Phân tích đánh gias chất lượng thực phẩm (7)

Xác định gene đích: • Chuyển vi khuẩn lên giấy lọc • Rửa giấy lọc với dung dịch làm biến tính DNA có ch a các probe đánh dấu phóng xạ • Tìm vết phóng xạ • So sánh với đĩa Petri ban đầu S

Trang 1

CH ƯƠNG VII

Quá trình chọn lọc tự nhiên

• Trao đổi vật liệu di truyền  tạo ra những tính trạng mong muốn  gia tăng sản l ợng cây trồng

• Tính trạng chỉ đ ợc tạo ra từ những dòng hữu thụ

• Không loại trừ đ ợc những tính trạng không mong muốn

Kỹ thuật tái tổ hợp DNA

• Giải quyết đ ợc những vấn đề trong

ch ơng trình tạo giống cổ điển

• Nhờ xác định và dòng hóa những gene

chuyên biệt cho tính trạng mong muốn

VD: tính trạng chịu rét, chịu mặn, kháng

thuốc diệt cỏ, chín chậm, …

Overview genetic engineering

• Mục đích thay đổi di truyền

• Nguồn, ch c năng và khả năng tiếp hợp bền vững c a gene chuyển

• Phân tích thành phần thực phẩm (hàm

l ợng dinh d ỡng, độc tố tích lũy,…)

• Cây trồng chuyển gene th ơng mại đầu

tiên: FLAVRSAVR tomato (Calgene

Inc )

• c chế gene tạo enzyme

polygalactu-ronase (PG) phân h y pectin nhờ

chuyển antisense gene

Dòng hóa gene đích

• Nguồn gene đích có thể là DNA nhiễm sắc thể hay cDNA từ mRNA

• Enzyme công cụ

• Vector tạo dòng

Trang 2

Các enzyme công cụ

• Restriction

enzymes

(Enzyme cắt

giới hạn)

• Ligase

(Enzyme nối)

Cho trình tự DNA:

3’…GGATCTAGAAATTGG…ATCTAGATT…5’

A) Xử lý DNA trên với enzyme giới hạn

BgIII (A/GATCT) Sẽ thu đ ợc mấy đoạn

DNA trong 2 tr ờng hợp DNA đã cho là

mạch thẳng và mạch vòng Vẽ các đoạn

DNA đ ợc phóng thích (nếu có)

B) Có thể xen đoạn DNA đ ợc phóng thích

vào vector đ ợc cắt bởi enzyme BamHI

(G/GATCC) hay không? Vẽ hình minh họa

Các vector tạo dòng

 Phage λ:

• DNA sợi đôi thẳng

• Kích th ớc: 48,5 kb

• Chèn DNA có kích th ớc 18-25 kb

Electron micrograph of bacterial phage from the host E coli

 Phage M13:

• DNA sợi đơn vòng

• Kích th ớc: 6,4 kb

• Nhiều dạng biến đổi c a M13 có mang

các polylinker (hay MCS)

 Plasmid:

• DNA vòng sợi kép, nằm ngoài NST VK

• Chèn DNA có kích th ớc 18-25 kb

pBR322

4361 bp pBR322

4361 bp

Trang 3

 Cosmid:

• Là vector plasmid ch a gene cos c a

phage λ Tái bản giống plasmid

• Chèn đ ợc đoạn DNA lớn (35-45 kb)

 Phagemid:

• Là sự kết hợp giữa phage M13 với plasmid

Tạo plasmid tái tổ hợp

Xây dựng DNA library

• Việc lựa chọn DNA hay cDNA phụ

thuộc vào tính trạng mong muốn

chuyên biệt và vào hệ ph ơng pháp

• Tập hợp những đoạn DNA hay cDNA

đ ợc gắn vào vector thích hợp

(plasmid hay phage)

• Chuyển vector vào vi khuẩn để nhân số

l ợng và chọn lọc  DNA library

Sàng lọc gene mục tiêu

1 Chọn lọc:

• Vector mang gene kháng kháng sinh

(tetracyclin, penicillin hay ampicillin)

