NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT:KỸ THUẬT VÀ ỨNG DỤNG.TS.VŨ BÍCH NGỌC

SINH HỌC CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Đặc điểm sinh học của tế bào Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của nuôi cấy tế bào 9/16/19 TS.. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn Tăng trưởng và phân ch

9/16/19 TS Vũ Bích Ngọc-vbngoc@hcmus.edu.vn 1

SINH HỌC CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Đặc điểm sinh học của

tế bào

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của nuôi cấy tế bào

9/16/19 TS Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

9/16/19 TS Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

Tăng trưởng và phân chia chậm Tính chất cần giá đỡ

Tính cơ học yếu Thay đổi kiểu gen và kiểu hình

Cơ chế kìm hãm ngược

Có thể được bảo quản lâu dài bằng phương pháp lạnh sâu

9/16/19 TS Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

Phân chia chậm

Tăng trưởng, phân chia chậm (20-40 giờ) Hiệu suất sinh chất có hoạt tính sinh học thấp

9/16/19 TS Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

Chu kì tế bào

M Mitosis

G1 Gap1

G2 Gap2

Metaphase

• NST sắp xếp trên mặt phẳng thoi vô sắc

o Gap 0 (G0): tế bào thoát ra khỏi

chu kì tế bào và không phân chia

o Gap 1 (G1): tế bào gia tăng kích

thước, tổng hợp RNA và protein,

có 1 G1 Checkpoint

o S Phase: sự nhân đôi DNA xảy ra

o Gap 2 (G2): tế bào sẽ tiếp tục

phát triển và sản xuất các protein

mới Có 1 G2 Checkpoint

Mitosis hay M Phase:

• Sự phát triển và tổng hợp protein

• Tế bào chia thành 2 tế bào giống nhau.

• Mitosis thường xảy ra từ 1-2 giờ

• Có Checkpoint trong giữa kì của

Mitosis (Metaphase Checkpoint) để đảm bảo tế bào hoàn thành xong sự phân chia.

• Là điểm quan trọng quyết

định sự phân chia của tế

• Khi tế bào vượt qua điểm này,

đi vào phase S, quá trình

phân chia không thể đảo

ngược.

Điểm kiểm soát G1

• Đảm bảo tế bào phân chia thuận lợi

• Nếu tế bào bị lỗi hoặc tổn

thương, G2 checkpoint sẽ dừng lại để sửa chữa

• Nếu tổn thương không thể đảo ngược, tế bào đi vào quá trình apoptosis à đảm bảo DNA hư hỏng tế bào không truyền cho thế hệ sauà quan trọng trong ngăn ngừa ung thư

Điểm kiểm soát G2

Điểm kiểm soát thoi vô sắc

Tính chất cần giá đỡ

-TB bám vào giá đỡ để có thể sống sót, phân chia

- Ngoại trừ: hồng cầu, TB ung thư, 1 số dòng TB liên tục

9/16/19 TS Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

Thay đổi kiểu gen và kiểu hình

Dung hợp, biến nạp, tải nạp… à tế bào thay đổi kiểu gen và kiểu hình

• Ở mỗi tế bào phân chia,

sự tự làm mới và biệt hoá được quyết định bởi

tương tác của yếu tố bên trong và tín hiệu hướng dẫn hoặc tín hiệu chọn lọc bên ngoài

Thay đổi kiểu gen và kiểu hình

1

MSC của các loài có khả năng biệt

hoá thành tế bào mỡ như nhau ở

Thay đổi kiểu gen và kiểu hình

hASC và rBMMSC biệt hoá thành dòng tế bào tạo xương trong suốt quá trình nuôi cấy

rASC và hBMMSC mất khả năng biệt hoá thành dòng tế bào tạo xương sau pass 10

• Ức chế sự tăng sinh

– Giới hạn mật độ: mật độ tế bào cao

– Kìm hãm tiếp xúc: tương tác tế bào

– Các tín hiệu từ môi trường: p53 gene product

14

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của nuôi cấy tế bào (tăng sinh

invitro)

9/16/19

TS Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

SỰ TĂNG SINH IN VITRO CỦA TẾ

BÀO

Vai trò của bộ gen -giới hạn HayFlick

Leonard Hayflick (1965)

Tế bào phân chia 50-

70 lần

Vai trò của bộ gen

Chiều dài telomere giảm

theo tuổi

1

Hoạt tính của telomerase cao nhất ở các pass đầu tiên

2

Mức độ hoạt động của telomerase khác nhau giữa các loài và các nguồn thu: giảm nhiều nhất ở rASC và

hBMMSC

3

Thời gian nhân đôi của rBMMSC không thay đổi

trong suốt quá trình nuôi trong khi ở hASC, rASC,

hBMMSC thời gian này tăng gấp 2

Izadpanah R, Trygg C, Patel B, et al Biologic Properties of Mesenchymal Stem Cells Derived

From Bone Marrow and Adipose Tissue Journal of cellular biochemistry 2006;99(5):1285

Yếu tố phiên mã

Chịu trách nhiệm điều hoà đặc tính sinh

học của tế bào

POU được mã hoá bởi Oct-4

Oct-2 , Sox-2 và Rex 1 điều hoà chặt chẽ trong quá

trình phát triển phôi

Duy trì tính đa tiềm năng của tế bào

Các yếu tố khác (bổ sung từ ngoài): định hướng sự biệt hoá của tế bào

BMP-6, TGF-β3, dexamethasone, ascorbate phosphate, proline, pyruvate, insulin, transferrin, selenous acid, 5aza-cystidine

proteoglycan • Phức hợp nối chặt (Tight junctional complex)

trong tế bào biểu mô cho sự tương tác tế bào-tế bào.

sinh và biệt hóa của tế bào

Experimental Methods 2006

• Cơ chất hay phase mà tế bào phát triển

eg glass, plastic, collagen, agarPhase lỏng

• Các đặc tính sinh lí và lí hóa của thànhphần môi trường nuôi

Phase khíNhiệt độ

Độ vô trùng của môi trường

Pha rắn

di chuyển

matrigel

perhaps promote cell growth and differentiation

by cell contact and substance secreted

Phase lỏng

– Muối vô cơ

– Carbohydrate

Phase lỏng

– Proteins and Peptides

fibronectin

– Amino acids

– Fatty Acids and Lipid

steroids cần thiết cho các tế bào đặc biệt

Phase lỏng

– Vitamin

– Trace Element

Phase lỏng

– Áp suất thẩm thấu

Phase lỏng

– Huyết thanh

giảm rủi ro nhiễm

NAD+ NADH

+ CO2

Pyruvate Dehydrogenase

pyruvate acetyl-CoA

Experimental Methods 2006 32

Hình dạng tế bào khi nuôi

• Hình dạng tế bào khi nuôi cấy ở 2 dạng chính:

– Phát triển huyền phù (như một tế bào đơn hay các cụm nhỏ tế bào)

• Dòng tế bào thu từ máu (leukaemia, lymphoma)

– Phát triển dạng monolayer bám dính vào dụng cụ nuôi

• Tế bào thu từ các mô rắn (lungs, kidney), endothelial, epithelial, neuronal, fibroblasts

Hela-Epithelial

BAE1-Endothelial

Nhiệt độ

– Nhiệt độ tối ưu phụ thuộc vào loài

• Nhiệt độ cơ thể mà tế bào được thu nhận

• Nhiệt độ của của vùng mô thu nhận tế bào (skin temperature may be lower than the rest of the body)

10/9/17 TS Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn