa học hiện nay trong việc tạo cây trồng chuyển gen cho phép tạocây trồng chuyển gen có chứa Vắc-xin ăn được với các bước:

- Chọn lựa và nhân bản đoạn gen kháng nguyên của vi khuẩn và vi rút gây bệnh

- Thử nghiệm thành công các vectơ biểu hiện gen tái tổ hợp

- Chuyển thành công gen kháng nguyên vào nhiều loài đối tượng thực vật

- Gia tăng tốc độ và khối lượng protein tái tổ hợp được được sản sinh trong câytrồng

Vắc-xin ăn được có những ưu điểm nổi trội:

- Dể dàng tăng qui mô sản xuất và dể thu sinh khối

- Tính ổn định cao,dễ bảo quản và sử dụng

Các kháng nguyên biểu hiện trong thực vật ổn định ngay ở nhiệt độ phòng do chúngđược sản xuất và được bao bọc bởi các mô thực vật mà cụ thể là chúng được định vịtrong lưới nội chất, thể Golgi hoặc bề mặt tế bào Nhờ tính ổn định này mà chúng trở nên

dể dàng bảo quản và sử dụng (ngay trong thực vật) mà không cần giữ lạnh như các xin tiêm Trong quá trình sản xuất Vắc-xin ăn được người ta chỉ cần vận chuyển và sửdụng ngay bộ phận thực vật chứa Vắc-xin đó:

Vắc- Tính ăn được:

Loại Vắc-xin trong thực vật này được chính mô trong thực vật bao bọc, hạn chếđược sự phân huỷ của dịch tiêu hoá ở đường ruột và ổn định, bền vững trong cơ thể nênVắc-xin này có thể ăn tươi (quả, lá) hoặc nấu chín (hạt, củ) Nhiều nghiên cứu cho thấynhiều kháng nguyên Vắc-xin được biểu hiện hiệu quả ở rau diếp cá (lá), khoai tây (củ), càchua (quả) và ngô (hạt)

 Tính An toàn:

Vì Vắc-xin được sản xuất trong thực vật là Vắc-xin dưới đơn vị sử dụng gen mã hoácho một phần protein vỏ virus mà không cần đến virus sống như Vắc-xin giảm độc lựchay virus chết như Vắc-xin bất hoạt Do đó Vắc-xin này không trở lại thành virus gâybệnh cho người và động vật, đồng thời nó cũng tránh được nguy cơ nhiễm mầm bệnhtiềm tàng từ Vắc-xin Do đó, không cần tách chiết và tinh sạch kháng nguyên Vắc-xin

 Vắc-xin ăn được kích thích sản xuất kháng thể của hệ thống miễn dịch hiệu quả hơn Vắc-xin tiêm

Ta biết rằng hầu hết các vi sinh vật gây bệnh đều xâm nhập vào cơ thể qua bề mặtnhầy trong đường tiêu hoá, hô hấp và đường tiết niệu Khi Vắc-xin ăn vào cơ thể theođường miệng nó sẽ cảm ứng hệ thống miển dịch thể dịch sản xuất các kháng thể chốnglại vi sinh vật gây bệnh, tiếp đó hệ thống thể dịch lại tác động vào hệ thống miển dịch của

tế bào, tạo ra các globulin miển dịch tăng cường khả năng bảo vệ sớm và hiệu quả cho cơthể Khi tiêu hoá Vắc-xin ăn được, kháng nguyên được giải phong trong ruột non

Những nghiên cứu bảo vệ kháng nguyên làm Vắc-xin ăn được trước tác động củadịch tiêu hoá, đặc biệt của cơ thể con người khẳng định giá trị thực tiễn của Vắc-xin ănđược sản xuất nhờ thực vật chuyển gen

Với những ưu điểm nỗi bật của Vắc-xin ăn thì việc sản xuất Vắc-xin ăn đuợc xem là

hệ thống sản xuất Vắc-xin lý tưởng đơn giản và giá thành thấp đã thành công và đượcđăng kí bảo hộ sáng chế Sau đó nhiều thành công khác về Vắc-xin thực vật cũng đựoccông bố trên nhiều loài cây khác nhau như thuốc lá, rau diếp, cà chua, khoai tây…Sốlượng nghiên cứu về Vắc-xin ăn được đựơc gia tăng đã chứng tỏ tính ưu việt của thực vậtnhư một hệ thống biểu hiện hiệu quả cao, chi phí sản xuất thấp, an toàn về mặt sinh học,

sử dụng và bảo quản dể dàng không cần giữ lạnh

III NGUYÊN LÝ SẢN XUẤT VẮC-XIN ĂN ĐƯỢC

Quy trình sản xuất vaccie ăn được:

