NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Tế bào động vật tách từ mô có thể được nuôi cấy trên các loại môi trường dinh dưỡng tổng hợp bên ngoài cơ thể, chúng sinh trưởng bằng cách tăng số lượng và kích thước tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật đã tạo cơ hội để nghiên cứu các tế bào ung thư, phân loại các khối u ác tính, mô hình thực nghiệm để khảo sát tác động của hóa chất, xác định sự tương hợp của mô trong cấy ghép và nghiên cứu các tế bào đặc biệt cùng sự tương tác của chúng. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật có vú có thể được ứng dụng để sản xuất các hợp chất hóa sinh quan trọng dùng trong chẩn đoán như các hormone sinh trưởng của người, interferon, hoạt tố plasminogen mô, các viral vaccine và các kháng thể đơn dòng. Theo phương pháp truyền thống các hợp chất hóa sinh này được sản xuất bằng cách sử dụng các động vật sống hoặc được tách chiết từ xác người chết. Chẳng hạn, các kháng thể đơn dòng có thể được sản xuất bằng cách nuôi cấy các tế bào hybridoma trong các khoang màng bụng (peritoneal cavity) của chuột, hoặc hormone sinh trưởng dùng để chữa bệnh còi (dwarfism) có thể được tách chiết từ xác người chết. Một vài sản phẩm gen của động vật có vú cũng có thể được sản xuất bởi công nghệ DNA tái tổ hợp. Ngày nay với sự phát triển của khoa học kỹ thuật nên công nghệ nuôi cấy tế bào động vật ngày càng được phát triển và ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh vực tuy nhiên lĩnh vực y tế được ứng dụng nhiều nhất, giúp cải thiện sức khỏe và chữa trị một số bệnh. Bài tiểu luận này sẽ giúp tìm hiểu sơ lược về các kỹ thuật cũng như ứng dụng của chúng trong y tế.

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KT MÔI TRƯỜNG

NUÔI CẤY TẾ BÀO

ĐỘNG VẬT

GIẢNG VIÊN hướng dẫn: Phạm Minh Tuấn

SINH VIÊN thực hiện : Nguyễn Thị Vân An 2008100094

Nguyễn Thị Hồng Gấm 2008100022 Đoàn Thị Nhựt Lan 2008100063

LỚP: 01DHSH2

Tp HCM, ngày 21 tháng 10 năm 2012

1

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU 3

NỘI DUNG 4

KẾT LUẬN 19

TÀI LIỆU THAM KHẢO 20

LỜI MỞ ĐẦU

Tế bào động vật tách từ mô có thể được nuôi cấy trên các loại môi trường dinh dưỡng tổng hợp bên ngoài cơ thể, chúng sinh trưởng bằng cách tăng số lượng và kích thước tế bào Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật đã tạo cơ hội để nghiên cứu các tế bào ung thư, phân loại các khối u ác tính, mô hình thực nghiệm để khảo sát tác động của hóa chất, xác định sự tương hợp của mô trong cấy ghép và nghiên cứu các tế bào đặc biệt cùng sự tương tác của chúng

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật có vú có thể được ứng dụng để sản xuất các hợp chất hóa sinh quan trọng dùng trong chẩn đoán như các hormone sinh trưởng của người, interferon, hoạt tố plasminogen mô, các viral vaccine và các kháng thể đơn dòng Theo phương pháp truyền thống các hợp chất hóa sinh này được sản xuất bằng cách sử dụng các động vật sống hoặc được tách chiết từ xác người chết Chẳng hạn, các kháng thể đơn dòng có thể được sản xuất bằng cách nuôi cấy các tế bào hybridoma trong các khoang màng bụng (peritoneal cavity) của chuột, hoặc hormone sinh trưởng dùng để chữa bệnh còi (dwarfism) có thể được tách chiết từ xác người chết Một vài sản phẩm gen của động vật có vú cũng có thể được sản xuất bởi công nghệ DNA tái tổ hợp

