Tổng quan về Bacillus thuringiensis var.israelensis

Luận Văn: Tổng quan về Bacillus thuringiensis var.israelensis

Mở Đầu Một trong những tác nhân truyền nhũng bệnh hiểm nghèo cho ngời nh sốt rét, sốt xuất huyết, viêm não Nhật Bản… là do muỗi gây ra Muỗi sinh tr là do muỗi gây ra Muỗi sinh trởng và phát triển rất tốt ở những vùng có điều kiện thuận lợi cho nhiều loài côn trùng phát triển nh những vùng nhiệt đới trong đó có Việt Nam Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) thì hàng năm, trên Việt Nam thế giới có tới hàng triệu trờng hợp mắc các bệnh do muỗi truyền Riêng ở Việt Nam , theo thống kê 6 tháng đầu năm 2001vẫn còn 126.000 ca sốt rét, 8.700 ca sốt xuất huyết, trong đó 20-25% ca tử vong và 60-70% để lại di chứng Các bệnh hiểm nghèo do muỗi truyền đã có mặt ở hầu hết các tỉnh thành trong cả nớc làm ảnh hởng đến tình hình kinh tế xã hội Bên cạnh đó, sự tiềm ẩn nguy cơ bùng nổ thành dịch do hiện tợng kháng thuốc của côn trùng làm cho các nhà quản lý phải có những nỗ lực

để thanh toán các bệnh trên Sở dĩ có những nguy cơ đó là do một thời gian khá dài từ trớc những năm đầu của thập kỉ 80, chúng ta đã sử dụng thờng xuyên các hoá chất độc thuộc nhóm lân hữu cơ, các chất thuộc nhóm Pyrethroid để tẩm nhuộm màn Điều này không những phá vỡ cân bằng sinh thái, gây hiện tợng bùng nổ côn trùng do kháng thuốc mà còn ảnh hởng tới sức khoẻ con ngời

Loài phụ Bacillus thuringiensis var.israelensis (Bti) đợc phát hiện vào năm

76 tại Israel có khả năng diệt muỗi đã mở ra một triển vọng mới cho việc kiểm soát các vectơ truyền bệnh hiểm nghèo cho ngời Nhiều chế phẩm sinh học diệt muỗi từ Bacillus thuringiensis var.israelensis đã đợc sản xuất và ứng dụng thành công nh Bactimos (Bỉ), Skeetan (Anh), Vectobac (Mỹ)… là do muỗi gây ra Muỗi sinh tr Theo tổ chức Y tế thế giới thì việc sử dụng chế phẩm sinh học diệt muỗi từ các chủng Bacillus thuringiensis var.israelensis là một biện pháp rất an toàn và hiệu quả

ở nớc ta, việc nghiên cứu về Bacillus thuringiensis var.israelensis mới chỉ bắt đầu từ một vài năm gần đây nhng cũng đã thu đợc những kết quả đáng kể Nhiều chủng Bacillus thuringiensis var.israelensis có hoạt lực cao đã đợc phân lập, một vài dòng gen đã đợc nghiên cứu tách dòng, đọc trình tự và biểu hiện Chúng ta cũng đã bớc đầu thử nghiệm thành công chế phẩm trong phạm vi phòng thí nghiệm Tuy nhiên việc sản xuất và ứng dụng chế phẩm diệt muỗi từ Bacillus thuringiensis var.israelensis cần phải đợc nghiên cứu thêm nữa

Phần I:Tổng quan về Bacillus thuringiensis

1.1 Tóm tắt về lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bacillus thuringiensis

Lịch sử về Bacillus thuringiensis bắt đầu từ khi Loius Pasteur phát hiện thấy một loài vi khuẩn có khả năng gây bệnh cho tằm ông đặt tên là Bacillus bombyces Năm 1901, Ishiwata phân lập ra một loại vi khuẩn từ ấu trùng tằmbị bệnh và đặt tên là Bacillus sotto, năm 1911, Berliner đã phân lập đợc một loại vi khuẩn tơng tự từ xác ấu trùng bớm ĐịaTrung Hải Đến năm 1915, vi khuẩn này chính thức mang tên Bacillus thuringiensis

