CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT(CELL CULTURE TECHNOLOGIES)

Các tế bào nuôi cấy thường được mô tả dựa trên hình thái của chúng (hình dáng và ngoại hình) hoặc các đặc tính chức năng của chúng. Loại tế bào giống như tế bào biểu mô: Dính bám vào giá thể, trải phẳng ra với dạng nhiều cạnh Loại tế bào giống như nguyên bào lympho: Không dính bám vào giá thể nhưng tồn tại trong dịch huyền phù và có dạng hình cầu. Loại tế bào giống như nguyên bào sợi: Bám vào giá thể, có hình thon dài với hai cực, thường hình thành xoắn ở các nuôi cấy lớn.

CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY

TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

(CELL CULTURE TECHNOLOGIES)

GV: PGS TS Trần Quốc Dung

I Lịch sử của nuôi cấy tế bào

II Khái niệm

1 Nuôi cấy tế bào (cell culture)

Nuôi cấy tế bào là nuôi cấy các tế bào tách rời từ mô gốc, từ nuôi cấy sơ cấp, từ một dòng tế bào (cell line) hay từ một

chủng tế bào (cell strain) bởi sự tách rời bằng enzyme, cơ

học hay hóa học

2 Nuôi cấy mô (tissue culture)

Là thuật ngữ chung bao gồm nuôi cấy cơ quan và nuôi cấy tế bào

3 Nuôi cấy cơ quan (organ culture)

Là nuôi cấy ba chiều của mô đã tập hợp, giữa lại một số hay

tất cả những đặc điểm mô in vivo.

Ưu điểm của nuôi cấy tế bào động vật

- Kiểm soát được môi trường hóa lý (pH, nhiệt độ, ASTT,…

- Kiểm soát và xác định điều kiện sinh lý.

- Đồng nhất các loại tế bào.

- Tiết kiệm từ số lượng nhỏ hơn của thuốc thử là cần thiết trong cơ thể (in vivo).

- Các câu hỏi về đạo đức, pháp lý, đạo lý của thí

nghiệm động vật đều được tránh.

Nhược điểm của nuôi cấy tế bào

- Trình độ chuyên môn của người nuôi cấy

- Đắt hơn 10 lần cho cùng một số lượng mô động vật, do đó lý do để sử dụng nó trở nên thuyết phục

- Sự tạo thành thể nhiễm sắc lệch bội là không ổn định

3 Các loại tế bào

Các tế bào nuôi cấy thường được mô tả dựa trên hình thái của

chúng (hình dáng và ngoại hình) hoặc các đặc tính chức năng của chúng

- Loại tế bào giống như tế bào biểu mô: Dính bám vào giá thể, trải phẳng ra với dạng nhiều cạnh

- Loại tế bào giống như nguyên bào lympho: Không dính bám vào giá thể nhưng tồn tại trong dịch huyền phù và có dạng hình cầu

- Loại tế bào giống như nguyên bào sợi: Bám vào giá thể, có hình thon dài với hai cực, thường hình thành xoắn ở các nuôi cấy lớn

Loại tế bào giống như

tế bào biểu mô

Loại tế bào giống như nguyên bào sợi

Loại tế bào giống như nguyên bào lympho

Hệ thống nuôi cấy tế bào

Có hai hệ thống cơ bản được sử dụng trong sinh trưởng tế bào Chúng chủ yếu dựa trên khả năng sinh trưởng của các tế bào gắn vào ly hoặc chất nền nhựa được xử lý, gọi là hệ thống

nuôi cấy một lớp hoặc nổi tự do trong môi trường nuôi cấy gọi

là hệ thống nuôi cấy giọt treo

Nuôi cấy một lớp thường tăng trưởng trong nuôi cấy ở đĩa,

bình T, chai lan, phòng nuôi cấy hoặc nhiều đĩa, sự lựa chọn dựa trên số lượng các tế bào cần thiết, bản chất của các môi trường nuôi cấy, chi phí và sở thích cá nhân

