kl dang ngoc tu 912104s

Lịch sử và những thành tựu đạt được trong nuôi cấy in vitro Haberlandt là người đầu tiên thực hiện nuôi cấy tế bào thực vật vào năm 1902 trên đối tượng cây một lá mầm nhưng không thành

T ỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐÔNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA H ỌC ỨNG DỤNG

ii

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận này được hoàn thành với sự quan tâm giúp đỡ rất nhiều của các thầy cô, các anh chị và các bạn Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

 Ban giám hiệu trường Đại Học Tôn Đức Thắng, Ban chủ nhiệm Khoa Khoa học ứng dụng và Bộ môn Công Nghệ sinh học, cùng tất cả các quý thầy cô

đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trường

 Thạc sĩ Hà Thị Loan , người đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện để em thực hiện khóa luận này

 Anh Nguyễn Phúc Trường, người trực tiếp hướng dẫn, chỉ dạy và luôn động viên em trong những hoàn cảnh khó khăn nhất Đề tài này được hoàn thành

với rất nhiều nhiệt tình và tâm huyết của anh

 Em cảm ơn anh Quân , chị Vi, chị Thảo và các anh chị phòng Công nghệ sinh học Thực vật , thuộc Trung tâm Công Nghệ Sinh Học TP HCM Cảm ơn vì những giúp đỡ nhiệt tình của các anh chị trong suốt thời gian em thực tập

 Cảm ơn lớp 09sh thân yêu và các bạn thân đã cùng tôi chia sẻ tất cả những nỗi buồn vui suốt bốn năm đại học

 Và trên hết, con cảm ơn bố mẹ, em trai yêu quý đã luôn chăm lo , ủng hộ, tin tưởng con , cảm ơn cả nhà vì đã cho con chỗ dựa vững chắc nhất trong cuộc

sống

Tháng 12/2009 Đặng Ngọc Tú

iii

TÓM TẮT

Đặng Ngọc Tú, Đại học Tôn Đức Thắng TP.HCM, tháng 12/2009 “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH PROTOCORM-LIKE BODIES GIỐNG LAN

RENANTANDA “RED NUMBER ONE””

Giáo viên hướng dẫn: Thạc sĩ Hà Thị Loan

Đề tài được thực hiện tại phòng Công nghệ sinh học Thực vật – Trung tâm Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Thời gian thực hiện từ tháng 9 đến tháng 12 năm 2009

Cùng với sự phát triển về kinh tế-xã hội, nhu cầu về hoa lan, cây kiểng trang trí

để phục vụ hội nghị, đám tiệc, cưới hỏi, sinh nhật… và các nhu cầu giải trí khác ngày càng nhiều trong khi thành phố không có khả năng đáp ứng đủ nhu cầu phục vụ nên có

một lượng hoa lan rất lớn phải nhập khẩu từ nước ngoài, đa phần từ Thái Lan Để có

thể phát triển được ngành trồng hoa lan, trước mắt chúng ta cần phải chủ động được nguồn giống, dần dần không phải nhập giống, lai tạo ra một số giống có chất lượng cao để cung cấp cho thị trường trong nước và sau đó hướng tới xuất khẩu sang các thị trường khác Ngoài ra, kỹ thuật nhân nhanh bằng nuôi cấy mô đang là công cụ đắc lực

để giúp chúng ta có thể có đủ giống trong một thời gian ngắn Từ những nhu c ầu cần thiết, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng nhân nhanh protocorm -like

bodies trên giống lan Renantanda “red number one””

Kết quả đạt được sau các thí nghiệm:

 Môi trường thích hợp cho việc nhân nhanh PLBs của giống lan

Renantanda “red number one” là môi trường khoáng cơ bản MS có bổ sung nồng độ

BA 1 mg/l và nồng độ NAA 0,1 mg/l Ngoài ra, có thể tạo chồi cho giống lan này bằng cách sử dụng môi trường khoáng cơ bản MS mà không cần bổ sung chất điều hòa sinh trưởng

 Qua 2 phương pháp nuôi cấy trên hệ thống ngập chìm tạm thời và trên môi trường có agar, chúng tôi nhận thấy: hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đã hội

đủ những điều kiện cần thiết cho việc nhân nhanh PLBs một cách tối ưu, như thời gian ngập không quá lâu , thoáng khí tốt giúp PLB s ít bị thủy tinh thể , cây tăng cường khả

iv năng quang hợp nên PLBs phát triển khá đều đặn, trọng lượng tăng nhanh, số PLBs và số chồi tạo ra được nhiều hơn so với khi nuôi cấy trên môi trường agar

M ỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn ii

Tóm tắt luận văn iii

Mục lục v

Danh mục chữ viết tắt viii

Danh sách các chất và môi trường thí nghiệm viết tắt ix

Danh mục bảng x

Danh mục hình xi

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích 2

1.3 Mục tiêu 2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về kỹ thuật nuôi cấy mô 3

2.1.1 Lịch sử và những thành tựu đạt được trong nuôi cấy in vitro 3

2.1.2 Đặc điểm kỹ thuật nuôi cấy in vitro 4

2.1.2.1 Ưu nhược điểm của phương pháp nuôi cấy in vitro 4

2.1.2.2 Tầm quan trọng 5

2.1.2.3 Ý nghĩa 5

2.1.3 Các phương pháp nuôi cấy mô hiện nay 6

2.1.3.1 Nuôi cấy mô tế bào thực vật trên giá thể agar 6

2.1.3.2 Nuôi cấy mô tế bào thực vật trong môi trường lỏng 6

2.1.3.3 Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời 7

2.1.4 Môi trường nuôi cấy in vitro 12

2.1.4.1 Khoáng đa lượng 12

2.1.4.2 Khoáng vi lượng 13

2.1.4.3 Vitamin 13

2.1.4.4 Các chất điều hòa sinh trưởng và vai trò của chúng trong vi nhân giống 13

2.1.4.5 Ảnh hưởng của pH 16

vi

2.1.4.6 Carbon và nguồn năng lượng 17

2.1.4.7 Các hợp chất hữu cơ bổ sung không xác định 18

2.1.4.8 Amino acid và các nguồn cung cấp Nitrogen khác 19

2.1.4.9 Than hoạt tính 19

2.1.4.10 Yếu tố làm đặc môi trường 19

2.2 Giới thiệu về giống lan Renanthera và Renantanda “red number one” 20

2.2.1 Sơ lược về giống lan Renanthera 20

2.2.2 Một số giống lan Renanthera 21

2.3 Tình hình nhân giống lan Renantanda 29

2.3.1 Nhân gi ống ngoài tự nhiên 29

2.3.1.1 Phương pháp tách chiết 29

2.3.1.2 Sự nảy mầm của hạt 29

2.3.2 Phương pháp in-vitro 29

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 30

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm 30

3.2 Nội dung nghiên cứu 30

3.3 Vật liệu thí nghiệm 30

3.3.1 Đối tượng nghiên cứu 30

3.3.2 Trang thi ết bị thí nghiệm 31

3.3.2.1 Phòng chuẩn bị môi trường 31

3.3.2.2 Phòng cấy 31

3.3.2.3 Phòng tăng trưởng 31

3.3.3 Hóa ch ất và môi trường thí nghiệm 32

3.3.4 Điều kiện nuôi cấy 33

3.4 Bố trí thí nghiệm 33

3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng lên khả năng nhân nhanh protocorm-like bodies (PLBs) 33

3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng nhân nhanh PLBs trên môi trường nuôi cấy agar và hệ thống ngập chìm tạm thời 34