• Chỉ có dòng nào ch a vector mới sống

đ ợc trên môi tr ờng chọn lọc có ch a

chất kháng sinh

2 Sàng lọc:

• Gene lacZ’ sản xuất β-galactosidase

th y giải X-gal tạo sản phẩm có màu xanh lam

• Nếu có DNA gắn xen vào lacZ’  mất khả năng th y phân X-gal  khuẩn lạc không có màu xanh

Trang 4

3 Xác định gene đích:

• Chuyển vi khuẩn lên giấy lọc

• Rửa giấy lọc với dung dịch làm biến tính DNA có ch a các probe đánh dấu phóng xạ

• Tìm vết phóng xạ

• So sánh với đĩa Petri ban đầu

Screening DNA library

Các ph ơng pháp

chuyển gene:

• Gián tiếp qua

Agrobacterium

• Trực tiếp: PEG,

xung điện, bắn

gene

Chuyển gene gián tiếp nhờ

Agrobacterium

• Agrobacterium sống lân cận hay ngay trên bộ rễ  xuyên qua các vết th ơng

 tổ ch c tế bào thực vật phát sinh

b ớu

Trang 5

Agrobacterium

• Tác nhân gây tạo b ớu là Plasmid Ti c a

vi khuẩn

Agrobacterium

• Gene tạo b ớu nằm trên đoạn T-DNA

• Sự di chuyển c a T-DNA vào tế bào thực vật chịu sự quy định c a gene vir

Agrobacterium

• Loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hoá opine

c a T-DNA và thay thế vào đó là các marker

chọn lọc Gen chuyển đ ợc xen vào giữa các

vùng bờ c a T-DNA

Agrobacterium

• Khi DNA vi khuẩn đ ợc hợp nhất với nhiễm sắc thể thực vật, nó sẽ tấn công vào hệ thống tổ ch c c a tế bào một cách có hiệu quả và sử dụng nó để đảm bảo cho sự sinh sôi c a quần thể vi khuẩn

Chuẩn bị Agrobacterium mang plasmid Ti ch a gene đích:

• Sàng lọc E.coli ch a gene đích

• Tiếp hợp giữa E.coli và Agrobacterium

• Tái tổ hợp t ơng đồng giữa 2 plasmid

Trang 6

Quy trình chuyển gene

• Chuẩn bị mô cấy và dịch huyền phù VK

• Ngâm chung mô với vi khuẩn

• Nuôi chung mô với vi khuẩn (2 ngày)

• Rửa mô bằng dung dịch kháng sinh

• Cấy chuyền mô sang môi tr ờng có tác

nhân chọn lọc

• Tái sinh cây chuyển gene

Một vài yếu tố ảnh h ởng

đến hiệu quả biến nạp

• Loại mô đ ợc biến nạp

• Giai đoạn phát triển c a mô

• M c độ khởi đầu c a vi khuẩn A

tumefaciens sử dụng

• Môi tr ờng để nuôi cấy mô sau khi biến nạp

• Marker đ ợc sử dụng để chọn lọc thể biến

nạp

• Loại vector sử dụng

• Kiểu gen c a thực vật

Agrobacterium

• Hệ thống chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium là có hiệu quả đối với một số loài nh ng không phải tất cả thực vật có thể

đ ợc biến nạp bằng con đ ờng này

• Ðặc biệt, lớp một lá mầm bao gồm các cây ngũ cốc chính trên thế giới nh lúa, lúa mì

và ngô là không đ ợc biến nạp dễ dàng nhờ

A tumefaciens

Các ph ơng pháp

chuyển gene:

