Tái bản, sữa chữa DNA docx

Ch ng minh DNA ứng minh DNA tái bản theo kiểu bán bảo tồn 2.. Các đặc tính và yếu tố thiết yếu của sự tái bản 3.. Chứng minh DNA tái bản theo kiểu bán bảo tồn Thí nghiệm của Meselson

Bài 7 : Tái bản DNA và sửa chữa DNA

1 Ch ng minh DNA ứng minh DNA tái bản theo kiểu bán

bảo tồn

2 Các đặc tính và yếu tố thiết yếu của sự tái bản

3 Cơ chế của sự tái bản

4 Sự tái bản ở tế bào chân hạch

5-Sửa chữa DNA

DNA (tái bản)

• 1 Chứng minh DNA tái bản theo kiểu bán bảo tồn

Thí nghiệm của Meselson & Stahl

* Thí nghiệm sơ khởi:

- Ống nghiệm 1: Ly tâm siêu tốc DD CsCl (40.000 v/p trong

48 giờ) → tạo được 1 gradien tỷ trọng (tỷ trọng tăng dần

về hướng đáy ống nghiệm).

- Ống nghiệm 2: Ly tâm siêu tốc DD CsCl với DNA 15 N

(40.000 v/p trong 48 giờ) → tạo được 1 lớp cĩ tỷ trọng nặng nằm gần đáy ống nghiệm.

- Ống nghiệm 3: Ly tâm siêu tốc DD CsCl với DNA 14 N

(40.000 v/p trong 48 giờ) → tạo được 1 lớp cĩ tỷ trọng nhẹ nằm giữa ống nghiệm.

- Ống nghiệm 4: Ly tâm siêu tốc DD CsCl với DNA 15 N và

DNA 14 N (40.000 v/p trong 48 giờ) → tạo được 2 lớp tương ứng với 2 lớp trong ống nghiệm 1&2

• Kỹ thuật ly tâm theo Gradien mật độ:

• Mật độ hay tỷ trọng là khối lượng hay

số hạt của 1 chất trong 1đơn vị thể tích (gr/cm 3 ) Tỷ trọng là số đo độ chặt của các chất.

• DD CsCl ly tâm siêu tốc, các ion

Cesium hướng về đáy ống ( tạo 1

Gradien mật độ hay thang tỷ trọng - ion Cesium nhiều ở đáy ON)

• Mỗi DNA lắng thành 1 lớp tương ứng

theo tỷ trọng của nó (DNA 15 N ở dưới

và DNA 14 N ở trên)

* Thí nghiệm của Meselson & Stahl

Nuôi VK E.coli trong MT chứa 15 N là nguồn đạm duy nhất, sau 1 thời gian trích DNA nghiên cứu Chuyển VK

E.coli sang MT chứa 14 N là nguồn đạm duy nhất để đủ 1 lần phân chia tế bào, trích DNA nghiên cứu Tương tự nuôi

tiếp E.coli trong MT chứa 14 N để đủ 2,3 lần phân chia tế bào, trích DNA nghiên cứu Ghi nhận và giải thích kết quả.

Trong MT chứa 15N, DNA của E.coli

chứa 15 N lắng thành 1 lớp như ống

nghiệm 1 Chuyển sang MT chứa 14 N, ở lần phân bào thứ 1 có duy nhất 1 lớp

DNA lai (1 mạch 15 N và 1 mạch 14 N ) - ở lần phân bào thứ 2 có 2 lớp gồm: 1 lớp DNA lai (50%) và 1 lớp DNA 14 N (50%) -

ở lần phân bào thứ 3 cũng có 2 lớp

gồm: 1 lớp DNA lai (25%) và 1 lớp DNA

14 N (75%) Kết luận DNA tự nhân đôi

theo kiểu bán bảo toàn.

• 2 Các đặc tính và yếu tố thiết yếu của sự tái bản

• Các đặc tính

  Theo cơ chế bán bảo toàn

  Phát triển theo hai hướng từ OriC

  Sự gắn nucleotide theo hướng 5’ 3’, theo cách đối song (với sợi cha-mẹ) và bắt cặp bổ sung

  Không liên tục trên một trong hai sợi

Cơ chế bán bảo toàn

Cơ chế bán bảo toàn

DNA con cĩ mang 1 mạch đơn của

cha-mẹ và 1 mạch đơn mới cĩ các nucleotide lấy

từ mơi trường (TN chứng minh của

Meselson & Stahl) Như vậy DNA con cĩ

mang 1 mạch cũ và 1mạch mới (bán bảo

tồn).

Phát triển theo hai hướng từ OriC

Gắn nucleotide theo hướng 5’ 3’, đối song

• Phát triển theo hai hướng từ OriC

Điểm khởi đầu của sự tái bản là OriC

* Ở SV Procaryote: DNA 2 sợi vịng cĩ 1 điểm khởi đầu

cố định là OriC (đánh dấu trên pt DNA của vi khuẩn

E.coli bằng 1 đoạn DNA của virus µ) Đơn vị sao chép

gọi là Replicon, VK cĩ 1 Replicon

* Ở SV Eucaryote: DNA 2 sợi thẳng cĩ nhiều điểm khởi đầu SV Eucaryote cĩ nhiều Replicon TD ở Người cĩ 20- 30.000 điểm khởi đầu và mỗi Replicon khoảng 100-

200kb

Bắt cặp bổ sung

Các base của 2 mạch đối diện bắt cặp theo nguyên tắc bổ

sung A với T(2 cầu nối

Hydrogen) và C với G T(3 cầu nối Hydrogen)

• *Sự gắn nucleotide theo hướng 5’ 3’, theo

cách đối song (với sợi cha-mẹ):