3.5 Phương pháp xử lý số liệu 36

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của các chất điề u hòa sinh trưởng lên khả

năng nhân nhanh PLBs 37

4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng nhân nhanh PLBs trên môi trường nuôi cấy agar và hệ thống ngập chìm tạm thời 42

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48

5.1 Kết luận 48

5.2 Đề nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

PHỤ LỤC 1

PHỤ LỤC 2

PHỤ LỤC 3

PHỤ LỤC 4

ix

DANH MỤC CÁC CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG THÍ

NGHI ỆM VIẾT TẮT

BA 6-benzyl aminopurine

CW Nước dừa (Coconut water)

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

IBA β –indole butyric acid

MS Murashige – Skoog, 1962

NAA α-naphthaleneacetic acid

x

DANH MỤC BẢNG

B ảng 3.1 Ảnh hưởng của việc thay đổi nồng độ các chất điều hòa sinh trư ởng BA và

NAA, kết hợp với nồng độ cố định nước dừa, sucrose lên sự tăng sinh PLBs

B ảng 3.2 Khả năng nhân nhanh PLBs khi nuôi cấy trên hệ thống nuôi cấy ngập ch ìm

tạm thời và trên môi trường agar ở các thể tích nuôi cấy 200ml và 250ml

B ảng 4.1 Kết quả của thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ các chất điều h òa sinh

trưởng BA và NAA đến khả năng nhân nhanh PLBs

B ảng 4.2 Kết quả thí nghiệm khảo sát khả năng nhân nhanh PLBs trên hệ thống nuôi

cấy ngập chìm tạm thời và môi trường agar ở các thể tích 200 ml và 250 ml

xi

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1: Mẫu PLBs tiến hành nuôi cấy trên môi trường khoáng cơ bản MS không bổ sung BA và NAA

Hình 3.2: Mẫu PLBs tiến hành thí nghiệm trên môi trường nuôi cấy agar

Hình 3.3: Mẫu PLBs tiến hành thí nghiệm trên h ệ thống nuôi cấy ngập chìm

tạm thời

Hình 4.1: Mẫu kết quả thu được sau nuôi cấy 2,5 tháng ở môi trường khoáng

cơ bản MS không bổ sung BA và NAA

Hình 4.2: Mẫu kết quả thu được sau nuôi cấy 2,5 tháng ở môi trường khoáng

cơ bản MS bổ sung BA nồng độ 1mg/l và NAA nồng độ 0,1 mg/l

Hình 4.3: Mẫu kết quả thu được sau nuôi cấy 2,5 tháng ở môi trường khoáng

cơ bản MS bổ sung BA nồng độ 1mg/l và NAA nồng độ 0,5 mg/l

Hình 4.4: Mẫu kết quả thu được sau nuôi cấy 2,5 tháng ở môi trường khoáng

cơ bản MS bổ sung BA nồng độ 2mg/l và NAA nồng độ 0,1 mg/l

Hình 4.5: Mẫu kết quả thu được sau nuôi cấy 2,5 tháng ở môi trường khoáng

cơ bản MS bổ sung BA nồng độ 2mg/l và NAA nồng độ 0,5 mg/l

Hình 4.6: PLBs thu được ở nghiệm thức 2 có bổ sung BA 1 mg/l và NAA 0,1 mg/l sau 2,5 tháng nuôi cấy

Hình 4.7: Kết quả thu được sau 2,5 tháng nuôi cấy trên hệ thống ngập chìm tạm thời ở thể tích 250 ml

Hình 4.8: Kết quả thu được sau 2,5 tháng nuôi cấy trên hệ thống ngập chìm tạm thời ở thể tích 200 ml

Hình 4.9: Kết quả thu được sau 2,5 tháng nuôi cấy trên agar ở thể tích 250 ml

Hình 4.10: Kết quả thu được sau 2,5 tháng nuôi cấy trên agar ở thể tích 200 ml

Hình 4.11: PLBs thu nhận được ở nghiệm thức 6 nuôi cấy trên hệ thống ngập chìm tạm thời với môi trường khoáng cơ bản MS có bổ sung BA 1mg/l và NAA 0,1mg/l ở thể tích 250ml

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Thành phố Hồ Chí Minh là một trung tâm kinh tế, thương mại, văn hóa, khoa học

kỹ thuật lớn nhất khu vực phía Nam và là nơi trọng điểm thứ hai của cả nước Thành

phố có diện tích tự nhiên là hơn 2095 km2, gồm 24 quận huyện Trong đó khu vực nội thành có diện tích 494 km2, chiếm 24% diện tích tự nhiên với 84% dân số cả thành

phố, còn khu vực ngoại thành có diện tích đất rất lớn 1601 km2

Cùng với sự phát triển về kinh tế-xã hội, nhu cầu về hoa lan, cây kiểng trang trí

để phục vụ hội nghị, đám tiệc, cưới hỏi, sinh nhật… và các nhu cầu giải trí khác ngày càng nhiều trong khi thành phố không có khả năng đáp ứng đủ nhu cầu phục vụ nên có

một lượng hoa lan rất lớn phải nhập khẩu từ nước ngoài, đa phần từ Thái Lan

, nhưng dân số chỉ có 16% dân số toàn thành phố

Nắm bắt được nhu cầu của thị trường, lãnh đạo thành phố đã chủ động chuyển đổi cơ cấu cây trồng: thay các cây trồng có hiệu quả kém sang các cây trồng có hiệu

quả kinh tế cao Nên trong những năm gần đây, cây lan đượ c chọn để trồng nhiều nơi trong thành phố mà tập trung nhiều là các huyện ngoại thành như Củ Chi, Hóc Môn, Bình Chánh… Chủng loại lan trồng thì rất phong phú, nhưng lan trồng cắt cành thì chỉ

chủ yếu là hai giống Mokara và Dendrobium, một số ít giống Renanthera Thái Lan và

giống lan lai từ loài lan này là lan Renantanda Hiện nay thị trường có các giống

Renantanda storieis, Renantanda Azimah, Renantanda Kalsum… Nhưng nổi bật nhất

là Renantanda “Red Number One” do dáng cây to, cây khỏe, hoa có màu đỏ nhung đẹp, nhiều phát hoa phân nhánh, cây ít bệnh nên được một số nhà vườn ưa chuộng

trồng làm lan cắt cành và bán chậu Tuy nhiên, giống lan này hiện nay vẫn còn rất hạn

chế, giá tiền cây còn rất cao do phải nhập khẩu từ Thái Lan và số lượng cây giống của loài lan này ở TP Hồ Chí Minh cũng rất ít

Để có thể phát triển được ngành trồng hoa lan, trước mắt chúng ta cần phải chủ động được nguồn giống, dần dần không phải nhập giống, lai tạo ra một số giống có

chất lượng cao để cung cấp cho thị trường trong nước và sau đó xuất khẩu Ngoài ra,

kỹ thuật nhân nhanh bằng nuôi cấy mô đang là công cụ đắc lực để giúp chúng ta có thể

có đủ giống trong một thời gian ngắn Như vậy, trong nước chúng ta cần phải có thêm nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô có quy mô lớn, chất lượng cao để có thể đáp ứng được nhu cầu nhân giống

Từ những nhu cầu cần thiết , chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năn g nhân nhanh protocorm-like bodies trên giống lan Renantanda “red number one””

1.2 Mục đích

Nghiên cứu khả năng nh ân nhanh protocorm-like bodies Renantanda “red

number one” để tạo nguồn nguyên liệu phục vụ cho nghiên cứu và sản xuất

1.3 M ục tiêu

Xác định được nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho sự hình thành PLBs ở Renantanda “red number one”

Khảo sát sự nhân nhanh PLB s của Renantanda “red number one” trên môi

trường agar và hệ thống ngập chìm tạm thời

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về kỹ thuật nuôi cấy mô

2.1.1 Lịch sử và những thành tựu đạt được trong nuôi cấy in vitro

Haberlandt là người đầu tiên thực hiện nuôi cấy tế bào thực vật vào năm 1902

trên đối tượng cây một lá mầm nhưng không thành công vì đối tượng này khó nuôi cấy

in vitro và mẫu cấy mất hết khả năng tái sinh

- Năm 1934, White đã thành công trong việc phát hiện ra sự sống vô hạn của việc nuôi cấy tế bào của cà chua

- Năm 1964, Ball là người đầu tiên tìm ra mầm rễ từ việc nuôi cấy chồi ngọn Ông đã thành công trong việc chuyển cây non của cây sen cạn và cây white -lupin từ môi trường nuôi cấy tối thiểu Tuy nhiên, việc nhân giống cây vẫn chưa hoàn thiện Sau đó nhiều nhà nghiên cứu đã khám phá ra những thành phần dinh dưỡng quan trọng

cần thiết cho sự phát triển của các tế bào được nuôi cấy như White (1951), Gauthere (1939), Van Overbeck (1941), Steward và Caplin (1951)

- Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển sự nhân chồi

- Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy đánh dấu một bước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô Môi trường của họ đã được dùng làm cơ sở cho

việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn còn được sử dụng rộng rãi cho đến nay

- Năm 1960 – 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng cách nuôi

cấy đỉnh sinh trưởng Từ kết quả đó, lan được xem là cây nuôi cấy mô đầu tiên được thương mại hóa Từ đó đến nay, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được phát triển với tốc độ nhanh trên nhiều cây khác (Haramaki, 1971; Murashige, 1972; Miller

và Muashige, 1976) và được ứng dụng thương mại hóa

Nhân giống in vitro bắt đầu được ứng dụng vào thập niên 1960 và đầu những

năm 1970 kéo theo sự phát triển của các vườn ươm thương mại trong thập niên 1970 ở Hoa Kỳ, Châu Âu, Úc và Châu Á Hiện nay và tương lai , sự phát triển của nuôi cấy

mô phụ thuộc vào sự thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp , sự giảm giá thành sản xuất và sự tác động giữa sản xuất với thị trường tiêu thụ

2.1.2 Đặc điểm kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Nhân giống in vitro hay nuôi cấ y mô đều là thuật ngữ mô tả các phương thức

nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều

kiện vô trùng Môi trường chứa các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, các hormone tăng trưởng và đường Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh

chồi, cơ quan từ các mô như: lá, thân, hoa, rễ

Trước kia người ta dùng phương pháp nuôi cấy tế bào và mô thực vật để nghiên

cứu về đặc tính cơ bản của tế bào như sự phân chia, sự di truyền và tác dụng của các hóa chất đối với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy

Ngày nay, phương pháp nuôi cấy mô thực vật đã hướng về ứng dụng thực tiễn, vì

nó liên hệ mật thiết với các giống cây trồng Các nhà thực vật học đã áp dụng phương pháp này với mục đích: tạo được một quần thể lớn, đ ồng nhất trong một thời gian

ngắn, với diện tích thí nghiệm nhỏ, có điều kiện hóa lý kiểm soát được; tạo được nhiều cây con từ mô và cơ quan của cây (lóng, thân, phiến lá, hoa, hạt phấn, chồi phát hoa…) mà ngoài thiên nhiên không thực hiện được; làm sạch n guồn virus cho cây

bằng cách cấy mô phân sinh ngọn; cải tiến các giống cây trồng bằng công nghệ sinh

học; (Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên - 2006)

2.1.2.1 Ưu nhược điểm của phương pháp nuôi cấy in vitro

a Ưu điểm

- Hệ số nhân giống cao: từ một mẫu cây sạch bệnh ban đầu có thể nhân nhanh và cung cấp một lượng giống lớn trong thời gian ngắn trên một quy mô mặt bằng nhỏ

- Có thể tạo được các giống đồng nhất về mặt di truyền

- Tất cả các bộ phận của cây đều có thể làm vật liệu nhân giống

- Chất lượng giống cao: bằng phương pháp nuôi cấy mô phân sinh, kết hợp với

một số biện pháp xử lý nhiệt, xử lý hoá chất có thể làm sạch bệnh trên giống và tái tạo nguồn giống sạch bệnh cho sản xuất

- Khắc phục được đặc tính khó nhân giống và tính bất thụ ở một số cây trồng

- Có thể nhân giống quanh năm, hoàn toàn có thể tự động trong việc lập kế hoạch

sản xuất, cung cấp giống

- Các tập đoàn giống và giống sản xuất, được lưu trữ trong điều kiện vô trùng, cách ly hoàn toàn với các nguồn bệnh

- Các đột biến trong quá trình nuôi cấy mô có thể tạo thuận lợi trong công tác

chọn giống

b Nhược điểm

- Kiểu gen thực vật không được ổn định trong một số hệ thống nuôi cấy

- Việc cảm ứng rễ với đối tượng cây thân gỗ gặp nhiều khó khăn

- Việc chuyển cây từ trong ống nghiệm ra vườn ươm rất khó đối với một số cây

- Khả năng tái sinh cây có thể bị mất đi do việc cấy chuyền mô sẹo và huyền phù

tế bào được lặp lại nhiều lần

- Đối với một số mô, việc vô trùng trước khi đưa vào cấy rất khó thực hiện

- Phương pháp nhân giống in vitro tốn nhiều công lao động làm cho giá thành

cây tăng lên

2.1.2.2 T ầm quan trọng

Phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để phục tráng và nhân nhanh các giống cây trồng quý, có giá trị kinh tế cao Hiện nay, phương pháp nhân giống vô tính thực

vật trong ống nghiệm đã trở thành kỹ thuật nông nghiệp phổ biến

Phương pháp nuôi cấy mô còn có triển vọng sử dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học Bằng phương pháp này chỉ sau một thời gian ngắn, chúng ta có thể tạo được

một lượng sinh khối lớn, có hoạt chất sinh học như alkaloid, glycoside, các steroid (dùng trong y học), chất dính dùng trong cộng nghiệp thực phẩm, những chất kìm hãm

sự sinh trưởng của vi khuẩn trong nông nghiệp

2.1.2.3 Ý ngh ĩa

Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có ý nghĩa vô cù ng to lớn đối với việc nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản , đồng thời nó có giá trị đóng góp trực tiếp cho thực tiễn sản xuất và đời sống

Ý nghĩa thực tiễn quan trọng nhất của nuôi cấy mô tế bào là áp dụng kỹ thuật sản

xuất đại trà có kiểm soát trong tạo giống và nhân giống cây trồng

Những lợi ích trong việc áp dụng nuôi cấy mô trong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp gồm: kiểm soát được dịch bệnh cây trồng; kiểm soát được chất lượng giống thông qua kiểm soát kiểu gene của giống đem vào sản xuất; kiểm soát được toàn bộ kỹ thuật từ khâu nhân giống đến khâu thu hoạch; tạo ra sự đồng đều về giống, từ đó tạo ra

sự đồng nhất của sản phẩm cuối cùng do đó năng suất lao động tăng lên, chất lượng

sản phẩm đồng nhất, thuận lợi cho việc cơ giới hóa nông nghiệp

Nuôi cấy mô đã đem lại hiệu quả to lớn trong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp Đây thực sự đã và đang là cuộc cách mạng xanh trong ngành trồng trọt

(Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên – 2006)

2.1.3 Các phương pháp nuôi cấy mô hiện nay

Có rất nhiều phương pháp nuôi cấy mô đã được phát triển trong thời gian qua Dựa trên các giá thể mà người ta chia làm các phương pháp sau:

2.1.3.1 Nuôi cấy mô tế bào thực vật trên giá thể agar

Năm 1934, nhà khoa học người Pháp Roger Gautheret nuôi cấy callus từ mô thượng tầng lấy từ một số cây gỗ như cây Liễu (Willow), cây Sung Dâu (Sycamore) và cây Cơm Cháy (Elder) Đây là lần đầu tiên thu được những callus có sự phân chia nhưng chúng chỉ sốn g được trên mô i trường dinh dưỡng với giá thể agar Ông quả quyết đã thiếu một chất gì đó có khả năng duy trì sự sinh trưởng một cách không giới hạn của tế bào thực vật trong môi trường nuôi cấy

Năm 1939, hai nhà khoa học n gười Pháp R Gautheret và P Nobercourt nghiên cứu trên đối tượng tế bào cà -rốt đã sử dụng hormone sinh trưởng thực vật mới phân lập được là auxin để tạo callus có khả năng sinh trưởng không giới hạn Và một nhà khoa học người Mỹ P.R.White cũng đồng thời nghiên cứu trên cây thuốc lá vào năm

1939

Tùy vào loài cây và giai đoạn , mục đích nhân giống khác nhau mà những loại môi trường nuôi cấy khác nhau được sử dụng Hiện nay môi trường được sử dụng p hổ biến nhất là MS cho nhiều loại cây khác nhau , ngoài ra còn có một số môi trường khác như môi trường B5 (Gamborg và cộng sự, 1968), Knudson C (Knudson, 1946), Vacin-Went (Vacin and Went, 1949) cũng được dùng rộng rãi (Cung Hoàng Phi Phượng - 2006)

2.1.3.2 Nuôi cấy mô tế bào thực vật trong môi trường lỏng

Bằng phương pháp truyền thống thì sự tái sinh mô thực vật thường được thực hiện bằng cách cho mô thực vật phát triển trên môi trường agar hay nói cách khác là phần lớn các quy trình nuôi cấy mô thường áp dụng việc điều chỉnh hợp lý tỉ lệ giữa

auxin và cytokinin trên môi trường rắn hoặc bán rắn để kích thích sự thành lập của callus, somatic embryos , chồi và rễ… Tuy nhiên , có nhiều giới hạn của môi trường nuôi cấy với agar đã và đang được phát hiện , trong đó quan trọng nhất lá việc môi trường này có sự hình thành các độc tố quanh mô nuôi cấy sau khi đã sử dụng cạn kiệt chất dinh dưỡng có trong môi trường

Do những hạn chế của việc nuôi cấy trên môi trường thạch , nhiều nhà khoa học

đã hướng đến việc sử dụng kỹ thuật nuôi cấy trên môi trường lỏng Nuôi cấy trên môi trường lỏng ở đây có nhiều khía cạnh như nuôi cấy huyền phù tế bào để nhân sinh khối

và nuôi cấy để tái sinh cơ quan Khi nuôi cấy trong môi trường lỏng toàn bộ bề mặt mẫu cấy tiếp xúc với môi trường giúp nâng cao sự phân chia tế bào và tái sinh cơ quan, gia tăng hệ số nhân chồi, rễ, củ và phôi soma Nhờ nuôi cấy trong môi trường lỏng, nồng độ các chất trong môi trường đồng nhất cho mô thực vật và các hợp chất độc trong môi trường xung quanh mô nuôi cấy bị biến đổi nhanh chóng trước khi có thể ảnh hưởng đến mô

Khi nuôi cấy trên môi trường lỏng , mẫu cấy có thể được cấy trực tiếp vào trong môi trường lỏng hay sử dụng cầu giấy lọc , bình nuôi cấy có thể đặt trên máy lắc hoặc không Môi trường được sử dụng tron g nuôi cấy lỏng cũng tương tự trong nuôi cấy trên thạch, chỉ có khác là không bổ sung agar vào trong môi trường nuôi cấy , do đó các bước chuẩn bị môi trường và tiến hành cấy mẫu cũng gần như tương tự khi nuôi cấy trên môi trường thạch

Hiện nay, nuôi cấy trong môi trường lỏng thường được sử dụng nhằm mục đích nâng cao hệ số nhân chồi , PLBs, rễ, củ, nâng cao khả năng phát sinh phôi ở nhiều loài thực vật (Dương Tấn Nhựt và ctv - 2004) Tuy nhiên nếu chỉ với việc nuôi cấy đơn thuần trong môi trường lỏng , mô cấy sẽ bị nhận chìm xuống nước , kết quả là sẽ tạo ra

sự nghèo thoáng khí, có khi làm mô thực vật chết đi , có hiện tượng trương nước , thủy tinh thể Hiện nay, có nhiều giải pháp để khắc phục tình trạng này thông qua một số hệ thống nuôi cấy dựa trên việc sử dụng môi trường nuôi cấy lỏng như : hệ thống Bioreactor, hệ thống ngập chìm tạm thời… (Cung Hoàng Phi Phượng - 2006)

2.1.3.3 Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời

Để khắc phục những nhược điểm của hệ thống nuôi cấy lỏng , Teisson và cộng

sự của ông đã đề ra những điều kiện cần có cho hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời như sau:

• Tránh sự ngập liên tục là yếu tố ảnh hưởng tiêu cực lên sự sinh trưởng và phát sinh hình thái của mẫu cây

• Cung cấp sự trao đổi oxy một cách đầy đủ

• Cung cấp sự hòa trộn đầy đủ

 Phân loại hệ thống ngập chìm tạm thời

Dựa theo nguyên tắc và nguyên lý để tạo ra hệ thống ngập chìm tạm thời , các nhà khoa học đã thiết kế và tạo ra các hệ thống ngập khác nhau , tùy vào mục đích nuôi cấy khác nhau

Sau đây là 3 loại hệ thống ngập chìm tạm thời khác nhau đã được phát triển và bán rộng rãi trên thị trường : hệ thống RITA®

, hệ thống bình đôi BIT®

a H ệ thống RITA

, và hệ thống Plantima

Hệ thống RITA

®

® là công trình của Teisson và Alvar d vào năm 1995 Một bình

chứa 1 lít gồm có hai phần, phần trên chứa mẫu cấy và phần dưới chứa môi trường

Một áp suất vượt mức tác động vào môi trường lỏng chứa trong phần dưới và đẩy chúng dâng lên ngăn chứa mẫu cấy Mẫu cấy được ngập chìm trong môi trường lỏng lâu hay mau tùy theo thời gian áp suất vượt mức được duy trì Trong suốt thời gian

ngập, không khí được sục vào trong môi trường lỏng, môi trường được chuyển động làm cho mẫu cấy xoay trở được các mặt tiếp xúc với bề mặt môi trường, áp suất vượt

