Gần đây các nghiên cứu trên tác dụng chống oxi hoá và tác dụng trên gan của hai cây này đã có một số khảo sát [14], [5] kết quả cho thấy cây Râu mèo, cây Nghể có chứa nhiều hợp chất chốn
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu nghiên cứu
Dược liệu mua ở cửa hàng dược liệu ở quận 5 thành phố Hồ Chí Minh ở dạng khô, được đem xay nhỏ làm nguyên liệu cho quá trình chiết thu cao
Dược liệu sau khi xay nhỏ được kiểm tra độ ẩm bằng máy đo độ ẩm
Cao chiết của cây Nghể và cây Râu mèo được chiết tách tại phòng thí nghiệm của
Bộ môn Dược liệu – Khoa Dược trường ĐH Y Dược thành phố Hồ Chí Minh
Chuột nhắt trắng đực (Mus musculus var.albino) khỏe mạnh, không bị bệnh, nhanh nhẹn, lông mượt, mắt hồng, đuôi nhọn thấy rõ tĩnh mạch, có trọng lượng 20 – 25 g
Chuột dùng cho nghiên cứu được mua từ Viện Pasteur Nha Trang và được nuôi tại Phòng nuôi chuột của Phòng Thí nghiệm, Bộ môn Dược lý, Khoa Dược, Trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh.
Chuột mua về được nuôi ổn định với thức ăn tổng hợp do Viện Pasteur Nha Trang cung cấp trong 7 ngày, cho ăn vào lúc 12 giờ tối và 12 giờ sáng, ở điều kiện thoáng khí, sạch sẽ trong các bocal nhỏ có lót trấu Mỗi bocal nuôi 10 con, nắp bocal có lỗ lưới ở phía trên và nước uống được chứa trong các ống xi-lanh sạch gắn lên nắp để chuột uống nước Thức ăn là cám viên dành riêng cho chuột, đồng thời có cho ăn thêm giá Thay trấu và rửa bocal sạch 2–3 ngày một lần.
3.1.2. Dụ ng cụ, thi ết bị Hình 3.2: Bocal nuôi chuột
Hình 3.1: Nắp lưới, ống uống nước, thức ăn và hóa chất
- Pippette man và đầu típ
- Pippette 1ml, 2ml, 5ml, 10ml
- Ống xi lanh 1ml, 5ml, 10ml
- Bocal và nắp lưới để nuôi chuột
- Kim tiêm cho chuột uống thuốc
- Kéo, kẹp, kim, dao mổ
- Bình định mức 100 ml, 1000 ml
- Máy li tâm Hettich – Mikro 200
- Máy đo quang phổ UV – Vis
- Máy cô quay chân không Buchi
- Máy xác định độ ẩm Sartorius MA 45
- Cholesterol (Bộ môn Sinh hoá)
- EDTA 0,1 % (Bộ môn Sinh hoá)
- ALT (thuốc thử hãng Diagnosticum Rt)
- AST (thuốc thử hãng Elitech).
Phương pháp nghiên cứu
Trong bài viết này, mô tả hình thái thực vật tại nơi mọc được thực hiện chi tiết từ các bộ phận chính như lá, thân, hoa và quả, nhằm làm rõ đặc điểm nhận diện loài Việc đối chiếu với các hình ảnh tham khảo và tài liệu thực vật học giúp kiểm chứng và hiệu chỉnh các mô tả quan sát Đồng thời, mẫu cây được so sánh với mẫu cây ở vườn dược liệu thuộc khoa Dược trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh để đánh giá mức độ đồng nhất về hình thái giữa điều kiện tự nhiên và môi trường thực nghiệm Kết quả cho thấy sự nhất quán giữa mô tả nơi mọc, hình ảnh tham khảo và tài liệu thực vật học với mẫu cây tại vườn dược liệu, tăng cường độ tin cậy của nhận diện và bổ sung dữ liệu cho giảng dạy và nghiên cứu dược liệu tại trường.
- Độ tinh khiết: theo các chuyên luận ghi trong DĐVN III.
- Độ ẩm: theo phụ lục 5.16 trong DĐVN III.
Trong quá trình chiết xuất thông thường, các tiểu phần chất rắn tiếp xúc với dung môi ở điều kiện nhất định và các chất tan sẽ hòa tan hoàn toàn để hình thành dung dịch chiết Sự hòa tan này ít bị ảnh hưởng bởi các chất không tan Vì các chất tan nằm trong tế bào bị ngăn cách bởi vách tế bào bằng cellulose, sau khi hòa tan vào dung môi chúng vẫn phải vượt qua lớp vách này mới thoát ra vào dịch chiết Quá trình chiết các chất tan từ tổ chức sinh học như vậy thường được gọi là chiết xuất.