Năm 1928, Huszddax phân lập chủng B.thuringiensis (Bt ) từ Ephestia, thử nghiệm nó trên sâu đục thân ngô ở Châu Âu, đây đợc coi là ứng dụng đầu tiên của Bacillus thuringiensis Chế phẩm thơng mại đầu tiên , Sporeine, đợc sản xuất

ở Pháp năm 1938 Năm 1951-1956 Steinhaus nghiên cứu khả năng diệt côn trùng của Bacillus thuringiensis và đã sản xuất ở Mỹ Trong suốt những năm 1960, nhiều chế phẩm thơng mại của Bt đã đợc sản xuất ở nhièu quy mô khác nhau tại

Mỹ, Pháp, Đức.Sau đó Howard Dulmage và Clayton Beesle của viện nghiên cứu Nông Nghiệp USDA đã thu thập đợc bộ su tầm đầu tiên về các chủng Bt Năm

1970, Dulmage đã phân lập đợc chủng HD-1 và cho đến nay nó vẫn đợc sử dụng cho nhiều nghiên cứu và trong chế phẩm Bt

Thập niên 80, nhiều công ty sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh đã đăng ký sản xuất và kinh doanh các chế phẩm BT Đầu những năm 90 tại một số quốc gia nh Cuba, Trung Quốc, Mỹ đẫ sản xuất chế phẩm BT ở quy mô công nghiệp Ngày nay một số lợng lớn thơng phẩm trừ sâu sinh học BT đợc sử dụng trong việc kiểm soát ấu trùng bộ cánh vẩy, hai cánh và cánh cứng… là do muỗi gây ra Muỗi sinh tr

1.2 Sự phân bố của B.thuringiensis

Bacillus thuringiensis tồn tại ở khắp mọi nơi trong đất và trên bề mặt lá, ở

đất rừng, thảo nguyên, sa mạc hay ở môi trờng có điều kiện thuận lợi cho sâu bọ phát triển nh bụi hạt từ các nhà máy xay lúa mì, trong các kho bảo quản ngũ cốc… là do muỗi gây ra Muỗi sinh trSự phân bố của Bt là không liên quan đến sự phân bố của côn trùng đích Tuy nhiên ,Bt thờng có xu hớng tồn tại nhiều trong môi tròng có nhiều sâu bọ phát triển và giàu dinh dỡng.Có thể phân lập Bt từ nhiều loại môi trờng khác nhau Bt dễ dàng phát triển trong môi trờng thí nghiệm chỉ với một lợng tối thiểu chất dinh dỡng Mặc dù bào tử Bt tồn tại trong nhiều năm, nhng chúng không nảy mầm và nhân lên nh các tế bào sinh dỡng trong đất tự nhiên Điều này chứng

tỏ rằng Bt không thích nghi với môi trờng đất

1.3 Đặc điểm sinh thái của B.thuringiensis

B.thuringiensis là thành viên của nhóm I, chi Bacillus Đây là loại vi khuẩn sinh bào tử, Gram dơng, hô hấp hiếu khí hoặc hiếu khí không bắt buộc Tế bào

có kích thớc 3x6 m, có phủ tiêm mao không dày, có khả năng chuyển động , tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi

Là một loài thuộc chi Bacillus nên khi gặp điều kiện không thuận lợi nh thiếu dinh dỡng, nhiệt độ cao, khô hạn… là do muỗi gây ra Muỗi sinh trBt có khả năng sinh nội bào tử giúp cho chúng chống chịu với điều kiện khắc nghiệt đó Bào tử của vi khuẩn có dạng hình trứng với kích thớc 1,5x2 m và có thể nảy mầm thành tế bào sinh dỡng khi có điều kiện thuận lợi