Ngày nay với sự phát triển của khoa học kỹ thuật nên công nghệ nuôi cấy tế bào động vật ngày càng được phát triển và ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh vực tuy nhiên lĩnh vực y tế được ứng dụng nhiều nhất, giúp cải thiện sức khỏe và chữa trị một

số bệnh Bài tiểu luận này sẽ giúp tìm hiểu sơ lược về các kỹ thuật cũng như ứng dụng của chúng trong y tế

3

NỘI DUNG

I Tế bào động vật:

Các tế bào động vật là tế bào eukaryote, chúng được liên kết với nhau bởi các nguyên liệu gian bào để tạo thành mô Mô động vật thường được phân chia theo bốn nhóm: biểu mô (epithelium), mô liên kết (connective tissue), mô cơ (muscle) và mô thần kinh (nerve)

Gồm 2 kiểu tế bào: Tế bào dịch huyền phù (tế bào bạch huyết), tế bào dính bám (tế bào biểu mô, nguyên bào sợi)

Hình 6.1 Các tế bào động vật thường được sử dụng trong nuôi cấy

(a) tế bào bạch huyết, (b) tế bào biểu mô, (c) nguyên bào sợi

 Phương pháp xác định các tế bào để nuôi cấy:

Đầu tiên, tách một mảnh mô trong điều kiện vô trùng

 Đem xử lí với enzyme proteasa (thường là trypsin): enzyme cắt mô tách

các tế bào rời nhau ra

 Đem cấy dịch tế bào vào môi trường dinh dưỡng lỏng thích hợp

II Các ưu điểm và hạn chế của nuôi cấy tế bào động vật:

a Ưu điểm:

- Hệ thống tế bào động vật là các “nhà máy tế bào” thích hợp cho việc sản xuất các phân tử phức tạp và các kháng thể dùng làm thuốc phòng bệnh, điều trị hoặc chẩn đoán (Bảng 6.1)

- Các tế bào động vật đáp ứng được quá trình hậu dịch mã chính xác đối với các sản phẩm protein sinh-dược (biopharmaceutical)

- Sản xuất các viral vector dùng trong liệu pháp gen (biến nạp một gen bình thường vào trong tế bào soma mang gen tương ứng bị khiếm khuyết để chữa bệnh do

sự khiếm khuyết đó gây ra) Các mục đích chính của liệu pháp này là các bệnh ung thư, hội chứng suy giảm miễn dịch (HIV), chứng viêm khớp, các bệnh tim mạch và xơ hóa u nang

- Sản xuất các tế bào động vật để dùng làm cơ chất in vitro trong nghiên cứu

độc chất học và dược học

- Phát triển công nghệ mô hoặc phát sinh cơ quan để sản xuất các cơ quan thay thế nhân tạo-sinh học/các dụng cụ trợ giúp, chẳng hạn:

+ Da nhân tạo để chửa bỏng

+ Mô gan để chữa bệnh viêm gan

+ Đảo Langerhans để chữa bệnh tiểu đường

Bảng 6.1: Các sản phẩm của nuôi cấy tế bào động vật.

Nhóm I

Enzyme Urokinase, hoạt tố plasminogenmô (t-PA) Hormone Hormone sinh trưởng (GH) Các nhân tố sinh trưởng Các cytokine khác

Bệnh dại, bệnh quai bị, bệnh

sởi ở người…

Veterinary-FMD vaccine, New Cattle’s Disease

Nhóm III Kháng thể đơn dòng Các công cụ chuẩn đoán Nhóm IV Virus côn trùng Thuốc trừ sâu sinh học choBaculovirus Nhóm V Các chất điều hòa miễn dịch Interferon và interleukin Nhóm VI Các tế bào nguyên vẹn Thử nghiệm độc chất học

b Hạn chế:

- Các tế bào động vật có kích thước lớn hơn và cấu trúc phức tạp hơn các tế bào

vi sinh vật

- Tốc độ sinh trưởng của tế bào động vật rất chậm so với tế bào vi sinh vật Vì thế, sản lượng của chúng khá thấp và việc duy trì điều kiện nuôi cấy vô trùng trong một thời gian dài thường gặp nhiều khó khăn hơn

5

- Các tế bào động vật được bao bọc bởi màng huyết tương, mỏng hơn nhiều so với thành tế bào dày chắc thường thấy ở vi sinh vật hoặc tế bào thực vật, và kết quả là chúng rất dễ bị biến dạng và vỡ

- Nhu cầu dinh dưỡng của tế bào động vật chưa được xác định một cách đầy đủ,

và môi trường nuôi cấy thường đòi hỏi bổ sung huyết thanh máu rất đắt tiền

- Tế bào động vật là một phần của mô đã được tổ chức (phân hóa) hơn là một

cơ thể đơn bào riêng biệt như vi sinh vật

- Hầu hết các tế bào động vật chỉ sinh trưởng khi được gắn trên một bề mặt

III Môi trường nuôi cấy:

Môi trường dinh dưỡng tốt nhất là điều kiện hàng đầu cho sự tăng trưởng và sinh sản của tế bào khi tách mô khỏi cơ thể, động vật không trao đổi chất nitrogen vô

cơ Vì thế, nhiều amino acid và vitamin cần phải được bổ sung vào môi trường

Môi trường đặc trưng dùng trong nuôi cấy tế bào động vật bao gồm các amino acid, các vitamin, hormone, các nhân tố sinh trưởng, muối khoáng và glucose Trong

đó, huyết thanh là môi trường cần thiết cho sự phát triển và tồn tại của tế bào nuôi cấy mặc dù huyết thanh có thành phần chưa được xác định đầy đủ Tuy nhiên, chúng lại rất mắc và còn là nguồn nhiễm bẩn virus và mycoplasma, trong một số trường hợp sự hiện diện của nhiều protein khác nhau trong huyết thanh gây khó khăn cho các quá trình phân tách và tinh sạch đầu ra

Huyết thanh:

+ Cung cấp chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào như các amino acid thiết yếu, tiền chất acid nucleic, các nguyên tố vi lượng

+ Cung cấp các nhân tố tăng trưởng, kích thích cho tế bào tăng trưởng và phân chia

+ Kích thích sự hồi phục các tổn thương sau khi tách tế bào khỏi mô hay khỏi

bề mặt dụng cụ nuôi cấy

+ Cải thiện tính tan của các chất dinh dưỡng

+ Chống oxy hoá khử trong tế bào ở mức cho phép Trong huyết thanh có những khả năng chống oxy hoá (acid ascorbic, H2SeO3) để đảm bảo thế oxy hoá khử trong tế bào

Phân loại:

Môi trường nuôi tự nhiên: dịch huyết tương, cục máu đông, nước ối bào thai,

dịch chiết phôi

Môi trường nuôi tổng hợp: Thành phần chủ yếu và không thể thiếu trong môi

trường này là huyết tương của máu (chiếm 5-10%) Thành phần căn bản: dung dịch sinh lí hay dung dịch muối cân bằng

Môi trường Eager thường được sử dụng nhiều trong nuôi cấy tế bào động vật

Bảng: Thành phần môi trường Eager (1959)

Thành phần Nồng độ (mg/l) Thành phần Nồng độ (mg/l)

1 L-Amino acid

Arginine

Cystine

Glutamine

Histidine

Isoleucine

Leucine

Lysine

Methionine

Phenylalanine

Threonine

Tryptophan

Tyrosine

Valine

2 Carbohydrate

Glucose

Serum

105 24 292 31 52 52 58 15 32 48 10 36 46

1000 5-10%

3 Vitamin

Choline Folic acid Inositiol Nicotinamide Pantothenate Pyridoxal Riboflavin Thiamine

4 Muối

NaCl KCl CaCl2 MgCl2.6H2O NaH2PO4 2H2O NaHCO3

1 1 2 1 1 1 0,1 1

6800 400 200 200 150 2000

IV Kỹ thuật nuối cấy tế bào động vật:

Phương pháp chính trong nuôi cấy tế bào động vật có vú để sản xuất các sản phẩm sinh-dược là dựa trên cơ sở nuôi cấy dịch huyền phù trong hệ lên men Tuy nhiên, nuôi cấy các tế bào động vật và thực vật khó khăn hơn nhiều so với vi sinh vật, cái chính là do quá trình trao đổi chất trong các loại tế bào này diễn ra chậm, điều này cũng phản ánh tốc độ sinh trưởng chậm của tế bào Các tế bào động vật có nhu cầu

7

dinh dưỡng phức tạp hơn so với vi khuẩn và nấm men, chúng không có thành tế bào như vi khuẩn vì thế rất dễ biến dạng và vỡ Do đó, các hệ thống khuấy và sục khí được thiết kế khác với nuôi cấy vi khuẩn

Đặc điểm dễ biến dạng và dễ vỡ của tế bào động vật đã được khắc phục bằng cách:

Sử dụng hệ lên men có cánh k h u ấy hình m ái chèo

Cung cấp khí trực tiếp có thể tạo ra bọt khí dễ làm vỡ tế bào, vì thế cần cung cấp khí bằng cách khuếch tán thông qua ống silicone Môi trường chứa nhiều protein huyết thanh có khả năng gây ra hiện tượng tạo bọt nên cần khuấy chậm và nhẹ Đối với nuôi cấy mật độ cao, cần cung cấp thêm oxygen

Như vậy các hệ lên men vi sinh vật được cải tiến thích hợp có thể dùng để nuôi cấy sinh khối các tế bào động vật sinh trưởng trong dịch huyền phù

Nếu muốn nuôi cấy một dòng tế bào dính bám thì nên dùng một hệ thống chất mang như là microcarrier

Các dòng tế bào động vật có vú thường được sử dụng trong nuôi cấy là CHO (Chinese hamster ovary: tế bào buồng trứng chuột đồng Trung Quốc), NS0 (Mouse myeloma: tế bào u tủy của chuột), BHK (Baby hamster kidney: tế bào thận của chuột đồng sơ sinh), HEK - 293 (Human embryo kidney: tế bào thận của phôi người) và tế bào võng mạc của người

Sơ đồ nuôi cấy:

V Ứng dụng nuôi cấy tế bào động vật:

1 Sản xuất Interferon:

Interferon là một nhóm các protein tự nhiên được sản xuất bởi các tế bào của hệ miễn dịch ở hầu hết các động vật nhằm chống lại các tác nhân ngoại lai như virus, vi khuẩn, kí sinh trùng và tế bào ung thư

Nó chỉ được tổng hợp khi có mặt các chất sinh interferon (còn gọi là interferonogen) Interferon thuộc một lớp lớn của glycoprotein được biết đến dưới cái tên cytokine (chất hoạt hoá tế bào) Interferon đóng vai trò quan trọng trong cửa ngõ miễn dịch, nó là hàng rào bảo vệ đầu tiên của cơ thể chống lại virus và sự phát triển bất thường của tế bào Nó là một phần của hệ thống miễn dịch không đặc hiệu (non-specific immune system) và được kích hoạt bởi giai đoạn đầu của quá trình cảm nhiễm trước khi hệ miễn dịch đặc hiệu (specific immune system) có thời gian để phản ứng Cần phân biệt interferon nội sinh được sinh ra trong cơ thể và interferon ngoại sinh do nuôi cấy tế bào ngoài cơ thể

Muốn có 40mg Interferon tinh khiết, người ta phải dùng 2.000 quả trứng gà để chiết xuất Trong khi ấy, bằng công nghệ sinh học lên men nuôi cấy tế bào E.coli tái tổ hợp thì chỉ cần 1 lít môi trường nuôi cấy