ức sau đó được thoát ra bên ngoài nhờ một ngõ ra phía trên đầu hệ thống

Hình 2.1: Hệ thống RITA®, Pha 1: mô không ng ập trong môi trường, Pha 2: hiện

tượng ngập được hoạt hóa, các van mở ra cho khí đi qua các màng lọc đẩy môi trường

lỏng lên ngập mô cấy, Pha 3: sự trao đổi khí trong hệ thống RITA®

b H ệ thống bình sinh đôi BIT

, Pha 4: chu kỳ kết thúc, các van đóng lại và môi trường lỏng rút xuống ngăn bên dưới

thống có thể tích lớn hơn và rẻ hơn Con đường dễ dàng nhất để đạt được trạng thái

ngập chìm tạm thời theo chu kỳ nhất định là nối hai bình thủy tinh hay plastic có kích thước từ 250 ml - 10 lít bằng một hệ thống ống dẫn, và điều khiển tạo ra áp suất vượt

mức để đưa môi trường vào bình chứa mẫu và ngược lại Hệ thống BIT®được thiết kế đáp ứng với những yêu cầu trên

Hình 2.2: Hệ thống bình sinh đôi BIT

®

c H ệ thống Plantima

Hệ thống này được thiết kế tổng thể tương tự như hệ thống RITA

®

®

tuy nhiên có thay đổi và cải tiến một số chi tiết như hệ thống bơm và vị trí các màng lọc Hệ thống này được sản xuất và cung cấp bởi Công ty A-tech Bioscientific tại đảo Ðài Loan Cấu

tạo và phương pháp vận hành cơ bản

Hình 2.3: Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời

Hệ thống ngập chìm tạm thời Plantima là một hệ thống gồm nhiều bình plantima

nối với một máy bơm tự động Bình plantima là loại bình nuôi cấy do công ty A-tech Bioscientific của Đài Loan thiết kế dùng để tạo ra hiện tượng ngập chìm tạm thời của

mẫu mô, cơ quan, PLB… Một bình plantima gồm có 2 ngăn, ngăn trên chứa các mẫu

cấy thực vật, ngăn dưới chứa môi trường lỏng Bằng cách điều chỉnh tự động áp lực không khí, môi trường lỏng sẽ được bơm lên ngăn chứa mẫu cấy và k hi đạt đến thời gian ngập chìm tạm thời dung dịch sẽ quay trở lại ngăn dưới (Cung Hoàng Phi Phượng - 2006)

Hình 2.4: Các thành phần của hệ thống Plantima

2.1.4 Môi trường nuôi cấy in vitro

Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong nuôi cấy in vitro là thành phần môi

trường nuôi cấy Tùy theo mục đích thí nghiệm thành phần môi trường sẽ thay đổi, tuy

vậy hầu hết các môi trường nuôi cấy đều có các thành phần sau: khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, vitamin, đường (nguồn cung cấp carbon), các chất điều hòa sinh trưởng thực vật Ngoài ra người ta còn bổ sung các chất hữu cơ có thành phần xác định (amino acid, EDTA…) và một số chất có thành phần không xác định như nước dừa,

dịch chiết nấm men…

2.1.4.1 Khoáng đa lượng

Nhu cầu khoáng trong nuôi cấy in vitro không khác nhiều so với cây trồng trong

điều kiện tự nhiên Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là Natri, Phospho, Kali, Caxi, Magie, Fe

2.1.4.2 Khoáng vi lượng

Nhu cầu khoáng vi lượng trong nuôi cấy in vitro là lĩnh vực còn ít được nghiên

cứu Rất ít các nguyên tố vi lượng đã được chứng minh là không thể thiếu được đối

với sự phát triển của mô và tế bào như Mn, B, Zn, Cu, Co, I, Mo

2.1.4.3 Vitamin

Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau Khi tế bào

và mô được nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn sự phát

triển Các vitamin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol Ngoài ra người ta còn sử dụng các vitamin khác như biotin, acid folic, acid ascorbic, panthothenic acid, vitamin E (tocophenol), riboflavin và p-aminobenzoic acid

2.1.4.4 Các ch ất điều hòa sinh trưởng và vai trò của chúng trong vi nhân giống

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật là các yếu tố hóa học cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật Chúng được sản sinh với liều lượng rất nhỏ trong một bộ phận nào đó của cơ thể thực vật và được chuyển tới các bộ phận khác, ở

đó với liều lượng nhỏ nó có thể thực hiện sự điều khiển hướng hoạt động của tất cả các quá trình trao đổi chất trong tế bào, đồng thời thay đổi cấu trúc tế bào và hoạt tính sinh

lý của tế bào

Phytohormone là thành phần quan trọng bậc nhất của môi trường nuôi cấy Nhờ

những chất này, các nhà nghiên cứu có thể chủ động điều khiển quá trình phát sinh hình thái của thực vật in vitro Phytohormone gồm có 5 nhóm: auxin, cytokinin,

gibberellin, acid abscisic và ethylene

Tỷ lệ auxin/cytokinin xác định dạng phân hóa cơ quan của tế bào thực vật nuôi

cấy

Nhiều tác giả đã tổng kết rằng sự biệt hóa cơ quan thực vật in vitro là kết quả

tác động qua lại giữa hai nhóm auxin và cytokinin:

– Tỷ lệ auxin/cytokinin cao: kích thích sự tạo rễ

– Tỷ lệ auxin/cytokinin thấp: đẩy mạnh biệt hóa chồi

– Tỷ lệ auxin/cytokinin ở mức trung gian: giúp hình thành mô sẹo

Đó là nguyên tắc chung, còn phản ứng của các loại mô không giống nhau Vì

thế với mỗi loại mô, ở từng giai đoạn sinh trưởng khác nhau tổ hợp giữa auxin và

cytokinin, rất quan trọng Cả auxin lẫn cytokinin, đều được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để kích thích sự phát sinh hình thái Tỷ lệ hormone thực vật sử dụng để kích thích sự tạo chồi hay tạo rễ không giống nhau tùy theo giống, loài thực vật mà nhu cầu

về dạng và nồng độ của auxin và cytokinin rất khác nhau trong sự phát sinh hình thái

a Auxin

Có thể là auxin tự nhiên hay tổng hợp, thường dùng trong nuôi cấy mô và tế bào

để kích thích sự phân bào và sinh trưởng của mô sẹo Các auxin liên quan đến độ dài

của thân, đốt, chồi chính, rễ… Đối với nuôi cấy mô, auxin đã được sử dụng cho việc phân chia tế bào và phân hóa rễ Trong một cây bình thường, auxin luôn luôn di chuyển hữu cực Auxin thường hòa tan trong ethanol hoặc NaOH pha loãng Những auxin dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô là IBA, IAA, NAA và 2,4-D IBA và NAA chủ

yếu sử dụng trong môi trường ra rễ phối hợp với cytokinin sử dụng cho môi trường ra

chồi; 2,4-D rất hiệu quả với môi trường tạo và phát triển callus; IAA đóng vai trò kích thích sự phân hóa của các mô dẫn

Gồm một số loại chính như: IAA (β–indole acetic acid), IBA (β –indole butyric acid), 2,4-D (2,4-dichlorophenoxy acetic acid), NAA (α-naphthaleneacetic acid)

Đặc tính của auxin: kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào Có khả năng

khởi đầu sự phân chia tế bào Kích thích sự tăng trưởng giãn của tế bào đặc biệt là theo chiều ngang làm cho tế bào phình ra Kích thích sự phân chia tế bào vùng tượng tầng Kích thích sự tái sinh của liber và mộc Gây ra hiện tượng ưu thế ngọn Khi chồi ngọn

hoặc rễ chính sinh trưởng sẽ ức chế sự sinh trưởng của chồi bên và rễ bên Gây ra tính hướng động của cây (hướng quang và hướng địa) Kích thích sự hình thành rễ, đặc biệt

là rễ bất định trên cành giâm, cành chiết và trên mô nuôi cấy Kích thích sự sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt Kìm hãm sự rụng lá, hoa và quả Trì hoãn sự chín của trái Thúc đẩy sự ra hoa ở Bromeliads Kích thích sự tăng trưởng các phần

của hoa Ảnh hưởng lên sự vận động của chất nguyên sinh, tăng tốc độ lưu động của

chất nguyên sinh, ảnh hưởng lên các quá trình trao đổi chất Hàm lượng auxin tự nhiên trong mẫu cấy phụ thuộc vào trạng thái của cây mẹ, tuổi cây mẹ, thời gian thu mẫu trong năm

