Bài thực hành 2: PROTEIN doc

Đây là phản trưng của peptide CO-NH- Trong môi trường kiềm, các hợp chất có chứa từ hai liên kết peptide trở lên có thể phản ứng với CuSO4 tạo thành phức chất màu xanh tím, tím, tím đỏ h

Bài thực hành 2: PROTEIN Tên thí

nghiệm

Thí

nghiệm 1:

Phản ứng

Biure đặc

trưng cho

liên kết

peptit.

Đây là phản

trưng của

peptide

(CO-NH-)

Trong môi

trường kiềm,

các hợp chất

có chứa từ

hai liên kết

peptide trở

lên có thể

phản ứng với

CuSO4 tạo

thành phức

chất màu

xanh tím,

tím, tím đỏ

hay đỏ

Cường độ

màu thay đổi

tùy thuộc

vào độ dài

mạch

peptide

Phản ứng này

thường được

ứng dụng để

định lượng

protein

Ống nghiệm 1 (phản ứng

với biure): cho vào ống nghiệm khô một ít tinh thể ure, đun trên ngọn lửa đèn cồn Lúc đầu ure nóng chảy, đến khi bắt đầu cứng lại thì ngừng đun Quá trình này tạo ra Biure, acide cianuric và amoniac Để nguội, thêm vào 1-2ml dung dịch NaOH 10% Lắc đều cẩn thận, thêm từng giọt dung dịch CuSO4 1% sẽ tạo thành dung dịch, lắc

kĩ và quan sát màu (chú

ý không cho quá nhiều CuSO4 vì màu xanh của Cu(OH)2 được tạo thành

có thể lấn át màu phản ứng)

Ống nghiệm 2 (phản ứng

với protein): cho vào ống nghiệm 1ml lòng trắng trứng gà 1%, thêm vào 1-2ml dung dịch NaOH 10% Lắc đều cẩn thận, thêm từng giọt dung dịch CuSO4 1% sẽ tạo thành dung dịch, lắc kĩ và quan sát màu

ống nghiệm 1: dung dịch chuyển từ không màu sang màu tím hồng ống nghiệm 2: dung dịch chuyển từ không màu sang màu tím nâu

 Cấu trúc urê, biuret và peptide

- Thuốc thử của phản ứng màu biure là dung dịch NaOH và CuSO4, đôi khi

nó còn được gọi là tác chất biure

 Tuy nhiên chữ biure ở đây không phải là thuốc thử có chứa biure mà là

vì cả biure và protein đều cho phản ứng màu giống nhau với NaOH và CuSO4, Cường độ màu thay đổi tùy thuộc vào độ dài mạch peptide

 Phản ứng so màu Biure, liên kết peptide với Cu2+ trong MT kiềm, là phản ứng đặc trưng để nhận biết protein

Phương trình phản ứng :

Trong lòng trắng trứng gà có anbumin là protein (polypeptit cao phân tử) có liên kết peptide -CO-NH- như trong biure nên cũng cho phản ứng biure tạo phức hợp muối Cu2+ với anbumin có màu tím nâu

nghiệm 2:

Phản ứng

kết tủa

thận ngịch

bằng mối

(NH4)2SO4.

Protein có

thể bị kết tủa

bởi muối

trung tính là

(NH4)2SO4

hoặc là NaCl

bão hòa Đây

là phản ứng

kết tủa thuận

nghịch không

làm mất hoạt

tính sinh học

của protein

nên thường

dụng để tách

chiết

enzyme

Cho vào ống nghiệm 5ml lòng trắng trứng gà, thêm 5ml muối(NH4)2SO4 cho đến khi bão hòa, lắc đều, thấy xuất hiện kết tủa globulin để 5 phút, lọc bỏ kết tủa (thấm ướt giấy lọc bằng dung dịch (NH4)2SO4) vào một ống nghiệm khác

Cho vào dịch lọc 3g tinh thể (NH4)2SO4 (nếu dịch lọc là 4ml) cho đến khi dung dịch bão hòa, lắc, albumin kết tủa, lọc, thu kết tủa

Cho riêng kết tủa globulin

và albumin vào 2 ống nghiệm tương ứng, thêm vào 2 ống từ 2-3ml nước cất, lắc đều, so sánh sự hòa tan kết tủa

Khi cho dd (NH4)2SO4 bảo hòa vào protein trứng thấy xuất hiện kết tủa trắng

Khi lọc, kết tủa trắng bị giữ lại (chính là globulin) Dung dịch nước lọc khi cho tinh thể (NH4)2SO4 vào có hiện tượng kết tủa trở lại (chính là albumin)

Ống chứa kết tủa globulin,sau khi cho nước cất vào thì kết tủa

tan từ từ trong nước

cất

Ống chứa kết tủa albumin,sau khi cho nước cất vào thì kết tủa

tan ngay trong nước cất.