II Môi trường nuôi cấy tế bào động vật

1 Thành phần của môi trường nuôi cấy

Vấn đề quan trọng bậc nhất trong nuôi cấy tế bào động vật

là môi trường nuôi cấy phải đủ chất dinh dưỡng, nhân tố

sinh trưởng, độ pH và nồng độ muối ổn định, đồng thời phải

có hệ thống thải bỏ các sản phẩm trao đổi độc hại để tế bào

có thể sống và phát triển được

Nhu cầu dinh dưỡng của các tế bào động vật lớn hơn vi sinh vật do, không giống các vi sinh vật, động vật không trao đổi chất nitrogen vô cơ Vì thế, nhiều amino acid và vitamin cần phải được bổ sung vào môi trường

Amino acid: Cysteine, arginine, glutamine và tyrosin

- Vitamin

- Muối

- Glucose

- Các chất hữu cơ bổ sung

- Hormone và các nhân tố sinh trưởng

- Các chất kháng sinh

III Các thiết bị cần để nuôi cấy tế bào

Trong tủ ngang, không khí

được lọc thổi xuống từ phía trên

của tủ Trong tủ ngang, không

khí lọc thổi vào bên trong theo

chiều ngang

Tủ hút dòng nhỏ

Tủ ấm CO2

Tủ ấm CO2

Kính hiển vi đảo ngược

Sử dụng kính hiển vi đảo ngược

bởi vì tế bào được tìm thấy ở

dưới đáy bình nuôi cấy và có thể

đưa nguyên đĩa peptri hoặc cả

bình lên để quan sát, còn kính

hiển vi thường thì không làm

được điều đó Dó đó kính hiển vi

đảo ngược được sử dụng cho mục

đích này

Kính hiển vi đảo ngược

(kính hiển vi phản pha)

Các bình nuôi cấy

Các bình nuôi cấy

Tế bào dính bám bắt buộc

phải có một bề mặt không độc

hại, sinh học và quang học

cho phép tế bào bám vào và

phát triển trong suốt thời gian

sinh trưởng Chúng gồm đĩa

peptri, chai lõm, bình văn _

T25, T75, T150 (diện tích bề

mặt cm2)

Máy ly tâm

Máy ly tâm

Có nhiều loại máy li tâm

khác nhau dựa vào tốc độ

Một máy li tâm tốc độ thấp

là cần thiết cho tất cả các

loại tế bào nuôi cấy Các tế

bào thường xuyên phân

tâm ở 20 độ C

Tủ làm đông

Tủ làm đông

Làm đông là một sự thay đổi

pha trong đó chất lỏng biến

thành chất rắn Nhờ vậy các

giao tử và phôi người có thể tồn

tại tới 10 năm, quá trình này

được gọi là bảo quản lạnh

IV Phương pháp nuôi cấy tế bào động vật

1 Nuôi cấy sơ cấp

Khi phẫu thuật cắt bỏ các tế bào từ một cơ thể và đặt vào trong môi trường nuôi cấy phù hợp Chúng sẽ gắn vào, phân chia và sinh trưởng Điều này gọi là nuôi cấy sơ cấp Có 2 phương pháp cơ bản:

Thứ nhất: Nuôi cấy mô lấy từ sinh vật để nuôi nhân tạo, các mảnh mô nhỏ được gắn vào một cái ly hoặc được xử lý trong một bình nuôi cấy nhựa và ngâm

mình trong môi trường nuôi cấy Sau vài ngày những

tế bào riêng rẽ sẽ di chuyển từ mô cấy trên bề mặt lọ nuôi cấy hoặc chất nền Khi đó chúng sẽ bắt đầu phân cắt và sinh trưởng

Thứ 2: Phương pháp được sử dụng rộng rãi hơn, tăng tốc độ của quá trình này bằng cách phân hủy mảnh mô gắn các tế bào với nhau như: tách rời tế bào bằng

enzyme, kỹ thuật trypsin lạnh, ấm, cơ học, collagen Điều này tạo nên hệ thống treo của những tế bào đơn sau đó đặt vào trong lọ nuôi cấy bao gồm môi trường nuôi cấy , cho phép sinh trưởng và phân cắt Phương pháp này gọi là phân ly enzyme

Sơ đồ nuôi cấy sơ cấp (Nguồn: CNSH trên người và động vật)