Công thức hoá học của NAA

Đặc tính của cytokinin: kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ Ảnh hưởng

lên sự tạo chồi bất định Ảnh hưởng rõ rệt và rất đặc trưng lên sự phân hóa cơ quan

của thực vật, đặc biệt là phân hoá chồi Kìm hãm sự hóa già của cơ quan và của cây nguyên vẹn, do đó nó được coi là hormone trẻ hóa Kích thích sự nảy mầm của hạt và

chồi ngủ Giúp gia tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein

Trong thân và rễ, cytokinin có vai trò: cản sự kéo dài nhưng kích thích sự tăng

rộng tế bào (sự tăng trưởng củ) Kích thích sự gia tăng kích thước tế bào lá trưởng thành Kích thích sự hình thành tia củ và sự phình to của củ Trong mối tương tác với auxin, cytokinin có ảnh hưởng tới ưu thế ngọn của cây Cytokinin làm yếu hiện tượng

ưu thế ngọn, làm phân cành nhiều

Công thức hoá học của BA

Vai trò ch ủ yếu của Gibberellin:

- Kích thích kéo dài chồi do tăng cường phân bào và kéo dài tế bào

- Gỡ miên trạng hạt giống hoặc củ giống

- Ức chế sự hình thành rễ bất định

- Kích thích sinh tổng hợp của α -amylase ở hạt cây ngũ cốc nả y mầm, giúp tiêu hóa các chất dự trữ trong nội nhũ để nuôi mầm cây

- Các chất ức chế tổng hợp kích thích quá trình tạo củ (thân củ, thân hành và củ)

- Kích thích sinh trưởng của phấn hoa và sinh trưởng của ống phấn

- Có thể tạo quả không hạt hoặc làm tăng kích thước quả nho không hạt

- Có thể làm chậm sự hóa già ở lá và quả cây có múi

d Acid abscisic (ABA)

Trong nuôi cấy mô tế bào, ABA có tác dụng tạo phôi vô tính, kích thích sự trưởng thành của phôi, kích thích sự phát sinh chồi ở nhiều loài thực vật

Vai trò ch ủ yếu của ABA:

- Tham gia vào sự rụng lá, hoa, quả ở hầu hết các cây trồng và gây ra sự nứt quả

- ABA thường được sinh ra khi thực vật gặp các điều kiện bất lợi như stress nước, stress nhiệt,…

- Tham gia vào sự ngủ nghỉ, kéo dài thời gian ngủ nghỉ và làm chậm sự nảy mầm

của hạt

- Ức chế sự kéo dài thân và được sử dụng để kiểm soát sự kéo dài thân cành

- Gây ra sự đóng khí khổng

2.1.4.5 Ảnh hưởng của pH

Độ pH ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của các ion trong môi trường khoáng,

khả năng đông tụ agar và sự tăng trưởng của tế bào Vì vậy, việc xác định chính xác và điều chỉnh pH trong môi trường là rất cần thiết Murashige và Skoog (1962) nhận thấy

rằng độ pH từ 5,7 – 5,8 thích hợp để duy trì sự hòa tan các chất khoáng trong môi trường MS Nếu như môi trường MS được sử dụng ở dạng lỏng thì có thể chỉnh pH =

5 (Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên – 2006)

Độ pH của môi trường thường được điều chỉnh bằng NaOH (đôi khi cũng sử

dụng KOH) hoặc HCl sau khi đã pha xong môi trường Có thể chỉnh pH bằng pH kế

để bàn, pH kế cầm tay hoặc giấy đo pH Thường thì pH môi trường được điều chỉnh trước khi hấp tiệt trùng, nhiệt độ cao sẽ làm tăng tính acid của môi trường Mann và

cộng sự (1982) nhận thấy rằng nếu trước khi hấp tiệt trùng mà chỉnh pH bằng 5,7 thì sau khi hấp tiệt trùng pH sẽ giảm xuống còn 5 Nếu muốn pH từ 5,7 – 5,9 trước khi

cấy thì trước khi hấp tiệt trùng phải điều chỉnh pH = 7 pH của môi trường cũng sẽ

thay đổi trong suốt quá trình nuôi cấy, do đó có nhiều nhà nghiên cứu đã cho vào một

chất có màu sắc thay đổi theo pH để theo dõi sự thay đổi pH trong môi trường Chất

chỉ thị thường được sử dụng là chlorophenol đỏ 1 – 5 mg/l (Reinert và White, 1956; Risser và White, 1964; Henson, 1979; Binns và Meins, 1980) và bromocressol đỏ tía Tuy nhiên, một vài chất chỉ thị có thể gây độc cho mẫu cấy (Roscoe và Bell, 1981) (Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên – 2006)

2.1.4.6 Carbon và ngu ồn năng lượng

Thực vật thu nhận nguồn năng lượng từ quá trình quang hợp Tuy nhiên, trong nuôi cấy mô cây con thiếu khả năng tự dưỡng (autotrophic) do chức năng của lục lạp

bị khiếm khuyết (Maretzki et al., 1974) Vì thế nguồn carbon bên ngoài rất cần thiết để

sản xuất đủ lượng carbohydrate nhằm đáp ứng nhu cầu phát triển của tế bào

Hầu hết các môi trường nuôi cấy mô thực vật (trừ môi trường nuôi cấy quang tự dưỡng) đều cần bổ sung thêm nguồn carbohydrate bên ngoài vào Nguồn carbon sử

dụng cho nuôi cấy mô thực vật chủ yếu là sucrose, fructose, glucose và một ít là maltose, galactose, mannose, lactose Tuy nhiên, nguồn carbon tốt nhất và sử dụng phổ

biến nhất trong nuôi cấy mô là sucrose ở nồng độ khoảng 2 – 5% Khuri và Moorby (1955) đã lập thí nghiệm đánh dấu (radio – labelled) sucrose, maltose, glucose và fructose Kết quả cho thấy sucrose được sử dụng nhanh hơn và tập trung ở rễ nhiều hơn Điều này cho thấy môi trường chứa sucrose thích hợp cho sự tạo củ hơn những môi trường sử dụng các loại đường khác Để khảo sát chức năng dinh dưỡng của sucrose, người ta thường sử dụng đối tượng là Khoai tây do nó có thể chịu đựng được

nồng độ sucrose cao vượt ngưỡng (khoảng 8%) so với các loài thực vật khác

(Vinterhalter et al., 1997) Carbohydrate cần cho việc nuôi cấy tạo mô sẹo (White, 1934; Gautheret, 1955) Sucrose được sử dụng làm nguồn carbohydrate đầu tiên bởi White (1940) và sau đó các nhà nghiên cứu khác cũng sử dụng sucrose một cách có

hiệu quả

Ngoài vai trò là nguồn carbon, các carbohydrate còn có tác dụng như một yếu

tố điều hòa sự phát sinh hình thái Lúc này carbohydrate có tác dụng lên sự hình thành

diệp lục Diệp lục trong mô sẹo nuôi cấy có tác dụng lên sự phát sinh phôi Các gene

biểu hiện nhanh trong sự biệt hóa của các diệp lục cảm ứng ánh sáng xanh cũng có

biểu hiện trong sự phát sinh phôi vô tính ở Chenopodium rubrum và Cà rốt (Aleith and