Agrobacterium

gene

• Để DNA dễ xâm nhập đ ợc vào tế bào thực vật, phải loại bỏ vách tế bào tạo protoplast  Chuyển gene trực tiếp bằng cơ chế vật lý đơn giản, không cần

có vector

• Để nâng cao hiệu quả biến nạp, xử lý protoplast với PEG hoặc dùng xung điện

Trang 7

Chuyển gene bằng xung

điện

• Là một ph ơng pháp cơ học

• Màng tế bào không cho các phân tử

phân cực nh DNA tự do đi qua

• Kỹ thuật xung điện dựa trên trạng thái

t ơng đối yếu c a các t ơng tác kỵ n ớc

c a phospholipid kép và khả năng tập hợp lại một cách tự động c a nó sau khi bị rối loạn  Xung điện chớp nhoáng có thể gây rối loạn ở các vị trí c a màng một cách nhất thời, làm cho các phân tử phân cực

có thể đi qua nh ng sau đó màng có thể đóng kín lại nhanh chóng và tế bào không

bị ảnh h ởng gì cả

điện

• B1: Các tế bào ch và DNA ngoại lai

đ ợc tạo thành dịch huyền phù và cho

vào trong một cuvette nhựa có điện

cực

điện

• B2: Tạo xung điện bằng máy xung gene (gene pulser)

• CT1 đóng: tụ điện nạp điện

và tích một điện áp cao

• CT2 đóng: điện

áp phóng qua dịch huyền phù

tế bào

điện

• Xung điện cần thiết: 200 - 600 v/cm 2 (thay đổi tùy theo kích th ớc c a tế bào) trong vài phần triệu giây đến một phần ngàn giây

 tạo ra các lỗ tạm thời

• Các phân tử đã đ ợc nạp điện đi qua màng tế bào thông qua các lỗ bằng cách th c t ơng

tự nh điện di

Trang 8

u điểm

• Với một số cây một lá mầm quan trọng (loài lúa phụ Japonica, ngô, lúa mì) mà không thể thể thực hiện đ ợc bằng

ph ơng pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium thì ng ời ta đã thành công với ph ơng pháp này Hiệu quả biến nạp cao

• Ðoạn DNA ngoại lai đ ợc biến nạp có kích th ớc lớn

• Nếu các xung điện có c ờng độ và

chiều dài không đúng thì một số lỗ c a

tế bào sẽ trở nên quá lớn hoặc bị hỏng

không thể đóng lại sau khi tế bào

phóng điện, làm cho tế bào bị tổn

th ơng hoặc bị th ng

• Một hạn chế nữa là sự vận chuyển DNA ngoại lai vào và ra khỏi tế bào trong suốt thời gian điện biến nạp là t ơng đối không đặc hiệu Điều này dẫn đến kết quả là không cân bằng ion mà sau

đó sẽ làm rối loạn ch c năng c a tế bào và tế bào chết

• Phải tạo protoplast, tái sinh

protoplast không đơn giản, tốn nhiều

công s c, bị ảnh h ởng c a nhiều yếu

tố môi tr ờng

• PEG tạo ra các lỗ tạm thời trên màng

tế bào  giúp DNA thấm vào trong tế bào

• Tần số chuyển gene bằng ph ơng pháp này không cao

• PEG còn gây kết dính tế bào trần  ảnh h ởng đến tỉ lệ sống c a tế bào

Trang 9

Các ph ơng pháp

chuyển gene:

Agrobacterium

gene

Chuyển gene bằng súng

bắn gene

• Tên chính xác: hệ thống phân phối hạt biolistic (biolistic particle delivery system; biolistics = biology + ballistics)

• Là một thiết bị sử dụng để đ a thông tin di truyền vào tế bào, đ ợc thiết kế đầu tiên cho biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào thực vật