Quy trình nuôi cấy sơ cấp gồm:

- Bước 1: Phân lập mô

- Bước 2: Tách rời tế bào, xác định nồng độ

- Bước 3: Nuôi cấy tế bào

Thuận lợi của nuôi cấy sơ cấp

- Chức năng cụ thể của mô

Hạn chế của nuôi cấy tế bào sơ cấp

- Một hạn chế của nuôi cấy sơ cấp là sự cần thiết để cô lập các tế bào cho mỗi thí nghiệm Phương thức cô lập tế bào phụ thuộc vào sự phá vỡ mô, thường cùng với enzyme phân hủy protein Điều này dẫn đến làm tổn thất hoặc hư hại của màng cơ quan thụ cảm đặc trưng, hư hại đến tính toàn vẹn của màng và hư hại đến sản phẩm của tế bào

2 Nuôi cấy thứ cấp

Nuôi cấy thứ cấp (Secondary culture) là nuôi cấy các tế bào

có nguồn gốc từ nuôi cấy sơ cấp Tùy thuộc vào mục đích, điều kiện và dụng cụ nuôi cấy, các tế bào có thể phát triển ở dạng một lớp đơn dính bám hay phát triển ở dạng huyền

phù

Kết quả của nuôi cấy thứ cấp là tạo ra các dòng tế bào khác nhau sử dụng trong nghiên cứu, trong sản xuất các hợp chất sinh học trong y học và công nghiệp

Khi tế bào dư thừa, họ có thể bảo vệ bằng cách làm lạnh, như dimethysulfoxide (DMSO) hoặc glycerol, cận thận đông lạnh và khi bảo quản tại nhiệt độ lạnh (dưới -130 độ C) cho đến khi họ cần và đem ra sử dụng

IV Ứng dụng

Nuôi cấy tế bào cung cấp một hệ thống mô hình tốt

để nghiên cứu.

1 Hệ thống mô hình

- Sinh học tế bào cơ bản và hóa sinh

- Sự tương tác giữa các tác nhân gây bệnh và tế bào

- Ảnh hưởng của thuốc lên các tế bào

- Quá trình và kích hoạt lão hóa

- Các nghiên cứu về dinh dưỡng

2 Nuôi cấy tế bào trong chất độc

Người ta có thể chủ động tạo ra các hư hại đặc

trưng trên tế bào bằng các chất độc, từ đó phát hiện

ra các bào quan bị ảnh hưởng và xác định các cơ chế sinh hóa và phân tử của quá trình chuyển hóa chất độc.

3 Nghiên cứu bệnh ung thư

Kể từ khi càc tế bào bình thường và tế bào ung thư nuôi cấy sinh trưởng trong cơ thể Ngoài ra bằng việc sử dụng các hóa chất, virus, bức xạ để chuyển đổi các tế bào nuôi cấy bình thường đến các tế

bào gây ung thư Như vậy cơ chế gây ra sự thay đổi có thể được

nghiên cứu Nuôi cấy tế bào ung thư cũng đóng vai trò như một hệ thống kiểm tra để xác định các loại thuốc và phương pháp thích hợp cho việc lọc, phá hủy các loại ung thư

Kỹ thuật này ngoài ra còn được sử dụng để xác định sự tương hợp của mô trong cấy ghép, nghiên cứu các tế bào đặc biệt, sử dụng

nghiên cứu chất độc hóa học

4 Nuôi cấy tế bào trong mô hình thực nghiệm để khảo sát tác động của hóa chất:

Một hóa chất trị bệnh, trước khi được phép lưu hành, phải trải qua nhiều thử nghiệm, trong đó có giai đoạn thử nghiệm trên động vật như chuột, thỏ, khỉ,… Các thử nghiệm này đã gặp phải sử phản đối kịch liệt của các phong trào bảo vệ động vật hoang dã, đồng thời những thử nghiệm này nhiều khi không thể mở rộng trên người, thí nghiệm lâu dài và tốn kém,… Vì vậy, người ta nghĩ ra hướng sử dụng tế bào nuôi cấy làm mô hình thử nghiệm, khi có thể nuôi cấy bất kỳ loại tế bào nào

5 Tạo vacxin

Một trong những ứng dụng chính và sớm nhất của tế bào là sự sao chép của virus trong nuôi cấy tế bào để

sử dụng sản xuất vaccine Vaccine sống giảm độc lực được tạo ra bằng cách nuôi cấy những virus trong môi trường đặc biệt nhằm giảm đặc tính độc hại của

chúng Sau đó các virus này được kết hợp với các

thành phần khác của vaccine như chất ổn định và chất bảo quản để tạo thành vaccine.