Richter, 1991) Sự hình thành và biểu hiện của các protein trong giai đoạn đầu của quá trình phát sinh phôi vô tính được tìm thấy trong lục lạp của đậu Hà Lan (Koonen and Jacobson, 1991) Sự kích thích quá trình phát sinh phôi vô tính trong nuôi cấy mô sẹo

tế bào noãn ở Citrus trên môi trường chứa lactose có liên quan đến sự hình thành diệp

lục trong mô sẹo (Button, 1978)

Quá trình tổng hợp diệp lục ở Cà rốt bị ức chế bởi sucrose, trong khi đó sucrose không gây ức chế quá trình này Sucrose ức chế sự hình thành màu xanh và khi giảm đường trong môi trường cần thiết cho sự tổng hợp diệp lục (Edelman and Hanson, 1971)

Nguồn carbon cung cấp năng lượng chủ yếu ở các loài thực vật trong nuôi cấy

mô chủ yếu là các loại đường, trong đó sucrose được sử dụng phổ biến (thường là sucrose thương mại)

Sucrose cùng với agar trong nuôi cấy mô là những thành phần chủ yếu ảnh hưởng đến sự hấp thu nước của tế bào thực vật Khuri và Moorby (1955) chứng minh

rằng, trong khi hấp và trong suốt quá trình phát triển của cây in vitro sucrose bị thủy

phân làm gia tăng áp suất thẩm thấu trong môi trường Tuy nhiên, hai tác giả cũng

chứng minh rằng không có sự khác biệt trong sự tạo củ khi thêm sucrose vào môi trường trước và sau khi hấp Điều này cho thấy lượng sucrose bị thủy phân trong khi

hấp khử trùng không gây ra ảnh hưởng nghiêm trọng lên quá trình tạo củ

2.1.4.7 Các h ợp chất hữu cơ bổ sung không xác định

Nhiều loại nước chiết khác được sử dụng cho môi trường nuôi cấy phôi lan

Chẳng hạn như nước chiết Cà chua là một nguồn dinh dưỡng tốt cho phôi lan nảy mầm

và tăng trưởng (Meyerm, 1945; Vaccine and Went, 1949; Griffith and Link; 1957) Tác dụng kích thích tăng trưởng của nước Cà chua được thấy rõ ở phôi Cattleya suda

x C percivaliana, các phôi tăng trưởng giới hạn và biệt hóa thành cơ quan tạo cụm mô phân sinh và tăng sinh bình thường

Các nhà trồng lan chuyên nghiệp còn sử dụng nhiều loại dịch chiết khác như

dịch chiết gỗ Mulô (Zimmer and Pieper, 1974, 1976) Dịch chiết bò, dịch chiết lúa Mỳ, lúa Mạch, Cà rốt, nấm men, Khoai tây, nấm đảm, peptone và nhiều loại nước trái cây khác (Knudson, 1922; Lami, 1927; Curtis, 1947; Mariat, 1952; Withner, 1953) Nhưng

hiệu quả tác dụng của những loại dịch chiết này lên sự tăng trưởng của phôi vẫn chưa

được biết rõ, có thể trong thành phần của những dịch chiết này chứa một số hợp chất kích thích tăng trưởng giúp cho sự phát triển của phôi Nhiều phôi lan có nhu cầu đặc

biệt về đạm, do vậy có thể các thành phần đạm trong dịch chiết có tác dụng kích thích

sự tăng trưởng của phôi

2.1.4.8 Amino acid và các ngu ồn cung cấp Nitrogen khác

Mặc dù tế bào có khả năng tổng hợp tất cả các amino acid cần thiết nhưng sự bổ sung các amino acid vào môi trường nuôi cấy là để kích thích sự tăng trưởng của tế bào – đây là nguồn nitrogen hữu cơ và được hấp thu nhanh hơn nitrogen vô cơ

2.1.4.9 Than ho ạt tính

Khi phát triển phương pháp để nhân giống Renanthera, vấn đề thường gặp nhất

là hàm lượng phenol tiết ra từ mô nuôi cấy quá cao, phenol sẽ khuếch tán vào môi trường làm oxy hóa các chất trong môi trường, gây độc cho mô nuôi cấy, kết quả là

mẫu cấy sẽ bị hóa nâu hoặc đen và chết

Nhiều phương pháp loại trừ các chất tiết này và đặc biệt là các sản phẩm oxy hóa của chúng đã được thực hiện như dùng chất chống oxy hóa, các enzyme ức chế phenol, polyvinylprolidone, than hoạt tính và nhiều loại chất hấp phụ khác Hầu hết các phương pháp này đều kèm với việc cấy chuyền mẫu sau 2 – 3 tuần sang môi trường mới Sử dụng than hoạt tính là biện pháp thường được dùng trong nuôi cấy mô thương mại Khi bổ sung than hoạt tính ở nồng độ xác định vào môi trường nuôi cấy

mô Renananthera, các hợp chất phenol trong môi trường sẽ được loại bỏ, giúp mô sinh trưởng tốt

2.1.4.10 Y ếu tố làm đặc môi trường

Agar là chất thường được sử dụng nhất để tạo môi trường đặc hay môi trường bán

lỏng để nuôi cấy mô thực vật Khi agar được trộn chung với nước thì tạo ra dạng gel và tan ra ở nhiệt độ 60 - 100oC và đặc lại khi nhiệt độ giảm xuống 45o

C nên agar ổn định trong tất cả điều kiện nhiệt độ môi trường nuôi cấy và không bị phân hủy của enzyme

thực vật Độ cứng của agar được quyết định bởi nồng độ agar sử dụng và độ pH của môi trường nuôi cấy

2.2 Giới thiệu về giống lan Renanthera và Renantanda “red number one”

2.2.1 Sơ lược về giống lan Renanthera

Họ Lan, hay họ Phong lan, (danh pháp khoa học: Orchidaceae) là một họ thực

vật có hoa, lớp thực vật một lá mầm Họ Orchideceae là một trong những họ lớn nhất

của thực vật và có các thành viên mọc trên toàn thế giới, ngoại trừ châu Nam Cực; có cây hoa lan sống dưới mặt đất và chỉ nở hoa trên mặt đất cũng như có cây hoa lan sống

tại vùng cao nguyên của dãy núi Himalaya; hoa lan có thể tìm thấy tại các vùng có khí

hậu nhiệt đới như trong rừng già của Brasil đến các vùng có tuyết phủ trong mùa đông như tại bình nguyên của Manitoba, Canada Các loài lan chủ yếu mọc trên cây cao,

sống biểu sinh lâu năm Chúng được gọi chung là phong lan Bên cạnh đó cũng có các loài mọc trong đất, tức là địa lan và có một số loài mọc trên đá tức thạch lan

Số lượng loài lan cao gấp 4 lần số lượng loài động vật có vú hay hơn 2 lần số lượng loài chim Nó chiếm khoảng 6–11% số lượng loài thực vật có hoa Khoảng 800 loài lan mới được bổ sung thêm mỗi năm Các chi lớn nhất là Bulbophyllum (khoảng 2.000 loài), Epidendrum (kho ảng 1.500 loài), Dendrobium (khoảng 1.400 loài) và

Pleurothallis (kho ảng 1.000 loài) Họ này cũng bao gồm chi Vanilla (chi chứa loài cây vani), Orchis (chi điển hình) và nhiều loài được trồng phổ biến như Phalaenopsis hay