Sự hình thành bào tử diễn ra đồng thời với sự tạo thành protein tinh thể có khả năng diệt côn trùng Tinh thể có nhiều hình dạng khác nhau ( hình vuông, chữ nhật, hình tháp, hình ôvan hoặc vô định hình ) Khi tế bào phân giải tinh thể

và bào tử đợc giải phóng ra ngoài Tinh thể có kích thớc khoảng 0,6x0,2  m, và

có thể chiếm tới 30% trọng lợng khô của tế bào Tinh thể này đợc gọi là thể vùi Tinh thể và bào tử có thể quan sát dới kính hiển vi đối pha ở vật kính đầu Tinh thể bắt màu sẫm còn bào tử không bắt màu nhng có mép sáng Hình dạng của tinh thể đợc quyết định bởi gen mã hoá cho tổng hợp protein của tinh thể nằm trên plasmid

1.4 Đặc điểm sinh hoá của B.thuringiensis

Nói chung B.thuringiensis không lên men sinh axít đối với arabinoza, xiloza, và manitol,khử nitơrat thanh nitơrit, có phản ứng với lòng đỏ trứng gà, phát triển đợc trong môi trờng thạch kị khí có chứa 1% lizozym Sinh trởng tốt nhất ở nhiệt độ 28-30 0C, pH 6,8-7,2

1.5.Phân loại B.thuringiensis

Bt đợc chia làm nhiều loại phụ dựa trên các đặc điểm sau:

+ Khả năng hình thành enzym leucitinase

+ Cấu trúc tinh thể và khả năng gây bệnh cho côn trùng

+ Đặc tính huyết thanh học

+ Phản ứng ngng kết của các tế bào sinh dỡng với các huyết thanh tơng ứng

Cho đến nay phơng pháp phân loại Bt đợc sử dụng khá phổ biến là dựa trên các đặc tính huyết thanh học Đặc tính huyết thanh học của chủng Bt

đ-ợc xác định chủ yếu dựa trên kháng nguyên tiên mao H và đđ-ợc tiến hành bằng phản ứng ngng kết các tế bào sinh dỡng với các kháng huyết thanh tơng ứng

Tuy nhiên việc phân loại chỉ dựa trên typ huyết thanh vẫn cha phản ánh đợc mối liên hệ giữa chủng giống và hoạt lực diệt côn trùng Viẹc phân lập và tuyển chọn các chủng Bt có giá trị vẫn gặp khó khăn Chính vì vậy, gần đây một số nhà khoa học đã đề nghị đa ra phơng pháp phân loại mới dựa trên kết quả xác định typ huyết thanh, hình dạng tinh thể, hoạt lực diệt côn trùng, gen Cry và thành phần protein tinh thể, hình dạng tinh thể và hoạt lực diệt côn trùng

Bảng 1: Quan hệ giữa các lớp Cry, hình dạng tinh thể, thành phần protein và hoạt

lực diệt côn trùng

Lớp gen Thành phần

Protein (KDa)

Hình dạng tinh thể

Typ huyết thanh

Hoạt lực diệt côn trùng Cry1A

Cry1B

Cry1C

Cry1D

Cry1E

131 138 135 133 133

Tháp đôi Tháp đôi Tháp đôi Tháp đôi Tháp đôi

1 3 6 7 8

Cánh vẩy Cánh vẩy Cánh vẩy Cánh vẩy Cánh vẩy Cry2A

Cry2B

71 71

Tròn Tròn

3 3

Cánh vẩy, hai cánh

Cánh vẩy Cry3A

Cry3B

Cry3C

Cry3D

73 74 129 73

Tháp đôi Tháp đôi Tháp đôi Tháp đôi

8 8 8 8

Cánh cứng Cánh cứng Cánh cứng Cánh cứng Cry4A

Cry4B

Cry4C

Cry4D

135 128 78 67

Hình cầu Hình cầu Hình cầu Hình cầu

14 14 14 14

Hai cánh Hai cánh Hai cánh Hai cánh

cánh cứng

1.6.Các loại độc tố do B.thuringiensis sinh ra

Trong quá trình hình thành bào tử Bt có khả năng sinh ra 4 loại độc tố: +-Exotoxin hay ngoại đọc tố A

