Chuong 2 pt hltp 1 sac ki final

9/13/2020 1 NỘI DUNG • Cơ sở lý thuyết • Phân loại các phương pháp sắc kí • Quá trình sắc kí cơ bản và sắc kí đồ • Các thông số đặc trưng của pp sắc kí • Ứng dụng của pp sắc kí • Các phương pháp sắc k[.]

NỘI DUNG

• Cơ sở lý thuyết

• Phân loại các phương pháp sắc kí

• Quá trình sắc kí cơ bản và sắc kí đồ

• Các thông số đặc trưng của pp sắc kí

• Ứng dụng của pp sắc kí

• Các phương pháp sắc kíCỔ ĐIỂN

• PP sắc kí lỏng hiệu năng cao(HPLC)

• PP sắc kí khí(GC)

CƠ SỞ LÝ THUYẾT

 Sắc kí là phương pháptách các chất

 Dựa trên 2 quá trình

–Hấp phụ

–Giải hấp phụ

 Xảy ra liên tục giữa 2 pha không trộn lẫn

–Pha tĩnh(cột sắc kí): chất rắn hoặc lỏng

–Pha động: là chất lỏng (LC) hoặc chất kí (GC)

Trong pttp sắc kí được ứng dụng rộng rãi để

định lượng các hợp chất, đặc biệt là hàm lượng

nhỏ.

Lịch sử ra đời

• Hỗn hợp các chất tách ra khỏi nhau khi đi qua cột!

Năm 1906 - Mikhail SemenovichTswett (1872-1919)

đã thí nghiệm tách chất bằng cột

PHÂN LOẠI

Cách 1: Dựa trêncấu tạo pha tĩnh

– Sắc kí cột – Sắc kí phẳng

Cách 2: Dựa trêntính chất pha động

– Sắc kí lỏng (LC) – Sắc kí khí (GC)

Cách 3: Dựa trên bản chấttương tác giữa chất phân tích với pha tĩnh

– Sắc kí phân bố – Sắc kí hấp phụ – Sắc kí trao đổi ion – Sắc khí gel

QUÁ TRÌNH TÁCH TRONG SẮC KÍ

• Quá trình tách (separation) là quá trình cơ bản

trong pp sắc kí (chromatography)

• Nhờ vào việc tách riêng từng chất ra khỏi nền

mẫu ban đầu mà việc định tính và định lượng trở

nên dễ dàng hơn rất nhiều

• Cơ chế: do sự khác biệt về ái lực của chất phân

tích (các chất khác nhau có ái lực khác nhau!) với

hai pha không trộn lẫn, mà các chất này tách

nhau ra khi chúng di chuyển dưới tác dụng của

pha động (pha di chuyển) đi qua pha tĩnh (pha

đứng yên)

SẮC KÍ ĐỒ (Chromatogram)

• Là đồ thị biễu diễn mối quan hệ giữa tín hiệu – nồng độ - thời gian.

– Định tính: dựa vào thời gian lưu tR

– Định lượng : dựa vào diện tích hay chiều cao peak

• Peak sắc kí: thời gian lưu và cường độ tín hiệu (diện tích hay chiều cao).

• Mỗi 1 peak tương ứng với 1 chất => phân tích đồng thời nhiều chất trong 1 lần phân tích mẫu.

Thời gian lưu

CÁC ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG TRONG SẮC KÍ

• Thời gian lưu tR

• Hệ số phân bố K

• Hệ số chọn lọc α

• Hệ số dung lượng k’

• Số đĩa lý thuyết N

• Chiều cao đĩa lý thuyết H

• Độ phân giải Rs

• Phương trình Van Deemter

Thời gian lưu - tR

• Là thời gian chất phân tích đi ra khỏi cột, có tính đến tương tác với pha tĩnh.

• Thời gian lưu chết tM:

là thời gian chất phân tích đi ra khỏi cột khi không có tương tác với cột.

• Thời gian lưu thực t’R

= tR- tM

Là thông số quan trọng và đặc trưng cho từng

chất phân tích trong điều kiện xác định.

Dùng để định tính (một phần!).