Miễn dịch chủ động của cơ thể được tạo ra khi cơ thể được tiêm vaccine Vaccine sẽ kích thích hệ

miễn dịch của cơ thể nhận biết và làm quen với

các tác nhân gây bệnh được sử dụng trong

vaccine Sau một thời gian tiêm vaccine, khi các tác nhân gây bệnh xâm nhập cơ thể người đã được tiêm vaccine thì hệ thống miễn dịch sẽ nhận ra và ngay lập tức sản sinh ra các kháng thể để chống lại tác nhân đó.

6 Sản xuất tế bào gốc.

- Đầu tiên ,là việc sản xuất quy mô lớn của virut để

sử dụng trong sản xuất vaccine Chúng bao gồm các vacxin bại liệt, bệnh dại, thủy đậu, viêm gan và sởi.

- Sản xuất quy mô lớn các tế bào đã được biến đổi gen để sản xuất protein có giá trị chữa bệnh hoặc

thương mại Chúng bao gồm các kháng thể đơn

dòng, insulin, hormone,…

- Thứ 3 là việc sử dụng các tế bào như các mô và các cơ quan thay thế, da nhân tạo được sử dụng

trong điều trị bỏng và loét là sản phẩm thương mại đầu tiên.

Đã tạo ra được các cơ quan trên cơ thể người như tuyến tụy, gan, thận,… Tuy nhiên các cơ quan

nhân tạo này chưa đưa cấy ghép vào cơ thể người

7 Tư vấn di truyền

Chọc màng ối, một kỹ thuật chẩn đoán cho phép các bác sỹ loại bỏ và nuôi cấy tế bào thai nhi từ phụ nữ mang thai, đã cho ra một công cụ quan trọng để

chẩn đoán sớm các tế bào thai nhi.

8 Kỹ thuật di truyền

Khả năng lây nhiễm và tái lập trình các tế bào nuôi cấy với vật liệu di truyền mới (DNA và gen) đã cung cấp một công cụ chính cho các nhà sinh học phân tử để nghiên cứu các hiệu ứng tế bào của sự biểu hiện các gen này (các protein mới) những kỹ thuật này cũng có thể được sử dụng để tạo ra các protein mới với số lượng lớn trong các tế bào nuôi cấy để nghiên cứu thêm

Các tế bào côn trùng được sử dụng rộng rãi như các nhà máy tế bào thu nhỏ để thể hiện số lượng protein đáng kể mà chúng sản xuất sau khi bị nhiễm gen

9 Liệu pháp gen

Trong sinh học phân tử hiện đại, liệu pháp gen là

một kỹ thuật thí nghiệm gồm việc chèn các gen nhân bản, thay đổi vào các tế bào sử dụng công nghệ r – DNA để thay thế các gen khiếm khuyết gây ra

những vấn đề bất thường về gen hoặc ngăn ngừa các rối loạn tiềm năng.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng việt

1 Trần Quốc Dung, Nguyễn Đình Thi, Nguyễn Thị

Diệu thúy, (2013), Giáo trình công nghệ tế bào động

vật, NXB ĐHQG Hà Nội

Tài liệu tiếng anh

2 Magdalena Jedrzejczak Silicka, “History of cell culture”, http://dx.doi.org/10.5772/66905, 2017

3 P.Praveen kumar, B Mounika, “Cell culture

Technologies – A short riview”,

http://www.iosrjournals Org”, 2017.

4 Rajeev Nema, Sarita Khare, “ An animal cell culture: Advance technology for modern research, http://www.SciRP.org/journal/abb/), 2012