Năm 1954 lần đầu tiên Tomanaff phát hiện thấy vi khuẩn Bt var.elesti sản sinh ra enzym leucintinase Tác động độc của enzym này liên quan đến sự phân huỷ mang tính chất cảm ứng của phospholopit trong mô của côn trùng, làm côn trùng chết.Enym này lần đầu tiên liên kết với tế bào ruột sau đó tách ra và đợc hoạt hoá bởi một chất không bền nhiệt Chất này có trọng lợng phân tử thấp, có thể là lipit -Exotoxin có khả năng hoà tan vào nớc và đặc biệt chỉ tác động vào loài ong xẻ có pH đờng ruột phù hợp với hoạt đông của enzym này -Exotoxin cũng có hiệu lực với sâu thuộc bộ cánh cứng, cánh vẩy… là do muỗi gây ra Muỗi sinh tr

+-Exotoxin hay ngoại đọc tố B

Đọc tố này bền nhiệt ở 1200C trong vòng 15 phút vẫn giữ đợc hoạt tính Một số Bt không sinh ra tinh thể độc nhng có thể sinh ra ngoại độc tố  Hoạt tính của ngoại độc tố  bắt đầu xuất hiện trong giai đoạn phát triển mạnh trớc khi hình thành bào tử Ngoại độc tố là một nucleotid có trọng lợng phân tử thấp Ngoại độc tố  còn có tác dụng cộng hởng với nội độc tố , sau khi có tác dụng gây dập vỡ, phá huỷ hoàn toàn biểu mô ruột giữa của ôn trùng mẫn cảm, ngoại

độc tố nhanh chóng xâm nhập vào huyết tơng và máu gây thay đổi sinh lý dẫn tới cái chết nhanh của côn trùng

+-exotoxin hay độc tố tan trong nớc

-exotoxin thuộc nhóm photpholipaza, nó tác động lên photpholipit và giải phóng ra axit béo -exotoxin có chứa các peptid với trọng lợng phân tử thấp và một số axitamin tự do Ngoại độc tố này tan trong nớc, không ổn định, mẫn cảm với ánh sáng, oxy, không khí và nhiệt độ

+-endotoxin (tinh thể độc)

Đặc điểm quan trọng nhất của vi khuẩn Bt là có khả năng tạo thành trong té bào một loại tinh thể có bản chất là protein độc tính đối với nhiều loại côn trùng Nội độc tố là một loại protein kết tinh từ 1180 gốc axitamin Các axitamin chủ yếu gồm axit glutamic, axit asparaginic chiếm trên 29% tổng số axitamin trong phân tử protein, là nguyên nhân gây điểm đẳng điện thấp

Nguyên tố của tinh thể, ngoài C, H, O, N, S còn thấy một số nguyên tố khác

nh là Ca, Mg, Si, Fe… là do muỗi gây ra Muỗi sinh tr với một lợng nhỏ Ni, Zn, Al… là do muỗi gây ra Muỗi sinh tr và hầu nh không có P

Sự tổng hợp tinh thể xẩy ra khoảng 3 giờ sau pha cân bằng Mỗi tế bào sinh bào tử chỉ có thể có từ 1 đến 3 tinh thể độc Tinh thể độc không tan trong dung môi hữu cơ Có những tinh thể khi mới tách khỏi bào tử chỉ tan trong pH rất kiềm

Tinh thể đọc rất bền nhiệt,ủ 1 giờ ở 650C vẫn không bị mất hoạt tính, tính

độc chỉ mất đi nếu ủ ở 1000C trong 30-40 phút

1.7 Phân loại gen độc tố diệt côn trùng của B.thuringiensis

Ngày nay ngời ta đã phân tích 50 gen độc tố của Bt và nhận thấy một số hoàn toàn giống nhau, đại diện cho cùng một gen hay biến dạng từ một gen Trong đó có khoảng 20 gen phân biệt chịu trách nhiệm tổnh hợp các protein tinh thể, nhất là các protein tinh thể độc

Bảng 2 Phân loại gen độc tố và phổ tác dụng của Bt

phân tử, kDa

đích Bacillusthuringiensis dạng tinh

thể Cry1A(a, b, c)