- Lựa chọn gen cần được biểu hiện (gen quan tâm) và đưa vào một vector thích hợp

- Lựa chọn đối tượng thực vật thích hợp để chuyển gen;

- Chuyển vector tái tổ hợp mang gen quan tâm vào thực vật đã lựa chọn bằng cácphương pháp chuyển gen khác nhau;

- Kiểm tra biểu hiện của gen quan tâm trong những bộ phận ăn được của thực vật;

- Thử nghiệm khả năng đáp ứng miễn dịch của Vắc-xin sản xuất từ thực vật;

- Sử dụng Vắc-xin đã thử nghiệm thành công bằng cách ăn tươi dưới dạng thức ăn

đã chế biến

Thiết kế vector biểu hiện

Điểm quan trọng nhất trong thiết kế

vector biểu hiện là promoter, đây phải là

promoter khoẻ, có ái lực mạnh với

RNA-polymerase của vật chủ và hoạt động của

promoter được điều hoà một cách dễ dàng Trong nhiều nghiên cứu gần đây, với mụcđích biểu hiện kháng nguyên Vắc-xin trong các bộ phận ăn được của thực vật, người ta

đã thiết kế promoter đặc hiệu mô thực vật, ví dụ promoter đặc hiệu mô củ hoặc mô hạt thìprotein sẽ được sản xuất trong củ hoặc hạt

Hình 1.1 :Tạo thực vật chuyển gen bằng phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium

Gen lấy từ nguồn bệnh người được chuyển vào vi khuẩn gây nhiễm

thực vật

Vi khuẩn được nhiễm vào các mẫu lá khoai tây

mầm tạo đựoc từ các mẫu lá mang gen bệnh

IV CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN VÀO THỰC VẬT

Các phương pháp biểu hiện gen dựa trên thực vật đã được phát triển từ cuối nhữngnăm 1970 đầu 1980 Hiện nay, có thể xếp những phương pháp này vào hai nhóm chínhsau: Chuyển gen ổn định tức là gen quan tâm được bảo tồn qua nhiều thế hệ do gắn vào

hệ gen vật chủ (chuyển gen vào nhân hoặc plastid) và biểu hiện gen tạm thời dựa trên

Agrobacterium và vector virus thực vật, theo nguyên tắc có thể sử dụng bất kỳ phương

pháp chuyển gen vào thực vật nào cũng có thể tạo ra thực vật chứa Vắc-xin ăn được, tuynhiên hiện nay người ta chỉ mới tạo thành công Vắc-xin ăn nhờ súng bắn gen và nhờ vikhuẩn Agrobacterium

1 Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium

Cây chuyển gen đầu tiên đã được tạo ra năm 1983 sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Đây là loại vi khuẩn sống trong đất, gây bệnh cho cây bằng cách gắn các

đoạn gen vào hệ gen của tế bào chủ và sinh ra u nhờ một loại plasmid của vi khuẩn này,

plasmid Ti Người ta đã lợi dụng đặc điểm của vi khuẩn Agrobacterium để chuyển gen

mong muốn vào thực vật, trong đó plasmid Ti bị bất hoạt, nó chỉ còn khả năng gắn ADNvào tế bào và mất khả năng gây bệnh

Trong sản xuất Vắc-xin ăn được, người ta thiết kế một vector gồm hai gen: Một gen

mã hoá cho kháng nguyên virus và một gen kháng kháng sinh Do đó, trong môi trườngcó kháng sinh, những tế bào thực vật không mang gen chuyển sẽ bị chết, trái lại tế bàomang gen sẽ hình thành callus, từ đó tạo thành cây hoàn chỉnh

Phương pháp này có một số bất lợi: plasmid Ti gắn gen ngẫu nhiên vào hệ gen thựcvật, làm tăng tính không đồng đều về mức độ biểu hiện kháng nguyên trong cây chuyểngen Ngoài ra cách gắn gen này có thể phá vỡ biểu hiện gen dẫn đến sinh trưởng bấtthường của cây chuyển gen

Mặc dù hệ thống chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium là có hiệu quả đối với

một số loài nhưng không phải tất cả thực vật có thể được biến nạp bằng con đường này.Ðặc biệt, lớp một lá mầm bao gồm các cây ngũ cốc chính trên thế giới như lúa, lúa mì và

ngô là không được biến nạp dễ dàng nhờ A tumefaciens

Ðể khai thác và sử dụng A tumefaciens như là một vector chuyển gen các nhà khoa

học đã loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hoá opine của T - ADN và thay thế vào đó làcác marker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải và bờ trái của T-ADN và cácgen vir Gen chuyển được xen vào giữa các vùng bờ của T-ADN Nó sẽ được chuyển vào

tế bào và trở nên hợp nhất với nhiễm sắc thể tế bào thực vật.

Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium đã được kiểm tra đối với sự

xâm nhập bền vững, sự biểu hiện và sự di truyền của các gen chuyển đặc biệt

Tuy nhiên, một vài yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp là loại mô được biến

nạp, giai đoạn phát triển của mô, mức độ khởi đầu của vi khuẩn A tumefaciens sử dụng,

môi trường để nuôi cấy mô sau khi biến nạp, marker được sử dụng để chọn lọc thể biếnnạp, loại vector sử dụng và kiểu gen của thực vật

2 Chuyển gen ổn định

 Chuyển gen vào nhân

Là phương pháp chuyển gen ổn định do gắn gen quan tâm vào nhiễm sắc thể thựcvật được ứng dụng phổ biến trong sản xuất protein chức năng Ngoài ra, có thể đưa genvào lục lạp Lục lạp là cơ quan tử của thực vật có nguồn gốc từ vi khuẩn cộng sinh trongthực vật và có cơ thể di truyền rất giống với các plasmid vi khuẩn Người ta tính rằngtrong tế bào lá trưởng thành có tới 100 lục lạp, mỗi lục lạp có chưa 100 bản sao ADNvòng, vì thế mức độ biểu hiện gen rất cao, có thể tới 35% protein tổng số Tuy nhiên,protein được biểu hiện thường không có chức năng đầy đủ do bộ máy di truyền của lụclạp ở mức độ cơ quan tử nên khó có thể đảm bảo các biến đổi sau dịch mã

 Chuyển gen trực tiếp vào protoplast

Ðể ADN dễ xâm nhập được vào tế bào thực vật, phải loại bỏ vách tế bào tạoprotoplast Protoplast có thể được duy trì trong môi trường nuôi cấy như các tế bào sinhtrưởng một cách độc lập hoặc với một môi trường đặc hiệu, vách tế bào có thể được tạothành và toàn bộ các cây có thể được tái sinh từ các tế bào này Quá trình chuyển gen nhưthế này được thực hiện một cách trực tiếp bằng một cơ chế vật lý đơn giản, không cần cóvector

Ðể nâng cao hiệu quả biến nạp, người ta đã đã xử lý protoplast với PGE(polyethylene glycol) hoặc bằng xung điện

Phương pháp chuyển gen này rất có hiệu quả, đặc biệt đối với những loài thực vật

mà phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium không thể thực hiện được.

Với phương pháp này, các nhà khoa học đã chuyển gen thành công vào một số loài cây

một lá mầm như loài lúa phụ Japonica (Datta, 1990), ngô (Doon, 1990), lúa mì (Vassil,

1992)

 Chuyển gen bằng kỹ thuật xung điện

Kỹ thuật xung điện (electroporation) là một phương pháp cơ học được sử dụng đểđưa các phân tử phân cực vào trong tế bào chủ qua màng tế bào Trong phương pháp này,một xung điện cao thế trong khoảnh

khắc (vài phần nghìn giây) có khả

năng làm rối loạn cấu trúc màng kép

phospholipid (hình 2.14), tạo ra các lỗ

thủng tạm thời cho phép các phân tử

ADN ngoại lai từ môi trường xâm

nhập vào bên trong tế bào

Nhiều kỹ thuật nghiên cứu trong

sinh học phân tử yêu cầu đưa gen hoặc protein ngoại lai vào trong tế bào chủ Vì lớpphospholipid kép của màng sinh chất có một đầu ưa nước phía ngoài và một đầu ưa nướcphía trong , nên bất kỳ phân tử phân cực nào, bao gồm cả ADN và protein, đều không cókhả năng đi qua màng một cách tự do

Sơ đồ bên cho thấy các thành phần hóa học của màng sinh chất Các đầu ưa nướcphân cực hướng về phía ngoài trong khi các đuôi

kỵ nước hướng về phía trong và tương tác với

đuôi kỵ nước khác để cùng bám giữ màng Các

phân tử phân cực không thể đi qua màng này nếu

như không có sự hỗ trợ bên ngoài

Nhiều phương pháp đã được phát triển để

vượt qua rào cản này, cho phép đưa ADN và các

phân tử khác vào trong tế bào đã được nghiên cứu Một trong những phương pháp này là

kỹ thuật xung điện

Kỹ thuật xung điện dựa trên trạng thái tương đối

yếu của các tương tác kỵ nước của phospholipid kép

và khả năng tập hợp lại một cách tự động của nó sau

khi bị rối loạn (Purves, 2001) Vì vậy, một xung điện

chớp nhoáng có thể gây ra rối loạn ở các vị trí của

màng một cách nhất thời, làm cho các phân tử phân

cực có thể đi qua, nhưng sau đó màng có thế đóng kín

lại nhanh chóng và tế bào không bị ảnh hưởng gì cả

Hình 2.14:Sơ đồ màng phospholipid kép

Hình 2.15: Cuvette nhựa có điện cực

Hình 2.16 :Máy xung gen (Gene pulser)

(Hãng Biorad)

Các tế bào chủ và ADN ngoại lai được tạo thành dịch huyền phù và cho vào trongmột cuvette nhựa có điện cực (hình 2.15)

Ðể tạo ra xung điện cao thế trong một thời

gian ngắn người ta sử dụng một thiết bị gọi là

máy xung gen (gene pulser) (hình 2.16)

Quá trình cơ bản diễn ra bên trong máy này

có thể được trình bày bằng sơ đồ (hình 2.17)

Sơ đồ này cho thấy mạch điện cơ bản cung

cấp điện cho kỹ thuật xung điện Khi công tắc thứ

nhất đóng, tụ điện nạp điện vào và tích một điện

áp cao Khi công tắc thứ hai đóng, điện áp này

phóng qua dịch huyền phù tế bào Một xung điện

cần thiết cho kỹ thuật này thường là khoảng

10.000-100.000 V/cm (thay đổi tùy theo kích

thước của tế bào) trong vài phần triệu giây đến

một phần ngàn giây Xung điện này làm rối loạn

phospholipid kép của màng tế bào và tạo ra các lỗ

tạm thời Khả năng điện qua màng tế bào cùng

lúc tăng lên 0,5-1,0V vì vậy các phân tử đã được

nạp điện này đi qua màng tế bào thông qua các lỗ

bằng cách thức tương tự như điện di (Hình 2.18)

Lối ADN đi vào tế bào không thể quan sát

thấy dưới kính hiển vi, nhưng hình vẽ này cho

thấy khái niệm cơ bản của sự tạo thành các lỗ trên

màng mà ADN có thể đi qua

Khi các ion đã nạp điện và các phân tử đi qua các lỗ, màng tế bào phóng điện và các

lỗ này đóng lại một cách nhanh chóng và phospolipid kép phục hồi lại cấu trúc cũ(Weaver, 1995) Lúc này các phân tử mong muốn đã ở trong tế bào và chúng được sửdụng cho các nghiên cứu tiếp theo

Hình 2.17: Sơ đồ bố trí mạch cơ bản của

máy xung điện

Hình 2.18: Sơ đồ plasmid chứa DNA ngoại lai đi qua các lỗ tạm thời

trên màng bào chất

Phương pháp này có thể sử dụng đối với gần như tất cả các loại tế bào của các loài.Lúc đầu phương pháp này được sử dụng để chuyển gen vào các tế bào động vật có vú, vềsau cho cả tế bào thực vật ở dạng protoplast Với một số cây một lá mầm quan trọng

(loài lúa phụ Japonica, ngô, lúa mì) mà không thể thực hiện được bằng phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium thì người ta đã thành công với phương pháp này Hiệu quả biến nạp cao Trong một nghiên cứu ở E.coli, 80% số tế bào nhận được