Trong protein trứng có cả albumin và globulin Đây là những protein mang tính axit yếu Ở điều kiện bình thường, trong trạng thái dung dịch, phân tử P tích điện -, bên ngoài được bao bởi một lớp áo nước với đầu + quay vào và đầu – quay ra, nên lơ lững trong môi trường

Khi cho các muối (NH4)2SO4 có nồng độ cao vào, thì muối sẽ tạo các ion NH4 và SO42- Các ion này sẽ trung hòa các tiểu phân tử protein trứng đồng thời lấy lớp

áo nước bên ngoài tạo ra hiện tượng tủa

Sở dĩ globulin tạo kết tủa trước vì nó có trọng lượng phân tử lớn, lớp áo nước bên ngoài lớn nên tạo các ion NH4 và SO42- dễ và nhanh dẫn đến sự trung hòa điện gây ra tủa

Khi lọc, ta được dung dịch bán bảo hòa albumin Nên khi cho tinh thể (NH4)2SO4 vào tức làm cho dung dịch lọc ở trạng thái bảo hòa, lúc này albumin

có hiện tượng kết tủa.

Khi cho nước cất vào cả 2 ống nghiệm thì nước loại bỏ các yếu tố gây kết tủa Globunlin vẫn ở dạng kết tủa,đó là do Globulin đã bị biến tính,không quay về trạng thái dung dịch keo ngay được (hiện tượng kết tủa không thuận nghịch)

Albumin sau khi được loại bỏ các yếu tố gây kết tủa thì trở về trạng thái dung dịch keo như ban đầu, kết tủa tan hoàn toàn (hiện tượng kết tủa thuận nghịch)

So với albumin, globulin có độ tan kém hơn nên kết tủa trước, khi hòa tan sẽ tan chậm hơn

nghiệm 3:

phản ứng

kết tủa

bằng dung

môi hữu

cơ.

Trong môi

trường trung

tính hoặc

acid, protein

sẽ bị kết tủa

bởi các dung

môi hữu cơ

như acetone,

ethanol, eter

Cho vào ống nghiệm 2ml dung dịch lòng trắng trứng gà, thêm từng giọt 2ml cồn, lắc mạnh, để yên sẽ xuất hiện kết tủa

gạn bỏ phần nước trong thêm nước cất vào kết tủa ghi nhận hiện tượng, giải thích

Khi cho nước cất vào kết tủa thu được thì kết tủa tan

Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong

số đó là hằng số điện môi của dung dịch Nhìn chung, những phân tử dung môi

có hằng số điện môi lớn (như nước, dimethylsulphoxid) có thể ổn định tương tác giữa chúng với các phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của protein trong dung dịch Ngược lại, các dung môi với hằng số điện môi nhỏ (aceton, ethanol…) ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein trong môi trường Do đó, độ hòa tan của những phân tử protein giảm và xảy ra kết tủa do sự làm giảm hằng số điện môi hiện hữu của môi trường Điều này có được bằng cách thêm một dung môi hòa tan trong nước như aceton vào dung dịch chứa protein

Bài thực hành 3: GLUXIT Tên thí

nghiệm

Thí nghiệm

1: tính khử

của đường

monosachar

ide (phản

thuốc thử

Fehling )

Thuốc thử Fehling là dung dịch CuSO4 với dung dịch NaOH, hình thànhCu(OH)2

Khi đun nóng sẽ tạo thành Cu(OH)2 có màu đen

Cu(OH)2 CuO + H2O Tuy nhiên khi có mặt hợp chất khử (như glucose) sẽ xuất hiện Cu2O kết tủa màu