Cry1B

Cry1C

Cry1D, E, F

130-133 138 135 130-134

Cánh vẩy Cánh vẩy Hai cánh Hai cánh

B berliner

B kurstaki KTO

B entomocidus

B aizawai

Lỡng tháp Cry2A

Cry2B, C

71 71

Cánh vẩy Hai cánh

B aizawai

B kurstaki HD-1

Lập

ph-ơng Cry3A, B, C, D 66-73 Cánh cứng B tenebrionis Thoi dẹt Cry4A, B

Cry4C, D

125-140

B morrisoni PG14

B israelensiss

Cầu Chữ nhật

Cry5A

Cry5C

Cánh cứng B kurstaki JHCC

Lỡng tháp

Phần II Tổng quan về Bacillus thuringiensis var.israelensis

2.1 Lịch sử phát triển của loài phụ Bacillus thuringiensis var.israelensis

Bacillus thuringiensis đợc chia làm nhiều loài phụ Theo bộ su tập của trung tâm Bacillus diệt côn trùng Quốc tế, Viện Pasteur Paris năm 1996,đã có tới hơn

69 loài phụ khác nhau nh: cánh vẩy, cánh cứng, hai cánh ở một số loài phụ của Bacillus thuringiensis var.berliner, Bacillus thuringiensis var.thompsoni… là do muỗi gây ra Muỗi sinh tr

Khác với loài Bacillus thuringiensis, loài phụ Bacillus thuringiensis var.israelensis mới đợc phát hiện gần đây Loài phụ này có tác dụng diệt ấu trùng muỗi Các nhà khoa học Goldberg, Margarit là những ngời đầu tiên phân lập, nghiên cứu loài vi khuẩn này và De Bajac đặt tên cho là Bacillus thuringiensis var.israelensis Họ đã phân lập và nuôi cấy,thử hoạt lực diệt ẩutùng muỗi với hàng trăm chủng khác nhau Tuy nhiên chỉ có một số chủng có hoạt lực diệt các loài muỗi Culex pipens, Culex univttatus, Aedes aegypti và Anopheles sergentti… là do muỗi gây ra Muỗi sinh tr

Chủng đầu tiên đó đợc kí hiệu là ORN-60A và thuộc typ huyết thanh H14 Khả năng sinh độc tố và tác dụng diệt muỗi của vi khuẩn này đã có nhiều công trình công bố Ngày nay đã có rất nhiều chủng Bacillus thuringiensis var.israelensis đợc tìm thấy và đợc phân loại làm phong phú thêm bộ su tập về Bacillus diệt côn trùng Các chủng thờng đợc sử dụng trong việc sản xuất chế phẩm sinh học diệt muỗi với các tên gọi khác nhau: Bactimos (Bỉ), Skeetan (Anh), Vectobac (Mỹ)… là do muỗi gây ra Muỗi sinh tr chế phẩm dạng lỏng, dạng bột thấm nớc, dạng viên, bánh nổi có tác dụng diệt ấu trùng của nhiều loài ruồi muỗi trong đó có loài Aedes Aegypti ( là vectơ truyền bệnh sốt xuất huyết) Chế phẩm Bacillus

thuringiensis var.israelensis có tác dụng tốt trong môi trờng nớc sạch, nớc không

tù đọng hoặc nớc có nồng độ muối loãng và đợc Tổ chức Y tế thế giới lựa chọn

để diệt trừ các vectơ truyền bệnh sốt rét, sốt xuất huyết ở các nớc nhiệt đới

2.2.Đặc điểm phân loại loài phụ Bacillus thuringiensis var.israelensis

Bacillus thuringiensis var.israelensis là loài phụ của loài Bacillus thuringiensis De Bajac là ngời đầu tiên đã phân loại loài phụ Bacillus thuringiensis var.israelensis thuộc typ huyết thanh H14 Tuy nhiên vào năm 1988, Ohba và Aiawa (Nhật Bản) đã phân lập đợc hai chủng Bacillus thuringiensis thuộc typ huyết thanh H14 nhng lại không có hoạt lực diệt muỗi, ruồi đen Trớc