* Phương pháp chiết xuất: đun hồi lưu
Tóm tắt phương pháp: Cân mẫu cho vào bình tam giác
Quy trình gồm ngâm nguyên liệu trong dung môi và đun hoàn lưu trong 30 phút, lặp lại 3 lần Tiếp theo lọc qua phễu thủy tinh và xử lý dịch lọc bằng cách loại bỏ dung môi ở áp suất giảm cho đến khi thu được cao rắn.
* Điều chế cao Ethyl acetat (EtOAc)
Cân khoảng 100 g dược liệu cho vào bình nón nút mài 250ml
Ngâm mẫu trong 200 ml dung môi ethanol 96% và tiến hành đun hồi lưu trong vòng 60 phút kể từ lúc dung môi sôi, thực hiện liên tục 4 lần Sau đó lọc qua phễu thủy tinh và lặp lại quá trình lọc 3 lần để hoàn thiện quá trình xử lý.
Dịch chiết sẽ được gộp lại và thu hồi dung môi dưới áp suất giảm để thu được cao cồn toàn phần
Ta hòa tan toàn phần hỗn hợp MeOH–H2O theo tỉ lệ 1:4 để thu được dịch MeOH–H2O Dịch MeOH–H2O được lắc với dung môi CHCl3 để chiết CHCl3 cho tới khi thử 1 ml dịch CHCl3 không còn bám trên mặt kính đồng hồ Dịch CHCl3 sau chiết được cô đặc dưới áp suất giảm để thu được cao CHCl3.
Dịch chiết MeOH–H2O còn lại sau khi lắc CHCl3 được lắc tiếp với Ethyl acetate để chiết EtOAc Quá trình chiết được lặp lại cho đến khi thử 1 mL dịch chiết không còn bám trên bề mặt kính đồng hồ Dịch chiết được thu hồi và cô đặc dưới áp suất giảm để thu được EtOAc cô đặc.
Sơ đồ tóm tắt quy trình điều chế cao Ethyl acetat (EtOAc) (xem sơ đồ 4.1)
* Xác định hiệu suất cao thu được
Hiệu suất cao thu được (H %)
H % m cao: khối lượng cao thu được (g) m dl : khối lượng dược liệu đem chiết (g) w dl: độ ẩm của dược liệu đem chiết (%)
* Kiểm tra các phân đoạn cao chiết
Về mặt cảm quan: Màu sắc, mùi vị,… m cao m dl – (m dl x w dl ) x 100%
3.2.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát sơ bộ nồng độ gây độc của CCl 4
Chuột được chia làm 6 lô (mỗi lô 6 con), được cho uống CCl4 với các nồng độ tương ứng: 100 %, 50 %, 30 %, 25 %, 20 %, 10 %
- Pha CCl 4 với dầu thực vật thành các nồng độ nói trên
- Cho chuột nhịn ăn 18 giờ rồi cho uống dung dịch CCl4 Sau khi uống cho chuột ăn uống bình thường
- Quan sát và theo dõi ghi nhận hành vi, biểu hiện và sự sống chết của chuột trong các lô sau khi gây độc và sau 24 giờ
3.2.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát độc tính của cao chiết
Cao EtOAc của cây Râu mèo và cây Nghể được pha ở nồng độ cao nhất có thể
Để khảo sát độc tính của cao chiết EtOAc, chuột được dùng ở liều 500 mg/kg thể trọng Thí nghiệm được chia thành 2 lô, mỗi lô 6 con, ứng với cao EtOAc từ cây Râu mèo và cao EtOAc từ cây Nghể.
- Pha cao chiết với 10 % DMSO và nước cất thành các nồng độ nói trên
- Cho chuột nhịn ăn 18 giờ rồi cho uống dung dịch cao EtOAc Sau khi uống cho chuột ăn uống bình thường
- Quan sát và theo dõi ghi nhận hành vi, biểu hiện và sự sống chết của chuột trong các lô sau 24 giờ.
3.2.3.3.Thí nghiệm 3: Sàng lọc cao EtOAc của cây Râu mèo và cây Nghể
* Nguyên tắc sàng lọc tác dụng ức chế xơ gan trên mô hình chuột nhiễm độc CCl 4 invivo
- Tiến hành gây xơ gan thú thử nghiệm bằng CCl4 và chế độ ăn uống giàu lipid – ethanol trong 8 tuần [11]
Trong nghiên cứu này, chuột bị xơ gan được cho dùng thuốc thử nghiệm hàng ngày từ khi bắt đầu cho uống CCl4 cho đến khi kết thúc thí nghiệm Sau 3 ngày kể từ liều CCl4 cuối cùng, máu đuôi được lấy từ chuột ở các lô thử nghiệm và lô đối chứng để đo ALT, AST nhằm theo dõi tác dụng hạ enzym gan của mẫu thử Sau đó, chuột được mổ để lấy gan và tiến hành xét nghiệm mô học, nhằm đánh giá sự hình thành xơ gan trên chuột trong thời gian thử nghiệm.