Vai trò của Interferon

Nhìn chung, Interferon có 7 hoạt tính sau:

- Kháng virus

- Điều hòa miễn dịch

- Chống tăng sinh khối

- Kích thích sự biệt hóa tế bào

- Điều hòa sinh trưởng tế bào

- Giải độc

- Kháng đột biến

Dạng đầu tiên gồm IFN và IFN được sản xuất từ các tế bào nhiễm virus Dạng thứ hai của interferon được tiết ra từ các tế bào T đã hoạt hoá Các IFN γ tạo ra

sự đối kháng chống lại quá trình nhiễm virus đối với tế bào không bị nhiễm Ngoài ra, các IFN còn kiểm tra sự tương tác giữa các lympho và các tế bào gây độc đối với các

tế bào bị nhiễm

+ Interferon alpha và beta được sản sinh bởi nhiều loại tế bào bao gồm tế bào T,

B, đại thực bào, nguyên bào xơ, tế bào màng trong, nguyên bào xương và các loại khác Chúng đều có đặc tính kháng vi rút và đặc tính kháng ung thư Chúng kích thích

cả đại thực bào và tế bào NK

+ Interferon gamma có liên quan đến sự điều hòa miễn dịch và phản ứng viêm

Ở người chỉ có duy nhất một loại Interferon gamma Nó được sản sinh bởi các tế bào T hoạt động và tế bào NK Interferon gamma cũng có vài tác dụng kháng vi rút và kháng ung thư nhưng tác dụng này rất yếu Do vậy, Interferon gamma không được sử dụng

để điều trị ung thư

Công dụng của Interferon-alfa: IFN-α được sử dụng trong điều trị đa hồng cầu sau khi có những bằng chứng cho thấy hiệu quả của thuốc này trong điều trị một loại bệnh tăng sinh tủy ác tính khác là bệnh lơxêmi kinh dòng hạt IFN-α có tác dụng ức chế tủy xương nên cũng gây giảm cả hematocrit, số lượng tiểu cầu và bạch cầu trong máu ngoại vi Ưu điểm của thuốc này là tác dụng được duy trì sau khi ngưng dùng thuốc và không gây chuyển dạng thành ung thư máu và không gây đột biến gen, do đó

có thể sử dụng cho những bệnh nhân trẻ tuổi, IFN-α không qua được nhau thai nên có thể dùng được ở phụ nữ có thai

Một nhược điểm quan trọng của IFN-α là rất đắt tiền Interferon alpha tái tổ hợp

đã được sử dụng trong lĩnh vực điều trị bệnh như: viêm gan siêu vi B, C, bệnh hủi, leishmaniasis, toxoplasmosis, bệnh ung thư như u hắc tố (melanoma) và u bướu thịt Kaposi (Kaposi’s sarcoma)…

Melanoma (Ung thư da)

11

Bệnh hủi

Công dụng IFN gama:

Điều trị bệnh viên gan C

Điều trị bệnh nhân HIV/AIDS: dùng kết hợp IFN với thuốc trị HIV (AZT) sẽ gia tăng hiệu quả kháng virus

IFN γ là vũ khí hữu hiệu trong điều trị cúm A/H5N1

2 Sản xuất virus vaccine:

Các vaccine virus sản xuất từ tế bào động vật nuôi cấy đã đóng góp vô giá vào

sự cải thiện Y tế cộng đồng trên toàn thế giới, điển hình nhất là hiệu quả ngừa bệnh đậu mùa ho gà, lao, sởi, bạch hầu, uốn ván, và chứng bại liệt ở trẻ em

Trong lĩnh vực thú y: vacxin lở mồm long móng cho súc vật nuôi, vacxin phòng dại,…