bắn gene

• Gồm 2 buồng bằng thép không gỉ nối

với 2 bơm chân không

bắn gene

• Nguyên lý chung c a ph ơng pháp này

là sử dụng áp lực xung c a khí helium

để gia tốc các hạt

• Ðạn sử dụng cho loại súng này là các hạt kim loại nặng cơ bản đ ợc bao bọc DNA

bắn gene

• DNA đ ợc gắn vào các hạt tungsten (vàng,

bạc) có đ ờng kính khoảng 1μm

• Các hạt này đ ợc đặt bên trên một cái đĩa ở

mặt bên trong c a súng

• Sự bùng nổ khí ở 1000psi làm cho đĩa bắn về

phía tr ớc

• Một tấm chắn làm dừng đĩa lại và các hạt

tungsten đ ợc phóng về các tế bào đích

Trang 10

bắn gene

• Mục tiêu c a súng bắn gene th ờng là

callus nuôi trên đĩa petri

• Khi hạt tungsten va chạm vào đĩa, gel

và callus bị phá h y nhiều nh ng cũng

có một số tế bào tiếp nhận hạt

tungsten đ ợc bao bọc DNA  DNA

xâm nhập và hợp nhất vào NST

u điểm

• Thao tác dễ dàng

• Có thể chuyển gene vào nhiều loại tế

bào, mô

• Các tế bào đ ợc biến nạp có tỉ lệ sống

sót cao

• Cho phép đ a các gene vào tế bào ở vị

trí mong muốn

Xác nhận gene chuyển (nhờ reporter gene)

• Gene mã hóa β-glucuronidase (GUS) phân giải X-glucuronide (X-gluc) là một reporter gene hữu hiệu

• Mô thực vật đ ợc chuyển gene có màu xanh

Trang 11

Ph ơng pháp phát hiện

• Khi gene đã đ ợc dòng hóa và chuyển

và tế bào ch , cần phải xác nhận xem gene lạ có đ ợc sát nhập vào NST vật

ch hay không

• Có thể sử dụng 2 ph ơng pháp Southern blot hay Northern blot

Ph ơng pháp Southern blot

• DNA đ ợc cắt bởi một hay vài

restriction enzyme  tạo ra các phân

đoạn DNA

• Tách các phân đoạn DNA nhờ điện di

trên gel agarose

• DNA trên gel đ ợc biến tính tạo mạch

đơn

• Chuyển lên màng nitrocellulose nhờ lực

mao dẫn

Ph ơng pháp Southern blot

• DNA đ ợc gắn lên màng là bản sao c a DNA trên gel

• Lai với probe có đánh dấu phóng xạ và

có trình tự bổ sung với DNA ngoại lai

• Loại bỏ probe không gắn lên màng

• Xác nhận sự hiện diện c a DNA ngoại lai trong cây đ ợc chuyển gene

Ph ơng pháp Northern blot

• T ơng tự nh Southern blot

• Sử dụng mRNA thay vì DNA

• mRNA mạch đơn  không cắt bằng

restriction enzyme

• Probe là các cDNA bổ sung với mRNA

c a gene đ ợc chèn

• Điểm bất lợi lớn nhất c a tất cả các

ph ơng pháp chuyển gene trực tiếp là các DNA ngoại lai có xu h ớng tái sắp xếp, tái tổ hợp dẫn tới hiện t ợng sát nhập nhiều đoạn DNA và tái sắp xếp các đoạn gene chuyển

• Những cụm gene này dễ dẫn đến hiện

t ợng tái tổ hợp nội tại  transgene silencing

 Sử dụng vật liệu chuyển gene trực tiếp là đoạn DNA thuần

Trang 12

Nghiên c u chuyển gene trên thế giới

• Chuyển gene chịu mặn từ các loài cây

Đ ớc (Rhizophoraceae) vào cây lúa

• Chuyển gene Bt vào nhiều loại cây trồng nh lúa, bông, ngô, đậu t ơng,…

• Chuyển các gene tham gia vào quá trình quang hợp c a cây C4 vào cây C3

để tăng hiệu suất quang hợp

• Chuyển gene cố định đạm (nif gene) vào cây lúa

Nghiên c u chuyển gene

trên thế giới

• Chuyển gene kháng thuốc diệt cỏ vào

cây lúa

• Chuyển gene chín chậm (ripening delay

gene) vào cây cà chua

• Chuyển gene mang nhiều đặc tính chữa

bệnh và có tác dụng làm d ợc phẩm:

gene tổng hợp insulin, gene tổng hợp

vitamin A,…

 Tăng năng suất cây trồng, tăng chất

l ợng sản phẩm, không gây ô nhiễm môi

tr ờng

Một số nghiên c u chuyển gene ở Việt Nam

Chuyển gene kháng sâu đục

thân vào cây lúa

Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễ n Văn Uyển, Karabi Datta,

Swapan Kumar Datta (Viện sinh học nhiệ t đới,

Viện lúa Quốc tế)

