Bài giảng Điện di

Khái niệm cơ bản• Điện di : hiện tượng chuyển dịch của các vật thể mang điện tích dướitác động của điện trường .Sự dịch chuyển này do thành phần lựcđiện trong lực Lorentz.. Trang 6 9/2/2

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦY LỢI

Khoa Hóa và Môi trường – Bộ môn Công nghệ Sinh học

Giảng viên: TS Lê Thị Ngọc Quỳnh

Điện di (Gel Electrophoresis)

1 Khái niệm cơ bản

• Điện di : hiện tượng chuyển dịch của các vật thể mang điện tích dướitác động của điện trường Sự dịch chuyển này do thành phần lực

điện trong lực Lorentz

• Áp dụng điện di DNA, RNA, protein

• Các chất giá thường được dùng:

1 Khái niệm cơ bản

• Kỹ thuật điện di trên gel : Kĩ thuật phân tích các phân tử DNA, RNA Hai loại gel được sử dụng trong nghiên cứu

nucleic acid là gel polyacrylamide và gel agarose.

• Việc chọn loại gel cũng như nồng độ các chất tạo thành

gel tùy thuộc kích thước trung bình của các đoạn

nucleic acid cần phân tách

Nguyên tắc điện di

• Dựa vào tính phân cực của phân tử và khả năng di

chuyển về một hướng xác định khi chịu tác động của

một điện trường.

• Trong dung dịch thì các phân tử bị tích điện:

pH>7 : các phân tử mang điện âm

pH<7 : các phân tử mang điện dương.

• Dòng điện được dẫn bởi dung dịch đệm

Dung dịch đệm giữ cho pH và điện tích xung quanh giá trị không đổi

 Giữ cho việc phân tích không thay đổi

 Bộ đệm gồm Cl và Glycine

• Tác dụng của điện trường trên mẫu:

 Điện thế cao gây tốc độ di chuyển lớn hơn

 Đồng thời cũng gây tác động nhiệt

- Có thể làm biến tính mẫu Protein và phá hủy khối Gel

- Làm xáo trộn mẫu thông qua sự đối lưu của dung dịch đệm

Điện trường

• Gel bao gồm các loại polysacharit.

• Được đổ tràn vào trong các bìa và cột , và có thể tạo

các ống nhỏ trên gel bằng răng lược.

• Rất ổn định, giúp các thao tác sau phân ly dễ dàng.

• Sự thay đổi tính động của gel ảnh hưởng tới kích cỡ

các lỗ

• Dạng gel dùng chủ yếu: agarose và acrylamide

• Việc chọn loại gel cũng như nồng độ các chất tạo

thành gel tùy thuộc kích thước trung bình của các

đoạn nucleic acid cần phân tách

Gel

Định nghĩa điện di ADN

• Điện di ADN là quá trình phân tách một hỗn hợp các

phân tử ADN nhờ một chất nền cố định (gel) trong

một điện trường.

• ADN tích điện âm vì gốc photphat hình thành khung

đường phosphate của phân tử ADN tích điện âm.

→ trong điện trường di chuyển về phía cực dương

Cơ chế

• Đặt gel điện di đã nạp vật mẫu nghiên cứu vào dung dịch

đệm của môi trường điện di có độ PH thích hợp.

• Cho dòng điện 1 chiều (V~150 V, I ~150 mA) chạy qua

môi trường điện di Dưới tác dụng của thế hiệu dòng điện

1 chiều các phần tử tích điện sẽ di chuyển về cực trái dấu

với tốc độ khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc , kích thước, trọng lượng phân tử

• Ở điều điện nhiệt độ và thời gian thích hợp , các cấu tử

điện di sẽ di chuyển trên giá thể điện di hay bản gel với tốc

độ khác nhau di tạo phổ băng điện di.

• Nhuộm màu bản gel với thuốc nhuộm thích hợp , quan sát phổ băng điện di dưới kính hiển vi quang học hay chụp

ảnh với độ phóng đại cần thiết.

9/2/2021

9/2/2021

9/2/2021

Điện di protein bằng SDS-polyacrylamide

• Điện di trên gel polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE): tách protein

dựa trên khối lượng phân tử (MW)

• Quá trình polymer hóa được hình thành thành đồng trùng hợp giữa

acrylamide (CH2=CH-CO-NH2 ) và cross linker, thông thường là

N,N’ methylenebisacrylamide (CH2=CH-CO-NH-CH2

Điện di protein bằng SDS-polyacrylamide

Nguyên tắc:

9/2/2021

9/2/2021TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦY LỢI

Khoa Hóa và Môi trường – Bộ môn Công nghệ Sinh học

Phản ứng trùng hợp chuỗi

PCR

1 PCR

Khái niệm chung về PCR

• Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction): Khuếch đại một đoạn DNA

quan tâm dựa vào khả năng xen kẽ biến tính các phân tử DNA mạch kép và

lai các mạch đơn bổ sung một cách có kiểm soát.

• Sử dụng DNA polymerase để:

• Sao chép DNA

• Liên kết với sợi DNA mạch đơn bị tách ra để tạo mạch DNA bổ sung

• Thời gian ngắn cho nhiều bản sao DNA

• Độ nhạy (sensitivity) cao

• Kỹ thuật PCR có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét

nghiệm các tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới tính của phôi, giải

mã di truyền, tạo giống mới với các đột biến định hướng, hoặc nghiên cứu

sự tiến hoá của sinh vật ở mức độ phân tử

v “Mồi“ (RNA primer)

vi Protein enzyme đặc hiệu.

Sao chép DNA – Nhânsơ

2

Cơ chế khuếch đại DNA -PCR

• Kỹ thuật tổng hợp DNA ngoài cơ thể ứng dụng trong kỹ thuật PCR cũng

tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của sao chép DNA trong cơ thể

nhưng có sự khác biệt:

• Dùng nhiệt độ cao tháo xoắn thay cho helicase.

• Kết hợp với enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (Taq DNA

polymerase) để tổng hợp DNA mới trong môi trường thích hợp.

• Hệ thống điều nhiệt thích hợp cùng với các đoạn mồi được

thiết kế chuyên biệt, chủ động.

9/2/2021

Các giai đoạn của một phản ứng PCRtrong phòng thí nghiệm

Máy luân nhiệt

Nguyên liệu cho PCR

2 ĐIỆN DI

ĐỌC KẾT QUẢPCR

4 Các loại PCR

Các loại PCR

• PCR cổ điển

• Multiplex PCR: bao gồm nhiều cặp mồi trong một hỗn hợp PCR duy nhất để tạo ra bản

sao kích thước khác nhau đặc trưng cho các trình tự DNA khác nhau Với nhiều đoạn

DNA đích được khuếch đại cùng một lúc, nhiều thông tin thu được từ một lần chạy mà

không đòi hỏi nhiều hóa chất và thời gian thực hiện Nhiệt độ gắn mồi phải được tối ưu

hóa

• Nested PCR: PCR lồng làm tăng độ đặc hiệu của phản ứng PCR bằng cách giảm độ nhiễu

do sự khuếch đại DNA không đặc hiệu Sử dụng hai cặp mồi trong hai phản ứng PCR liên

hợp khuếch đại các đoạn DNA dài, nhưng nó cũng đòi hỏi thông tin chi tiết hơn về các

trình tự đích

• Hot start PCR: kỹ thuật làm giảm sự khuếch đại không đặc hiệu trong quá trình PCR Nó

có thể được thực hiện bằng cách gia nhiệt các thành phần phản ứng ở nhiệt độ biến tính (ví

dụ, 95°C) trước khi thêm các polymerase Hoạt động của polymerase bị ức chế bởi

enzyme đặc hiệu, hoặc kháng thể hoặc bởi sự hiện diện của các liên kết cộng hóa trị với

chất ức chế có khả năng phân ly khi được kích hoạt ở nhiệt độ cao

• Real time PCR

• Reverse transcriptase PCR (RT-PCR)

• Tùy theo mục đích sử dụng mà lựa chọn loại PCR phù hợp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦY LỢI

Khoa Hóa và Môi trường – Bộ môn Công nghệ Sinh học

Giải trình tự DNA

Trình tự nucleotide (trên) và acid amin (dưới) của một phần

exon 2 gen KRAS người

Giải trình tự DNA là một thí nghiệm cho kết quả thứ tự sắp xếp

1 GIẢI TRÌNH TỰ DNA

Kỹ thuật giải trình tự DNA/gen (DNA sequencing)

• Xác định trình tự các nucleotide của một đoạn/toàn bộ

phân tử DNA đích

• Ứng dụng:

Xác định đột biến gen người, VSV

Tạo ngân hàng dữ liệu DNA các loài

Xác định các biến dị

• Có 3 phương pháp được áp dụng để xác định trình tự gen:

1 Phương pháp Maxam and Gilbert

2 Phương pháp Sanger

3 Phương pháp Giải trình tự thế hệ mới

(NGS, Next generation sequencing)

2 Phương pháp giải trình tự DNA

2 Phương pháp giải trình tự DNA

Phương pháp hoá học giải trình tự DNA

của Maxam & Guilbert (1977)

Nobel hóa học 1980 (phương pháp giải trình tự)

Walter Gilbert

Phương pháp enzyme giải trình tự của

Frederick Sanger (1977)

Nobel hoá học 1958 (cấu trúc protein: Insulin)

Nobel hóa học 1980 (phương pháp giải trình tự)

1 Đánh dấu một đầu của đoạn DNA bằng gốc phospho

đồng vị phóng xạ (32P)

2 Xử lý các đoạn DNA đã đánh dấu 32P bằng hóa chất làm

biến đổi đặc hiệu một hoặc hai loại base của nucleotide

trên đoạn DNA

2.1 Phương pháp MAXAM & GILBERT

(Giải trình tự bằng phương pháp hóa học)

1978

Automated DNA Sequencing with Fluorescent Dyes

Mỗi ddNTP có một màu khác nhau, ddTTP đỏ, ddGTP đen,…

Giải trình tự tự động (pp Sanger cải tiến)

9/2/2021

Hệ thống giải trình tự Trugene

Siemens Medical Solutions Diagnostics

CEQ 8000 (Beckman Coulter)

CÁC HỆ THỐNG GIẢI TRÌNH TỰ TỰ ĐỘNG

ABI 3730

Máy phân tích DNA tự động

(máy giải trình tự)

Nhưng đắt, khó tiểu hình hóa & song song

hóa – > năng suất kém

454

pyrosequencing

454

454

Dòng ion – công nghệ giải trình tự thế hệ mới

Nguyên lý tương tự như 454, nhưng thay vì đo đạc

ánh sáng, thìđo đạc bằng điện tửvềsự thay đổi pH

gây ra bởi việc gắn các nucleotide

Dùng chip bán dẫn

thay vì tấm sợi thủy tinh

Rẻ và có thể tùy biến quy mô

Không cần nucleotide chỉnh sửa

> không cần hiển thị hìnhNhận diện tín hiệu điện tử –

ảnh

Đang phát triển nhanh chóng,

hiện nay mỗi lần chạy có thể đọc

trên 200 bp, 10 Gb

Illumina –

công nghệ giải trình tự thế hệ mới

Khuếch đại bắc cầu trên tấm thủy tinh

Hàng trăm triệu cụm, mỗi cụm có hơn 1000 bản sao

phân tử DNA y hệt nhau

Illumina – khuếch đại bắc cầu

Làm biến tính Đổi chất đệm –

động

Kéo dài (sao chép)

Làm biến tính Kéo dài (sao chép) Sau

kỳ

> 1000 phân

35 chu Cắt bỏ mồi – >

cụm các đoạn

Illumina –

công nghệ giải trình tự thế hệ mới

Mỗi chu kỳ gắn thêm 4 nucleotide,

các nucleotide này là nhân tố ngắt

Chi phí đang giảm rất nhanh

Chi phí giải trình tự bộ gene người

9/2/2021

9/2/2021TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦY LỢI

Khoa Hóa và Môi trường – Bộ môn Công nghệ Sinh học

Kỹ thuật lai phân tử

(acid nucleic)