• Ở mạch mới sự kéo dài chuỗi theo hướng

5’ 3’ (dọc theo hướng 3’ 5’ của sợi khuôn)

• Sợi khuôn 3’ 5’

• Mạch mới 5’ 3’

• Sợi khuôn 3’ ATTGCACT………… 5’

• Mạch mới 5’ TAACGT… 3’

•Không liên tục trên một trong hai sợi

• Không liên tục trên một trong hai sợi

• * Ở một trong 2 mạch sự tái bản từng đoạn nhỏ (Khoảng 1968-1972, Okazaki & csv

phát hiện - gọi là đoạn Okazaki (cĩ kích

thước 1000 - 2000 pb)

* DNA Ligase nối các đoạn Okazaki

• Các yếu tố thiết yếu

• (1) Các nucleoside triphosphate: dATP, dTTP,

dCTP và dGTP (nguyên liệu cho sự tái bản &

nhiên liệu cung cấp năng lượng)

• (2) Sợi khuôn (sợi đơn cha-mẹ): sợi sẽ được giữ

trong phân tử DNA mới (bán bảo toàn).

• (3) Mồi RNA (do DNA Primase tạo): là 1 đoạn RNA gồm 4-12 nucleotide, giúp DNA pol III kéo dài chuỗi polynucleotide

• (4) Các enzyme và protein, bao gồm:

 Helicase: enzyme mở xoắn

 DNA Gyrase: cản sự xoắn trở lại

 DNA Primase: tạo đoạn mồi RNA

 DNA pol III kéo dài sợi DNA đang tăng trưởng

 DNA pol I loại đoạn mồi RNA và tổng hợp đoạn DNA thay đoạn mồi

 DNA ligase tạo cầu nối phosphodiester giữa hai đoạn Okazaki cạnh nhau

 SSB Protein giữ sợi DNA thẳng (các sợi khơng tái bắt cặp)

• Các đặc tính của các DNA polymerase

  Gắn nucleotide vào 3’OH của mồi và 3’OH của sợi đang tăng trưởng

  Kéo dài chuỗi theo hướng 5’ 3’ (dọc theo hướng 3’ 5’ của sợi khuôn)

  DNA polymerase III kéo dài chuỗi DNA theo hướng 5’ 3’

  DNA pol I cĩ 2 vai trị:

• *loại mồi (đĩng vai trị của 1 Exonuclease 5’ 3’)

• * thay thế mồi bởi DNA ( đĩng vai trị của 1 DNA polymerase theo hướng 5’ 3’)

* Tổng hợp DNA in vitro:

1956 Kornberg tổng hợp DNA in

vitro nhờ ly trích được 1 enzyme DNA

polymerase trong E.coli Enzyme này

tổng hợp DNA in vitro khi có: DNA

khuôn, 4 loại Nucleotide, đoạn mồi

RNA, Mg 2+ ( sau này còn gọi tên là DNA Kornberg hay DNA polymerase I) Sau

nay người ta biết E.coli có 3 DNA

polymerase I, II, III (nay là 5)

Tóm tắt quá trình tự tái bản DNA:

DNA 2 sợi mở xoắn (Helicase) → tạo đoạn mồi (DNA primase) → tổng hợp sợi mới từ đầu 3’ OH của mồi (DNA

polymeraseIII) dựa vào sợi khuôn 3’  5’ → loại đoạn mồi (DNA polymerase I- Exonuclease 5’ 3’ ) → tổng hợp đoạn DNA thay đoạn mồi (DNA polymerase theo chiều 5’ 3’ ) Ở các sợi bất liên tục DNA Ligase nối các đoạn Okazaki lại với nhau.

3 Sự tái bản ở tế bào chân hạch

Tế bào chân hạch cũng tái bản DNA theo cơ chế căn bản như tế bào tiền hạch

- theo 2 hướng phát triển;

- kéo dài 5’ 3’ (bổ sung & đối song với sợi

khuôn);

- cần mồi RNA;

- không liên tục ở 1 trong 2 sợi

nhưng khởi đầu đồng thời ở nhiều ngàn điểm trên

1 phân tử DNA rất dài (thay vì ở 1).

- Ở tế bào chân hạch cĩ các DNA polymerase khác TB tiền

hạch

• 4 Sửa chữa DNA

• Vì sao phải sửa chữa?

• Sự sống còn của sinh vật tùy thuộc sự nhân đôi

chính xác của genome

• ° Lỗi tổng hợp mRNA (do RNA pol) dẫn tới

protein khiếm khuyết, nhưng mRNA là bản sao có đời sống ngắn (ít gây hậu quả kéo dài)

• ° Lỗi trong tái bản DNA (do DNA pol) gây đột

biến và có thể làm biến mất 1 dòng tế bào.

Có nhiều cách, trong và sau sự tái bản, ví dụ sửa chữa nhờ hoạt tính exonuclease của DNA pol (đọc bản in thử): Khi nucleotide sai vào chuỗi, đầu chuỗi có tách khỏi khuôn để vào vị trí exonuclease.

• Tỷ lệ sai sót tái bản DNA trong thực tế

10-10 - 10-11

• Qua các số liệu trên chứng minh có

nhiều cơ chế sửa chữa sai hỏng trên DNA trong và sau quá trình tái bản

• Tóm lại, quá trình tái bản, ở prokaryote và eukaryote, xảy ra rất an toàn để duy trì thông tin nguyên vẹn trong các phân tử DNA

• Phân tử DNA 2 sợi bổ sung: x2 thông tin; sợi bị

xáo trộn được sửa chữa nhờ sợi còn nguyên vẹn