đó (năm 1982) Pachun và cộng sự đã phân lập đợc chủng PG-14 thuộc typ huyết thanh H8A,B có hoạt lực cao đối với ấu trùng muỗi Aedes Aegypti, Culex pipens, Culex univttatus, Aedes aegypti và Anopheles sergentti… là do muỗi gây ra Muỗi sinh tr

Do đó nếu chỉ dựa trên đặc diểm typ huyêt thanh thì không thể đảm bảo đợc phân loại một cách chính xác mà phải dựa trên những đặc điểm khác nhau nh lớp Cry, thành phần và hình dạng protein tinh thể Hofte và Whiteley là những ngời

đầu tiên đa ra ý tởng phân loại loài phụ Bacillus thuringiensis var.israelensis dựa trên sự kết hợp của tất cả các đặc điểm: gen Cry, thành phần và hình dạng protein tinh thể, hoạt lực diệt côn trùng và typ huyết thanh ý tởng này đẵ đợc rất nhiều nhà khoa học hởng ứng và đợc sử dụng chủ yếu cho đến nay để phân loại Bacillus thuringiensis var.israelensis

Bảng 3: Đặc điểm phân loại của loài phụ Bacillus thuringiensis

var.israelensis (theo Hofte và Whiteley, 1989)

Lớp gen Cry Thành phần

protein(KDa)

Hình dạng tinh thể

Typ huyết thanh

Hoạt lực diệt côn trùng Cry4A

Cry4B

Cry4C

Cry4D

Cyt

135 138 78 67 28

Hình cầu Hình cầu Hình cầu Hình cầu Hình cầu

H14

H14

H14

H14

H14

Muỗi, ruồi

đen Muỗi, ruồi

đen Muỗi, ruồi

đen Muỗi, ruồi

đen Muỗi, ruồi

đen

2.3.Protein diệt muỗi của loài phụ Bacillus thuringiensis var.israelensis

Sự hình thành protein tinh thể Bacillus thuringiensis thờng xẩy ra trong quá trình hình thành bào tử và nhiều nghiên cứu gần đây đã cho thấy nó có liên quan mật thiết tới sự có mặt của DNA plasmit Gen mã hoá protein độc thờng nằm trên các plámid cỡ lớn trên 3 kb gồm một phần là genmã hoá protein độc và phần còn lại mã hoá protein liên quan đến tính gắn

Khi nghiên cứu các cách chủng Bacillus thuringiensis var.israelensis có hoạt lực đối với côn trùng thuộc bộ hai cánh, ngời ta thấy protein độc của chúng bao gồm các tiểu phần protein có trọng lợng phân tử: 130 KDa, 128 KDa, 78 KDa, 6 KDa , 28 KDa do các lớp gen Cry4A, Cry4B, Cry4C, Cry4D và Cyt mã hoá tổng hợp nên.Đây cũng chính là đặc điểm quan trọng nhất để phân biệt loài phụ Bacillus thuringiensis var.israelensis với các loài khác

Nhóm Cry4 mã hoá tổng hợp các protein tinh thể có trọng lợng 130, 128,

78 và 67 KDa, có kích thớc thông thờng khoảng từ 0.7-1.2 m Nhóm gen Cry4 mã hoá tổng hợp các protein tinh thể có trọng lợng 130, 128, 78và 67 kDa

có kích thớc thông thờng đạt từ 0.7-1.2 m Nhóm gen Cyt bao gồm hai lớp CytA và CytB thờng tồn tại ở các chủng Bacillus thuringiensis mang nhóm gen Cry4 và tổng hợp các protein có trọng lợng phân tử khoảng 28 kDa Các chủng Bacillus thuringiensis var.israelensis thờng tổng hợp các tinh thể protein hình cầu chỉ gây độc đối với bộ côn trùng hai cánh Tinh thể độc của Bti gồm ba loại thể vùi protein khác nhau gắn với nhau bằng các lớp vỏ bọc Mỗi thể vùi đợc bảo