ADN ngoại lai (Miller và Nickoloff, 1995) Lượng ADN ngoại lai cần thiết là ít hơn sovới các phương pháp khác (Withers, 1995) Phương pháp này có thể thực hiện với các mô

in vivo còn nguyên vẹn (Weaver, 1995) Ðoạn ADN ngoại lai được biến nạp có kích

thước lớn Tuy nhiên nếu các xung điện có cường độ và chiều dài không đúng thì một số

lỗ của tế bào sẽ trở nên quá lớn hoặc bị

hỏng không thể đóng lại sau khi tế bào

phóng điện, làm cho tế bào bị tổn

thương hoặc bị thủng (Weaver, 1995)

Một hạn chế nữa là sự vận chuyển ADN

ngoại lai vào và ra khỏi tế bào trong suốt

thời gian điện biến nạp là tương đối

không đặc hiệu Ðiều này dẫn đến kết

quả là không cân bằng ion mà sau đó sẽ

làm rối loạn chức năng của tế bào và tế

bào chết (Weaver, 1995)

Kỹ thuật xung điện được sử dụng

rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau

của sinh học phân tử và y học Các ứng

dụng của kỹ thuật xung điện bao gồm:

Biến nạp ADN: các gen đặc hiệu có thể được tạo dòng trong plamid và sau đóplasmid này được đưa vào tế bào chủ để nghiên cứu cấu trúc và chức năng của gen vàprotein

- Dung hợp tế bào đã kích thích: sự tạo thành các lỗ thủng trên màng xảy ra do xungđiện chớp nhoáng tạo ra cho thấy đã kích thích sự dung hợp tế bào (Weber và Berrg,1995)

3.Chuyển gen bằng súng bắn gen

Súng bắn gen (Gene gun) là một thiết bị sử dụng đểđưa thông tin di truyền vào tế bào, được thiết kế đầu tiêncho biến nạp ADN ngoại lai vào tế bào thực vật và đượcphát triển vào đầu thập niên 1980 do các nhà thực vật học ởÐại học Corrnell cùng với các nhà nghiên cứu ở CorrnellNanofabrication Facility, Newyork, USA Súng bắn genđược bán trên thị trường vào năm 1990 Ðạn sử dụng choloại súng này là các hạt kim loại nặng cơ bản được bao bọcADN Tên chính xác và đầy đủ của súng bắn gen là hệthống phân phối hạt biolistics (biolistic particle deliverysystem) và kỹ thuật này thường được gọi một cách đơn giản là biolistics (sự kết hợp giữahai thuật ngữ biology (sinh học) và ballistics (sự bắn tung)) Mặc dù có nhiều thiết kế kỹthuật khác nhau nhưng nguyên lý chung của phương pháp này là sử dụng áp lực xung củakhí helium để gai tốc các hạt.

Súng bắn gen bao gồm hai buồng bằng

thép không gỉ, kích thước 6“x7“x10“ nối với

hai bơm chân không ADN ngoại lai được gắn

vào các hạt tungsten có đường kính rất nhỏ,

khoảng 1μm (các kim loại nặng khác như

vàng và bạc cũng được sử dụng nhưng không

thường xuyên do giá cả đắt) Các hạt này

được đặt trên một cái đĩa ở mặt bên trong của

súng Sự bùng nổ khí helium ở 1000psi làm

cho cái đĩa bắn về phía trước với tốc độ 1300

food/s, tương đương với tốc độ khi một viên

đạn rời khỏi nòng súng Một tấm chắn làm

dừng đĩa lại và các hạt vàng hay tungsten

được phóng về phía các tế bào đích Chúng xuyên qua vách tế bào và phóng thích cácphân tử ADN (Hình 2.21) Súng bắn gen sử dụng kỹ thuật ADN tái tổ hợp để hợp nhất sựbiểu hiện các gen đã phân phối Các tế bào biến đổi di truyền có thể được sử dụng để tạothực vật bao gồm cả sự sửa đổi di truyền mong muốn ở trong tất cả các tế bào của chúng(Voiland, 1999)

Hình 2.21:Sơ đồ nguyên lý hoạt động của súng

bắn gen

Súng bắn gen