đỏ nâu

Cu(OH)2 + Glucose Cu2O + Gluconic + H2O

Cho vào một ống nghiệm sạch 1ml dung dịch glucose 1%, thêm vào ống nghiệm 1ml

Fehling, lắc đều, đun cách thủy 5 phút, quan sát thấy kết tủa đỏ nâu của Cu2O

Có kết tủa đỏ nâu (Cu2O) xuất hiện dưới đáy ống nghiệm

Glucozo là hợp chất hữu cơ tạp chức có cấu tạo của rượu đa chức và andehit đơn chức, có CTHH như sau:

Trong môi trường kiềm, đun nóng,Glucozo là monosaccarit thể hiện tính khử Khử

Cu2+ thành Cu+, chức anđêhit bị oxi hóa thành axit hoặc muối tương ứng (Tính

Khi tác dụng với glu (HO–CH2–(CHOH)4–CH=O, có chứa gốc andehyte) hoặc các chất chứa gốc andehyte, thuốc thử này ( thuốc thử Fehling, muối tactrat

có vai trò tạo phức với Cu2+ tạo ion phức [Cu(C4H4O6)2]2–(khiến Fehling có màu xanh lơ) nhằm ngăn cản sự tạo thành kết tủa Cu(OH)2 trong thuốc thử) tạo kết

tủa Cu2O đỏ Phản ứng xảy ra khi đun nóng:

2Na2[Cu(C4H4O6)2] + NaOH + R–CHO + H2O

→ Cu2O + R–COONa + 2H2C4H4O6 + 2Na2C4H4O6 Kết tủa đỏ gạch đọng dưới đáy ống nghiệm chính là kết tủa Cu2O được tạo thành

Thí nghiệm

2: khảo sát

tính khử của

Disaccharide

Lấy 1 ống nghiệm sạch cho vào mỗi ống

sacharose 1%, thêm vào 1ml

Fehling, lắc đều, đun cách thủy 5 phút Quan sát hiện tượng và giải thích

Lấy một ống nghiệm khác cho vào 1ml

saccharose 1%, thêm vài giọt HCl đậm đặc, đun cách thủy trong vài phút

Thêm vào vài giọt NaOH 10N cho đến khi giấy quỳ có màu xanh, thêm 2ml

Ống nghiệm đầu tiên: không có hiện tượng gì, dung dịch vẫn giữ nguyên màu của

fehling

Ống nghiệm 2:

dung dịch xuất hiện kết tủa màu nâu đỏ dưới đáy ống nghiệm

Ống nghiệm 1: Phân tử saccarozơ hợp bởi phân tử alpha glucozơ và beta -fructozơ có CTCT là:

Liên kết glucozit tạo bởi hai nhóm –OH hemiaxetan loại đi một phân tử H2O. Nhóm –OH hemiaxetal tự do không còn nên saccarozơ không thể mở vòng tạo nhóm – CHO Do đó, Saccarozo không chuyển về dạng anđehhit được, nên Saccarozo không có tính khử, không khử được Cu2+ trong dung dịch Fehling Không có phản ứng xảy ra nên ko có hiện tượng gì

Ống nghiệm 2: Đun nóng dung dịch saccarozơ có mặt axit vô cơ HCl làm chất xúc tác Trong môi trường axit,Saccarozơ bị thủy phân thành glucozơ và fructozơ

Fehling, đun

cách thủy 5

phút Quan sát

hiện tượng và

giải thích

Dung dịch trong ống nghiệm bây giờ gồm glucozo và fructozo Sau khi thêm NaOH 10N, giấy quỳ có màu xanh chứng tỏ môi trường đã chuyển thành môi trường kiềm

Khi cho thêm thuốc thử fehling vào và đun nóng, glocozo phản ứng tạo kết tủa đỏ gạch như ở thí nghiệm 1

Fructozơ có tính chất của poliol và của OH – hemiaxetal tương tự glucozơ

song ko có nhóm –CHO nên không phản ứng với Cu(OH)2 trong môi trường

kiềm đun nóng

Trong môi trường trung tính hoặc axit, fructozơ không thể hiện tính khử của anđehit, nhưng trong môi trường kiềm, fructozơ lại có tính chất này, cũng phản ứng tạo kết tủa Cu2O đỏ gạch như ở thí nghiệm 1 do có sự chuyển hóa giữa glucozơ và fructozơ qua trung gian là một enđiol

Kết tủa đỏ gạch đọng dưới đáy ống nghiệm 2 chính là kết tủa Cu2O được tạo thành

Thí nghiệm

3: khảo sát

tính chất

của

polisacchari

de

Lấy 2 ống nghiệm sạch, cho vào ống thứ nhất 1ml hồ tinh bột 1%, ống thứ

2 một ít bông thấm nước cho vào mỗi ống 1ml HCl đậm đặc, đun cách thủy 5 phút, trung hòa bằng vài giọt NaOH 10N cho đến khi giấy quỳ

có màu xanh, thêm 3ml thuốc thử Fehling, đun cách thủy 5 phút, quan sát hiện tượng và giải thích

Ống nghiệm 1:

xuất hiện kết tủa màu đỏ gạch ở dưới đáy ống nghiệm

Ống nghiệm 2:

xuất hiện kết tủa màu đỏ gạch bám xung quanh bông

Tinh bột là hỗn hợp của hai loại polisaccarit : amilozơ và amilopectin

Phân tử amilozơ : Các gốc α – glucozơ liên kết với nhau bằng liên kết α – 1,4 –

glicozit tạo thành mạch không phân nhánh

Phân tử amilopectin : Các gốc α – glucozơ liên kết với nhau bằng 2 loại liên

kết:

+ Liên kết α – 1,4 – glicozit để tạo thành một chuỗi dài (20 – 30 mắt xích α – glucozơ)

+ Liên kết α – 1,6 – glicozit để tạo nhánh Xenlulozơ là một polime hợp thành từ các mắt xích β – glucozơ bởi các liên kết β – 1,4 – glicozit

Tinh bột thuộc loại polime nên không có hai tính chất sau: hòa tan Cu(OH) 2 (dù có nhiều nhóm –OH liền kề) và tính khử của anđehit (dù tận cùng phân tử vẫn có nhóm OH –hemiaxetal) Các nhóm – OH trong tinh bột có khả

Xenlulozơ thuộc loại polime nên không có hai tính chất sau: hòa tan

Cu(OH)2 (dù có nhiều nhóm –OH liền kề) và tính khử của anđehit (dù tận cùng phân tử vẫn có nhóm OH –hemiaxetal) Phản ứng thủy phân:

(C6H10O5)n + nH2O nC6H12O6

CuSO4 + NaOH => Cu(OH)2

Tinh bột và xenlulozo đều bị thủy phân trong môi trường axit tạo thành d-glucozo, d-glucozo tác dụng với CuSO4 tạo kết tủa màu nâu đỏ chính là Cu2O Tác dụng với Cu(OH)2 trong môi trường kiềm sinh ra kết tủa đỏ gạch:

CH2OH[CHOH]4CHO + 2CU(OH)2 +NaOH t CH2OH[CHOH]4COONa + Cu2O + 2H2O

Do glucozo có tính khử nên khi đun với dung dịch thuốc thử fehling thì kết tủa

đỏ của Cu2Ohình thành (do đường đã khử Cu(OH)2 có trong fehling thành CuO2 có màu nâu đỏ.)

Bài thực hành 4: ENZYME

Thí nghiệm 1:

ảnh hưởng

của nhiệt độ

đến hoạt độ

của enzyme

amilaza

Phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở 40-500C, ngoài giới hạn nhiệt độ này hoạt

độ enzyme thường

bị giảm

Chuận bị 3 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 2ml tinh bột 1% Đặt ống 1 vào nồi cách thủy đang sôi, ống 2 vào tủ ấm

370C ống 3 vào tủ lạnh

Sau 15 phút khi các dung dịch đã đạt nhiệt

độ cần thiết, thêm vaos mỗi ống 0.5 ml dung dịch enzyme và tiếp tục giữ nhiệt độ tương ứng

Lấy từ mỗi ống nghiệm 2-3 giọt nhỏ lên dĩa peptri ở các vị trí tương

ống nghiệm 1 và 3 khi nhỏ luigon vào dung dịch chuyển qua màu xanh tím

ống nghiệm 2 dung dịch có

ống nghiểm 1 do để enzyme trong môi trường nhiệt độ quá cao, vượt quá giới hạn nhiệt độ của enzym làm enzyme bị biến tính mất hoàn toàn hoạt tính xúc tác nên không còn khả năng xúc tác ống nghiệm 3 để enzyme trong môi trường nhiệt đọ quá thấp so với giới hạn nhiệt độ của enzyme nên làm ức chế hoạt độ của enzyme