Cattleya

Ngoài ra, kể từ khi du nhập các loài từ khu vực nhiệt đới vào trong thế kỷ 19 thì các nhà làm vườn châu Âu và Bắc Mỹ đã bổ sung thêm khoảng 100.000 loại cây lai ghép và giống cây trồng

Hoa lan được người tiêu dùng ưa chuộng vì vẻ đẹp đặc sắc và các hình thức đa

dạng của chúng Cũng giống như cây lan, hoa lan hầu như có tất cả các màu trong cầu

vồng và những kết hợp của các màu đó Hoa lan nhỏ nhất chỉ bằng hạt gạo trong khi hoa lan lớn nhất có đường kính khoảng 1m

Hoa lan Huyết Nhung (miền Bắc gọi là Hoa lan Phượng vĩ) có tên khoa học là

Renanthera Lour 1790 Là giống lan đơn thân, phân bổ từ India, New Guinea đến Philippines và Việt Nam Những loài thuộc giống này có phát hoa phân nhánh mang nhiều hoa gồm đủ các màu từ vàng , cam đến màu đỏ (ngoại trừ loài huyết nhung vàng) Hoa có cánh đài bên lớn, hoa không thơm nhưng đẹp và lâu tàn

Hoa lan Huyết nhung thường đòi hỏi sự thoáng k hí và ánh sáng tốt (70%), ẩm độ từ

40-70% Cách trồng tốt nhất là trồng ghép trên khúc gỗ, thân cây, cho leo hay trồng trong giỏ gỗ Nếu trồng trong chậu sành thì giá thể phải thoáng và phải thoát nước tốt Đối với cây Huyết nhung giún có thể trồng ngoài ánh sáng trực tiếp và trồng như lan

cắt cành (Intrenet)

2.2.2 Một số giống lan Renanthera

Rừng tự nhiên Việt Nam phát hiện 4 loài có hoa đẹp:

1 Renanthera coccinea Lour

Tên Vi ệt Nam: Lan Huyết Nhung giún, Huyết Nhung Dạ V ỹ, Lan Phượng

v ĩ bắc

Thân tròn,

Trong tự nhiên phân bố ở vùng Nam và Trung Trung bộ (Trần Hợp, 2000)

dài 2-5 m có khi hơn, leo bò Lá mọc so le hai bên thân, dài khoảng 7-10cm Hình thái hơi giống như lan Bò cạp nhưng thân tròn và lớn hơn, lá dày và

chốp lá bầu hơn Phát hoa hơi nằm ngang, phân nhánh, mang nhiều hoa Hoa to, cánh hoa và lá đài sau màu đỏ s on, có những vết rằn màu vàng cam, lá đài bên màu đỏ huyết Môi nhỏ, có cựa, phân ba thùy, , hai thùy bên vàng, thùy giữa đỏ Nở hoa vào khoảng tháng 3-5

Hình 2.5: Cây và hoa Lan Phượng vĩ Bắc

2 Renanthera citrina Averyanov

Tên Việt Nam: Lan Huyết Nhung hoa vàng , Hoàng nhung, Lan Phượng vĩ vàng

Được Tiến sĩ

Thân dài dài khoảng 20-22 cm, lá cứng dài 10 -15 cm Lá thuôn hẹp , dài Phát hoa dài khoảng khoảng 12-15 cm, mang 7-10 hoa kích thước khoảng 2-3 cm Cánh đài

và cánh hoa màu vàng chanh , trên cánh hoa và cánh đài có vài chấm tím Cánh đài lưng thuôn, cánh đài bên nở rộng, mép gợn sóng

Leonid V Averyanov công bố năm 1997

Trong tự nhiên phân bổ ở vùng Cao Bằng, Hòa Bình (Trần Hợp, 2000)

Hình 2.6: Cây và hoa Lan Phượng vĩ Vàng

3 Renanthera imschootiana Rolfe

Tên Việt Nam: Lan Huyết Nhung trơn, Phượng vĩ, Lan Phượng vĩ nam

Thân dài

Trong tự nhiên vùng Nam và Trung Trung bộ (Trần Hợp, 2000)

dài khoảng 50-60 cm Lá có hình thuôn, đỉnh có hai thùy không đều Phát hoa nằm ngang, phân nhánh, mang nhiều hoa; lá đài sau và hai cánh hoa có màu vàng rực, ở chốp đỉnh có vết màu đỏ cam (khác với Renanthera Vietnamensis), lá lá đài bên có màu đỏ rực Hoa thường nở hoa vào mùa hạ

Hình 2.7: Cây và hoa Lan Phượng vĩ Nam

có màu đỏ hoặc đỏ cam , rìa có màu vàng cam ; Môi có 3 thùy, thùy bên đỏ sậm, thùy

giữa màu đỏ hay cam hình tim uốn cong ngược (Trần Hợp, 2000)

Leonid V Averyanov, Anna L Averyanova phát hiện và công bố Đây là loài lan Huyết nhung đặc hữu Việt Nam tìm thấy ở vùng đá vôi tỉnh Hà Giang , thuộc núi Bát Đại Sơn

Hình 2.8: Cây và hoa Lan Huyết nhung Việt

* Hình ảnh một số cây lan Renanthera ngoại khác:

Hình 2.9: Renanthera bella

Hình 2.10: Renanthera annamensis

Hình 2.11: Renanthera storiei

Hình 2.12: Renanthera matutina

Hình 2.13: Renanthera philipinesis

Hình 2.14: Renanthera Monarchica

2.2.3 Sơ lược về Renantanda “red number one”

Là cây lan lai giữa Renanthera và Vanda

Cây này có nhiều ưu điểm như: cây khỏe mạnh, sinh trưởng tốt, có bộ lá to

đẹp, màu xanh đậm và dày Hoa của Renantanda “red number one”có màu đỏ nhung

đẹp, phân nhánh nhiều, cây siêng hoa, cho hoa quanh năm Loại lan này có thể trồng làm lan cắt cành hoặc trồng trong chậu đề trang trí Nhưng hiện nay giống này nhập

nội từ Thái Lan nên giá thành còn cao

Hình 2.15: Cây lan Renantanda trong vườn của TTCNSH

2.3 Tình hình nhân giống lan Renantanda

Vì Renantanda là m ột giống lan lai từ Renanthera nên nó cũng được nhân

giống như Renanthera

2.3.1 Nhân gi ống ngoài tự nhiên

2 3.1.1 Phương pháp tách chiết

Renantanda có bộ rễ khỏe, có thể cắt ra thành hai hay nhiều đoạn, mỗi đoạn có

ít nhất là 2 rễ Ta có thể phun dung dịch chứa kích thích tố ra rễ (auxin) để có bộ rễ

khỏe mạnh và nhiều thuận lợi cho việc tách chiết Cây sau khi cắt phải bôi dung dịch

có tính chất sát khuẩn như sơn, vôi… để hạn chế việc nhiễm khuẩn và cần thời gian để

a Nảy mầm trong in-vitro:

Từ trái lan chín, ta tiến hành giao hạt trên môi trường MS hoặc Knudson C chứa đường sucrose, sau một vài tháng cây con hình thành Phương pháp này cho cây con nhiều nhưng khó thực hiện với các nhà vườn trồng lan ở Việt Nam hiện nay

b N ảy mầm thông qua sự cộng sinh với nấm:

Trái lan sau khi thu hoạch, ta tách vỏ và giao hạt lên giò lan (nên chọn giò lan cùng giống), cây con sẽ mọc nếu điều kiện thuận lợi Phương pháp này cho hiệu quả kém nhưng rất dễ thực hiện