• Vật liệu: giống lúa Nàng H ơng Chợ Đào

• Môi tr ờng nuôi cấy mô lúa: MS có bổ sung 2,4-D (tạo mô sẹo) hoặc NAA, Kinetin (tái sinh cây)

• Ch ng VK Agrobacterium tumerfasiens:

LBA4404 mang plasmid pBIN-BAR-UBI-IB-AB mang gene Bt tổng hợp giữa cryIA và cryIB, gene Bar

Trang 13

• Chuẩn bị dịch vi khuẩn: duy trì vi khuẩn

trên môi tr ờng thạch LB có ch a 50

mg/l Kanamycin và 50 mg/l Rifampicin

Tăng sinh trên môi tr ờng AB lỏng lắc

có chất kháng sinh tr ớc khi gây nhiễm

cho tế bào lúa

• Chuẩn bị vật liệu chuyển gene: hạt lúa đã

khử trùng đ ợc nuôi cấy trên môi

tr ờng MS có bổ sung 2 mg/l 2,4-D 

mô sẹo có khả năng phát sinh phôi

• Gây nhiễm: mô sẹo có khả năng phát sinh phôi đ ợc gây nhiễm với dịch vi khuẩn (OD=2) có ch a Acetosyringone

• Chọn lọc: cụm mô đ ợc rửa lại bằng n ớc cất vô trùng có bổ sung 500 mg/l Cefotaxime  Nuôi cấy trên môi

tr ờng chọn lọc có Phosphinothricin (3 mg/l)  Cấy chuyền mô kháng PPT sang môi tr ờng chọn lọc từ 3-4 lần

• Tái sinh cây: môi tr ờng MS có bổ sung

0,2 mg/l NAA, 2 mg/l Kinetin, 500 mg/l

Cefotaxim, có hoặc không có PPT

• Phân tích PCR: dùng mồi đặc hiệu cho

gene bar, sau đó chạy điện di trên gel

agarose

• Thử nghiệm enzyme Phosphinothricin

Acetyltransferase (PAT): sử dụng đồng

vị phóng xạ [1-14C] Acetyl-coenzymA

• Trắc nghiệm nhanh ELISA: phát hiện

protein cryIAb/cryIAc

• Tái sinh cây: môi tr ờng MS có bổ sung 0,2 mg/l NAA, 2 mg/l Kinetin, 500 mg/l Cefotaxim, có hoặc không có PPT

• Phân tích PCR: dùng mồi đặc hiệu cho gene bar, sau đó chạy điện di trên gel agarose

• Thử nghiệm enzyme Phosphinothricin Acetyltransferase (PAT): sử dụng đồng

vị phóng xạ [1-14C] Acetyl-coenzymA

• Trắc nghiệm nhanh ELISA: phát hiện protein cryIAb/cryIAc

• Thí nghiệm Southern blot: sử dụng

enzyme giới hạn Hind III đối với gen

cryIA(b)-cryIB, enzyme Sma I đối với

gen bar

• Thử tính kháng thuốc diệt cỏ th ơng

mại Basta: theo dõi hiện t ợng cháy lá

• Thử tính kháng sâu: Cắt đốt thân (8 cm)

cho vào đĩa petri, đặt 6 con sâu đục

thân lên đoạn thân  tính tỉ lệ số sâu

chết + số sâu thất lạc / tổng số sâu cho

vào đĩa

Tiêu đề	Phân tích đánh giá chất lượng thực phẩm (7)
Trường học	Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội
Chuyên ngành	Khoa học Thực phẩm
Thể loại	Nghiên cứu khoa học
Năm xuất bản	2011
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	13
Dung lượng	1,08 MB