Thời gian lưu - tR

Thời gian lưu của chất được quyết định bởi:

- Pha tĩnh (loại, cỡ hạt, độ xốp, loại xốp,…)

- Pha động (loại khí, thành phần, tốc độ,…)

- Bản chất và cấu trúc chất PT

- Nhiệt độ cột trong quá trình chạy SK

Hệ số phân bố K

• Là đại lượng đặc trưng cho cân bằng động của

chất phân tích giữa 2 pha: tĩnh và động

K = CS/CM

–CSvà CM: là nồng độ chất trong pha tĩnh và pha

động

–K càng lớn chất giữ lại càng lâu trên cột

K phụ thuộc các yếu tố:

- Bản chất, cấu trúc phân tử của chất PT, nhóm chức, nhóm thế,

- Bản chất, loại và cấu trúc SP

- Bản chất, thành phần và tốc độ MP

- Nhiệt độ cột tách

Hệ số phân bố K

 = Hệ số tách của hai chất

t’Avà t’B: thời gian lưu thực của chất A và B

k‘A, k’B: hệ số chứa của chất A và B

Với 2 chất kề nhau:

= 1: không có sự tách sắc ký của 2 chất

 1: có sự tách sắc ký của 2 chất

15

A B

A B

m A r

m B r

k

k t

t t t

t t

'

' '

'

,

,













Hệ số chọn lọc - 

Hệ số dung lượng k’ (K’)

• Đại lượng đăc trưng cho sự di chuyển của chất phân tích trên cột

k'=K’=KAVS/VM

• Cách xác định:

k'=(tR-tO)/tO

Số đĩa lý thuyết N

- Số đĩa lý thuyết (N): biểu thị

số lớp chất di chuyển trong cột.

N = 16(t R /w b ) 2 = 5.545(t R /w 0.5 ) 2

tR: thời gian lưu tòan phần

wbvà w0.5là độ rộng peak đo tại chân đường nền và tại nửa chiều cao peak

Số đĩa lý thuyết thực (hiệu dụng) N’:

N’ = 16(t’R/wb) 2 = 5.545(t’R/w0.5) 2

- Chiều cao đĩa lý thuyết: bề dày của lớp chất

mẫu trong cột tách

h = L/N

Chiều cao đĩa lý thuyết hiệu dụng:

H = L/N’

L : chiều dài cột tách (mm)

H, h: mm

Độ phân giải Rs

• Là đại lượng cho phép đánh giá hai chất có thể tách ra khỏi nhau không.

WA, WB; độ rộng đáy của peak sắc ký hai chất A và B t'RA, t’RB: thời gian lưu của hai chất A và B

•

Độ phân giải Rs

• Muốn tăng độ phân giải Rs => tăng α, N, k’ (k)

Hiện tượng kéo đuôi, đầu của peak sắc kí

Ưu điểm của PP sắc ký

Có thể phân tích đồng thời nhiều hợp chất

Độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột

Độ nhạy cao (ppm-ppb)

Thể tích mẫu phân tích nhỏ (1-100µL)

PT nhanh

23

ỨNG DỤNG CỦA SẮC KÍ

• Phổ biến trong các mẫu thực phẩm như: dư lượng thuốc trừ sâu, kháng sinh, độc chất…ở hàm lượng vết đến siêu vết

• Định tính: dựa vào thời gian lưu

• Thử độ tinh khiết: không có peak ứng với các tạp chất

• Định lượng: dựa vào mối quan hệ giữa diện tích (chiều cao) peak với hàm lượng của chất phân tích Thường sử dụng kĩ thuật đường chuẩn

SẮC KÍ CỘT CỔ ĐIỂN

• Pha động: dung môi hữu

cơ Chảy qua cột dưới tác dụng của trọng lực/ (áp thấp)

• Pha tĩnh: hạt nhồi vào trong cột

• Quá trình tách: chất phân tích được đưa vào đầu cột, cho dung môi từ từ chảy qua cột dưới tác dụng của trong lực Do sự khác biệt giữa các chất với pha tĩnh

và pha động khác nhau mà các chất này tách ra khỏi nhau khi đi qua cột

Dựa trên màu sắc (quan sát bằng mắt)

hoặc ghi nhận tín hiệu bằng các

detector tiến hành thu nhận các phân

đoạn khác nhau (các chất khác nhau) =>

sắc kí điều chế.

SẮC KÍ BẢN MỎNG

• Pha động: chất lỏng.

• Pha tĩnh: chất rắn or chất lỏng gắn trên bản mỏng.

• Quá trình tách: chất phân tích được chấm vào vạch cuối bản mỏng, làm bay hơi dung môi Đưa bản mỏng + chất phân tích vào bình chứa dung môi Dung môi + chất phân tích di chuyển lên do lực mao dẫn

• Tùy thuộc vào ái lực của chất phân tích với pha tĩnh và pha động mà quãng đường di chuyển khác nhau trong 1 khoảng thời gian xác định =>

cơ sở định tính

Rf = a/b Rf: 0-1 Giá trị Rftrong khoảng 0.25 – 0.35

SẮC KÍ GIẤY

• Tương tự sắc kí bản mỏng!