Còn gọi là vaccine DNA tái tổ hợp, đây là loại nucleic acid vaccine, dựa trên nguyên lý một gen mã hóa cho protein kháng nguyên đặc hiệu được tiêm vào vật chủ (tế bào động vật hoặc vi sinh vật) để sản xuất các kháng nguyên này và khởi động một phản ứng miễn dịch Nhiều vaccine phòng virus hiện nay (sởi, tê liệt, dại…) đều được sản xuất từ nuôi cấy tế bào động vật mà không phải là tế bào vi sinh vật

Để sản xuất vaccine, người ta cho nhiễm và nhân virus trong tế bào để đạt mật

độ tối đa Sau đó virus được trích ly và xử lý bằng các tác nhân gây bất hoạt như formaldehyde trước khi được sử dụng làm vaccine

Nguyên tắc:

- Chọn dòng tế bào thích ứng với virus

- Phân lập và nhân virus trong tế bào

- Thu hoạch dịch tế bào nhiễm virus

- Bất hoạt virus từ dịch tế bào

- Làm tinh sạch virus thu được bằng siêu li tâm.

- Sử dụng virus làm vaccine

Hình minh họa mô hình sản xuất và điều trị bằng liệu pháp vaccine virus.

Phân lập một hoặc nhiều gen từ tác nhân gây bệnh (pathogen), đưa các gen này vào trong vòng DNA của plasmid và đóng lại (a) Các vòng DNA sau đó được đưa vào trong các nhóm tế bào nhỏ, thường bằng cách tiêm vào tế bào cơ (b) hoặc đẩy vào

da nhờ súng bắn gen (c) Các gen được chọn lựa mã hóa cho các kháng nguyên, các chất có thể gây ra một đáp ứng miễn dịch, thường được sản xuất bởi tác nhân gây bệnh

Một số virus vaccine:

Vaccine ngừa viêm gan B (Được sản xuất bằng dòng tế bào ung thư gan ở người)

Vaccine ngăn chặn HIV

Vaccine ngừa bệnh dại

Vaccine ngừa bệnh cúm A/H5N1 (được sản xuất trên tế bào thận khỉ)

Vaccine chống lở mồm long móng ở gia súc (được sản xuất trên te bào thận chuột)

3 Sản xuất protein tái tổ hợp – Chất kích hoạt plasminogen mô t-PA:

13

Hoạt tố plasminogen mô t-PA được tổng hợp trong nuôi cấy các tế bào động vật

có vú chuyển gen t-PA là một protease có tác dụng phân hủy các sợi tơ huyết fibrin (dạng hoạt hóa của protein gây đông máu fibrinogen13, protein không tan đã đông kết thành các sợi để hình thành một cục máu đông) được sử dụng để chữa bệnh nghẽn mạch máu Bệnh nhân bị những cơn đau tim thường được uống t-PA vì nó phá tan những cục máu nhỏ có khả năng làm tắc mạch

Các nghiên cứu gần đây cho thấy có thể sử dụng các tuyến sữa của động vật chuyển gen để sản xuất các protein hiếm của người Chẳng hạn, gen t-PA được đưa vào phôi chuột bằng công nghệ DNA tái tổ hợp, sau đó phôi chuột được cấy vào chuột cái tạo thành chuột chuyển gen có khả năng tiết t-PA người qua sữa

4 Sản xuất các kháng thể đơn dòng – Chuẩn đoán ung thư:

Nghiên cứu kháng thể đơn dòng

Quá trình hình thành kháng thể của hệ miễn dịch đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực y học:

- Các dạng thuốc vaccine chính là những kháng nguyên được đưa vào cơ thể để tạo ra các kháng thể mong muốn giúp phòng ngừa bệnh tật

- Rất nhiều các xét nghiệm chẩn đoán dựa trên sự hình thành phức hợp kháng nguyên – kháng thể

- Trong điều trị một số bệnh lý, việc đưa trực tiếp các huyết thanh chứa kháng thể sẽ giúp tạo ra miễn dịch tạm thời hoặc đưa dần một lượng nhỏ kháng nguyên vào