Thí nghiệm được thực hiện trên mô hình in vivo trên gan chuột bị gây xơ bằng
Chuột được chia làm 3 lô
- Lô 1: Lô chứng trắng (kí hiệu Lo), chỉ cho uống nước và ăn thức ăn tổng hợp
- Lô 2: Lô độc (kí hiệu Lđ), gây xơ
Đây là một mô hình xơ gan ở chuột nhắt trắng đực khỏe mạnh, được gây tổn thương gan bằng phơi nhiễm với một chất gây độc gan và kèm theo chế độ ăn giàu chất béo và cholesterol, cùng với điều chỉnh khẩu phần nước uống theo chu kỳ Sau tám tuần, mẫu máu được lấy để đánh giá các chỉ số enzym gan và gan chuột được mổ để làm xét nghiệm mô học nhằm xác định mức độ xơ hóa và tổn thương gan Nghiên cứu giúp hiểu rõ cơ chế bệnh sinh của xơ gan ở mô hình động vật và cung cấp các chỉ số sinh hóa và hình thái học liên quan để làm cơ sở cho các can thiệp y tế.
- Lô 3: Lô thử (kí hiệu L), gây xơ gan và dùng cao EtOAc của cây Râu mèo và cây Nghể hàng ngày.
Hình 3.3: Cho chuột uống thuốc
* Lấy máu ở đuôi chuột (Hình 3.4)
Một bài viết chuẩn SEO về lấy mẫu máu chuột nên nhấn mạnh tính đạo đức và an toàn trong thí nghiệm: động vật được xử lý nhẹ nhàng, quy trình được thực hiện bởi người có trình độ và trong môi trường giám sát; ưu tiên các biện pháp giảm đau hoặc gây mê phù hợp và tìm kiếm các phương pháp thay thế khi có thể; mọi dụng cụ được vô trùng và tuân thủ các quy định của cơ quan quản lý; dữ liệu thu được phải tin cậy và phản ánh đúng kết quả nghiên cứu mà không làm tổn thương động vật quá mức.
- 0,1 ml máu chuột được hòa trong EDTA 0,1 % (1:5) để tránh đông máu
- Li tâm 1500 vòng/phút trong 10 phút để lấy huyết tương
- Kết quả được tính toán và xử lý theo mục 4.1.3
* Mổ chuột lấy gan (Hình 3.5)
- Gây mê chuột bằng ether.
- Cố định chuột trên bàn mổ
- Tách gan ra khỏi cơ thể chuột
- Rửa gan trong dung dịch NaCl 0,9 %
Gan đã được rửa sạch và ngâm trong dung dịch formol 10% Sau đó, mẫu được gửi đến bộ môn Giải phẫu học của Trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, cơ sở ở Hồng Bàng, Quận 5, để tiến hành giải phẫu vi thể.
* Các thuốc thử dùng để đo hoạt lực enzym gan
• Đo hoạt lực enzym gan ALT
ALT (alanin aminotransferase) là một enzym tồn tại chủ yếu trong bào tương tế bào và tham gia vào quá trình chuyển nhóm amin giữa các amino acid và alpha-ketoacid; quá trình này được kích hoạt bởi pyridoxal phosphate Enzym ALT được tìm thấy chủ yếu ở gan và thận, và nồng độ ALT trong huyết thanh tăng lên khi gặp các bệnh về gan.
ALT xúc tác biến đổi L-alanine và 2-oxoglutarate ở pH tối ưu; pyruvate được hình thành và bị lactate dehydrogenase (LDH) chuyển đổi thành L-lactat nhờ sự có mặt của coenzyme NADH/NAD+, quá trình oxi hóa khử NADH/NAD+ làm giảm độ hấp thu tại bước sóng 340 nm Sự thay đổi độ hấp thu này tương đương với hoạt độ ALT trong huyết tương.
• Đo hoạt lực enzym gan AST
AST (aspartate aminotransferase) là một enzyme hiện diện ở nhiều mô trên cơ thể, đặc biệt hoạt động mạnh ở tim, cơ xương, gan và thận Khi tổn thương mô xảy ra, nồng độ AST trong máu tăng lên và có thể gặp ở các bệnh như viêm gan do virus, nhồi máu cơ tim hoặc hoại tử tế bào gan Kết quả xét nghiệm AST thường được đánh giá cùng với ALT để xác định nguyên nhân gây bệnh gan; mức tăng AST cho thấy sự tổn thương ở gan hoặc các cơ quan liên quan Ngược lại, AST thấp có thể cho thấy thiếu vitamin B6.
AST, hay aspartate aminotransferase, là enzyme xúc tác chuyển đổi nhóm amino trong sự chuyển hóa amino acid và α-ketoacid, đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất của tế bào Sau nhồi máu cơ tim, hoạt lực của AST tăng lên sau 4–8 giờ, đạt cao nhất vào 2–3 ngày và giảm dần trong 5–6 ngày tiếp theo.