4 Lai vi dãy (micro array)

5 Lai tại chỗ (FISH)

1 Giới thiệu chung

9/2/2021

Recap

Recap

2 Southern Blot

Khái niệm chung

• Southern blot là kỹ thuật lai đầu tiên, ứng dụng trong phát

hiện các đoạn DNA có trình tự đặc hiệu, do E M Southern

3 PP Northern Blotting

Khái niệm chung

• 1977: James Alwine, David Kemp, and

George Stark at Stanford University

• RNA phân tích theo kích thước  điện di

• Biến tính: (i) ngăn cản sự hình thành cấu trúc

bậc hai của RNA (ii) không cản trở sự di

chuyển cũng như sự tách của các RNA trên gel

• Mẫu dò DNA có đánh dấu phóng xạ lai với RNA

đích

• Xác định được biểu hiên gen

Quy trình

Video tham khảo: https://youtu.be/1ocmeyP6gmI

Ứng dụng

• Sử dụng

• Phát hiện sự có mặt mRNA trong các mẫu khác nhau

• Phân tích sự biểu hiện của gen giữa hai mẫu

• Phát hiện virus RNA

Câu hỏi

• So sánh Southern và

Northern Blotting

• Với những tiến bộ trong

công nghệ ngày nay,

chỗ đứng?

4.Lai vi dãy (microarray)

Khái niệm chung

• Có thể đồng thời giám sát biểu hiện của hàng ngàn gene bằng kỹ thuật

DNA microarray (một kỹ thuật nữa cũng dựa trên nguyên lý lai axit

nucleic)

• DNA microarray là một mảng có tổ chức của hàng ngàn trình tự

đặc hiệu gen, gắn với mật độ cao trên bề mặt của phiến kính hiển vi

bằng thủy tinh

• Phân tích DNA microarray đồng thời phát hiện mức độ biểu hiện

tương đối của hàng ngàn gen trong các loại tế bào khác nhau hoặc

trong cùng loại tế bào dưới điều kiện khác nhau

→ DNA microarray hoạt động dựa trên cơ chế lai phân tử DNA

5 FISH – Lai phân tử

huỳnh quang tại chỗ

Fluorescence In-situ hybridization (F-ISH)

Khái niệm chung

• Đặc điểm:

• Đầu dò huỳnh quang (probe), Trình tự bổ sung trên NST, Xác định trình tự DNA đặc trưng trên NST

• Xem xét chu trình nhân lên của tế bào, đặc biệt ở pha trung gian của nhân tế bào để tìm các bất

thường trong nhiễm sắc thể

• Ứng dụng:

• Tư vấn di truyền

• Phát hiện và xác định vị trí các RNA đích đặc hiệu (mRNA, microRNAs) bên trong tế bào, tế bào

khối u tuần hoàn di căn và các mẫu mô

• Xác định sự biểu hiện gene (trong tế bào và mô nhất định ở những khoảng thời gian khác nhau trong

quá trình phát triển)

• Giới hạn phát hiện cao

• Đầu dò huỳnh quang

thiết kế

• Không kinh tế

• Tay nghề cao

Quy trình

Video tham

khảo:https://youtu.be/b81DcJC1jAs

FISH – Chẩn đoán

ung thư vú HER2

FISH – Chẩn đoán

ung thư vú HER2

(1)Đoạn dò PathVysion DNA Spectrum Orange-đặc hiệucho gen HER2

(2)Đoạ n dò Spectrum Green đặc hiệu cho các trình tự DNA tạ i tâ m động của

nhi ễm sắc thể 17 (CEP17)

FISH – Chẩn đoán

ung thư vú HER2

• XN FISH: Dual color, tỷ lệ > 2.2  khuếch đại HER2

• XN FISH: Single color  6/nucleus  khuếch đại HER2

Polysomy 17

 Gây nhiễu kết quả XN