Vì vậy ở ống nghiệm 1 và 3 enzyme amilase không có khả năng phân giải tinh bột thành các dạng đường đơn giản hơn nên khi cho liugon vào thì các phân tử liugon kết hợp với tinh bột tạo thành màu xanh đen

ống nghiệm 2 đặt enzyme trong môi trường nhiệt độ hoạt động thích hợp của enzyme nên enzyme phân giải tinh bột thành các đường đơn giản nên trong dung dịch không còn tinh bột nữa vì

ứng 1 2 3 để cho đạt nhiệt độ phòng rồi thêm

1 giọt thuốc thử liugon, quan sát và giải thích sự khác nhau giữa các mẫu

màu của luigon vậy khi cho liugon vào ống nghiệm 2 thì dung dịch hoàn toàn có

màu liugon

Thí nghiệm 2:

ảnh hưởng

của chất kích

thích, chất kìm

hãm đối với

hoạt động của

enzyme

Mỗi enzyme có chất kích thích, chất kìm hãm khác nhau Đối với enzyme amilaza chất kích thích là ion Cl- và chất kìm hãm là ion Cu2+

Chuẩn bị 3 ống nghiệm, cho vào ống 1: 1ml nước cất, ống 2: 0.7ml nước cất + 0.3 ml NaCl 1%, ống 3: 0.7ml nước cất + 0.3 ml CuSO4 Cho vào mỗi ống 1ml dung dịch enzyme + 1ml dung dịch tinh bột 1% đặt cả 3 ống nghiệm vào tủ ấm 400 Sau 5 phút cho vào mỗi ống 3 giọt thuốc thử liugon, lắc đều quan sát

và giải thích

ống nghiệm 1: dung dịch có màu liugon nhạt

ống nghiệm 2: dung dịch có màu liugon

ống nghiệm 3: dung dịch có màu xanh tím đặc trưng

ống nghiệm 1: Trong ống nghiệm không có chất kích thích cũng như chất kìm hãm nên khi cho enzyme vào dung dịch tinh bột thì enzyme sẽ thủy phân tinh bột thành các đường đơn giản.sau khi thuốc thử liugon vào ống nghiệm …

ống nghiệm 2: vì ion Cl- là chất kích thích đối với enzyme amilaza nên khi cho enzyme amilaza vào dung dịch tinh bột, enzyme này

sẽ thủy phân tinh bột thành các đường đơn giản một cách nhanh chóng khi cho thuốc thử liugon vào ống nghiệm thì ống nghiệm

sẽ có màu của liugon

ống nghiệm 3: vì ion Cu2+ là chất kìm hãm đối với enzyme amilaza nên khi cho enzyme amilaza vào dung dịch tinh bột, enzyme này

sẽ bị kìm hãm, phản ứng thủy phân tinh bột thành các đường đơn giản bị ức chế Vì vậy khi cho liugon vào ống nghiệm thì trong ống nghiệm vẫn còn tinh bột, iot trong thuốc thử liugon sẽ tác dụng với tinh bột tạo thành dung dịch có màu xanh tím đặc trưng

Thí nghiệm 3:

tính đặc hiệu

của ureaz

Chuẩn bị 2 ống nghiệm cho vào mỗi ống 2ml dung dịch ure 2% ống 1 cho thêm một ít bột đậu tương, ống 2 không cho

gì, thêm vào mỗi ống 5 giọt phenolphthalein quan sát và giải thích

ống nghiệm 1: dung dịch chuyển sang màu hồng

ống nghiệm 2: không có hiện

Urease được xem là có tính đặc hiệu tuyệt đối: chỉ tác dụng lên urea, ngoài ra hầu như không tác dụng lên các hợp chất khác

Do tính đặc hiệu của urease chỉ xúc tác cho phản ứng thủy phân urea nên ở ống A có xảy ra phản ứng tạo NH3, làm dung dịch phenolphtalein chuyển sang màu hồng, còn ống B không xảy ra phản ứng

Trong bột đậu tương có chứa enzyme ureaz, nên khi cho bột đậu tương vào dung dịch ure thì enzyme ureaz sẽ xúc tác cho phản ứng giữa ure với nước tạo CO2 và NH3