• Pha tĩnh là giấy cellulose (chất rắn)

SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO - HPLC

H igh P erformance L iquid C hromatography

• Quá trình tách thực hiện trên cột, nhồi các hạt có kích thước bé cỡ µm (5µm, 3µm) => cần áp lực cao để đẩy dung môi đi qua cột Hiệu quả tách rất cao

• Pha động (dung môi): chất lỏng, có vai trò đẩy chất phân tích ra khỏi cột

• Pha tĩnh (cột): chất rắn hoặc chất lỏng, lưu giữ và tách chất phân tích

THIẾT BỊ HPLC

1 Dung môi (pha động)

2 Bơm cao áp

3 Bộ tiêm mẫu

4 Cột sắc kí (pha tĩnh)

5 Detector

6 Hệ thống ghi đó, xử lý tín hiệu

1 Dung môi (pha động): có vai trò đẩy chất phân tích ra khỏi cột Nước và dung môi hữu cơ

2 Bơm cao áp: bơm dung môi đi qua cột

3 Bộ tiêm mẫu: đưa mẫu chất phân tích vào cột

4 Cột sắc kí (pha tĩnh): tách hỗn hợp thành các cấu

tử riêng lẻ *là trái tim của hệ sắc kí*

5 Detector: ghi nhận các chất khi đi ra khỏi cột theo thời gian Tín hiệu ghi nhận (cường độ) tỉ lệ với hàm lượng chất phân tích => cơ sở định lượng

6 Bộ phân thu nhận và xử lý tín hiệu:

THIẾT BỊ HPLC (tt)

LC Instrumentation

The Agilent 1100, a typical modern LC system

Solvent reservoirs

Solvent degasser Pump

Autosampler

Column oven

DAD

SẮC KÍ KHÍ - GC

• Thường sử dụng phân tích các hợp chất dễ bay hơi và bền nhiệt

• Pha động (khí mang): các khí trơ như N2, Ar,

He Đẩy chất phân tích đi ra khỏi cột

• Pha tĩnh (cột): chất rắn, hoặc lỏng Lưu giữ và tách chất phân tích

THIẾT BỊ GC

1 Pha động (khí mang)

2 Buồng tiêm mẫu

3 Lò cột

4 Pha tĩnh (cột)

5 Detector

6 Bộ phân ghi nhận và

xử lý tín hiệu

THIẾT BỊ GC (tt)

1 Khí mang (pha động): là các chất khí trơ như N2, Ar, He…đẩy chất phân tích ra khỏi cột Pha động không có tương tác với chất phân tích.

2 Buồng tiêm mẫu: là nơi mẫu được đưa vào, hóa hơi, và lôi cuốn theo dòng khí mang vào cột.

3 Lò cột: dùng điều khiển nhiệt độ cột tách.

Trong GC, quá trình phân tách dựa trên sự khác nhau về ái lực giữa các chất với pha tĩnh, và nhiệt độ bay hơi của chất phân tích khi chúng di chuyển liên tục dọc theo cột sắc kí.

Chương trình nhiệt : nâng cao hiệu quả tách Thường dùng chương trình gradient nhiệt cho các mẫu phức tạp

4 Cột sắc kí (pha tĩnh): tách chất phân tích Có 2

loại cột nhồi và cột mao quản

5 Detector: ghi nhận chất phân tích ra khỏi cột

theo thời gian Cường độ tín hiệu (diện tích peak

hay chiều cao) tỉ lệ với hàm lượng chất phân tích

=> cơ sở định lượng

Các loại detector phổ biến: ion hóa ngọn lửa FID;

Cộng kết điện tử ECD; khối phổ MS

6 Hệ thống ghi nhận và xử lý tín hiệu: phần mềm

và máy vi tính

THIẾT BỊ GC (tt)

Câu hỏi

1 Vẽ và mô tả cấu tạo thiết bị HPLC và GC

2 So sánh HPLC với GC

3 Khi sử dụng dung môi và đệm pH cần lưu ý

gì?

4 Vì sao nối cột bảo vệ vào cột phân tích?

5 Vì sao cần duy trì dòng ổn định từ bơm?

6 Tác hại của chất rắn và khí hòa tan trong pha

động và biện pháp loại trừ