GIÁO TRÌNH THỰC TẬP HÓA PHÂN TÍCH KHOA DƯỢC

Ví dụ để xác định nồng độ của một mẫu dung dịch B có màu, người ta thiết lập đường chuẩn A =fC bằng cách đo độ hấp thu A của một loạt các dung dịch chuẩn B có nồng độ biết trước.. 20 Tro

T NG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM

12

BÀI 5: XÁC ĐỊNH Fe TRONG NƯỚC BẰNG PHƯƠNG PHÁP

QUANG PHỔ HẤP THU KHẢ KIẾN

I.NGUYÊN TẮC

1.Sự hấp thu bức xạ và màu sắc của vật chất:

Ánh sáng nhìn thấy (ánh sáng trắng) bao gồm dải bức xạ có bước sóng từ 396- 760

nm, bao gồm các tia có màu đỏ, cam, vàng, lục, lam, chàm, tím… Màu sắc của vật chất được giải thích dựa vào kết quả tương tác khi chiếu ánh sáng trắng vào vật đó:

- Nếu ánh sáng đi qua hoàn toàn (nghĩa là vật không hấp thu ánh sáng) thì vật đó sẽ có màu trắng

- Nếu vật đó hấp thu hoàn toàn ánh sáng thì vật đó có màu đen

- Nếu vật hấp thu chọn lọc một số tia ánh sáng trong ánh sáng trắng khi đó vật sẽ có màu là màu phụ của màu các tia đã bị hấp thu

Quan hệ giữa màu của tia bị hấp thu và màu của chất hấp thu

Ví dụ: vật có màu đỏ nghĩa là vật hấp thu chọn lọc các tia lục xanh có λ = 490 -510 nm

2 Định luật Lambert – Beer

Khi chiếu chùm bức xạ có cường độ ban đầu I0 qua chậu đo chứa mẫu có bề dày b và nồng độ C thì chùm bức xạ đi qua lớp chất hấp thu sẽ có cường độ giảm còn IT

Ta có : Độ truyền suốt T = IT/I0

Độ hấp thu (mật độ quang) A = log(I0/IT) Định luật Lambert –Beer: Độ hấp thu A của bức xạ tỉ lệ với bề dày và nồng độ của chất hấp thu:

A = εbC = k.C = f(C) Trong đó ε là hệ số hấp thu của chất hấp thu; b là bề dày chậu đo Nếu εb = k =const thì quan hệ giữa A và C là quan hệ tuyến tính Thực tế quan hệ giữa A và C chỉ tuyến tính trong một khoảng nồng độ thích hợp nào đó

3.Định lượng bằng phép lập đường chuẩn

Người ta có thể ứng dụng định luật Lambert – Beer trong định lượng bằng phép lập đường chuẩn Ví dụ để xác định nồng độ của một mẫu dung dịch B có màu, người ta thiết lập đường chuẩn A =f(C) bằng cách đo độ hấp thu A của một loạt các dung dịch chuẩn B có nồng độ biết trước Đo độ hấp thu của mẫu Am Từ đồ thị A =f(C) suy ra nồng độ của Cm

hay có thể suy ra Cm từ phương trình quan hệ A=f(C) được tính bằng phương pháp bình phương cực tiểu

13

A

A m

C m C Hình – Đường biểu diễn A =f (C)

Cho ion Fe2+, Fe3+ phản ứng với chất tạo phức L để tạo thành các phức có màu FeLn Các chất tạo phức thường dùng là KSCN; 1,10-phenanthrolin Đo độ hấp thu của phức ở bước sóng thích hợp trong vùng ánh sáng thấy được và định lượng bằng phép lập đường chuẩn

TKPT (chọn những tinh thể tốt có màu xanh nhạt) Hòa tan trong 500mL nước cất hai

14

lần đã có chứa 5mL H2SO4 đậm đặc Dung dịch này chứa 1mg Fe/mL có thể kiểm tra nồng độ sắt bằng phương pháp chuẩn độ oxy hóa, chất chuẩn là K2Cr2O7 hay KMnO4 Pha loãng dung dịch này 100 lần để có nồng độ 10μg Fe trong 1mL

CH3COOH đậm đặc (d=1,05) thêm nước cất đến 1L

III.1 Quét phổ hấp thu của phức để chọn λmax

Lấy 2 bình định mức 50mL Bình 1 thêm 3mL dung dịch chuẩn sắt, thêm 5mL dung dịch đệm acetat pH = 5, 1mL axit ascorbic, thêm tiếp 1mL 1,10-phenanthrolin 0,5% rồi thêm nước cất đến vạch mức Lắc đều, sau 10 phút quét phổ dung dịch với khoảng bước sóng thay đổi 250 – 700nm Bình 2 chuẩn bị tương tự nhưng không cho dung dịch sắt vào bình định mức

III.2 Lập đường chuẩn mật độ quang theo nồng độ

Cho trình tự hóa chất theo bảng vào bình định mức Dung dịch so sánh là bình 2 Bước sóng sử dụng để đo là bước sóng cực đại vừa khảo sát từ thí nghiệm III.1 Đo dung dịch theo nồng độ từ nhỏ đến lớn

Trước khi tiến hành đo trên máy UV-Vis, máy phải được bật trước 20-30 phút để ổn định Khi đọc số đo phải thỏa mãn điều kiện những số đo có nghĩa, chính xác

Lập đồ thị chuẩn và mẫu theo bảng:

1 Mẫu 2 Dung dịch sắt 10μg Fe

III.3 Chuẩn bị mẫu xác định Fe 2+ và Fe 3+

- Xác định Fe tổng cộng: mẫu 1: chuẩn bị tương tự như dung dịch trong lập đường chuẩn; có thêm axit ascorbic để chuyển Fe3+ thành Fe2+ hoàn toàn

- Xác định Fe2+: mẫu 2: chuẩn bị như dung dịch trong lập đường chuẩn nhưng không thêm axít ascorbic như vậy chỉ có Fe2+ tham gia phản ứng tạo phức

- Xác định Fe3+: tính từ hiệu của hai giá trị trên

IV.TÍNH TOÁN VÀ XỬ LÝ KẾT QUẢ

Dựng đồ thị phụ thuộc A theo C

Xác định lượng sắt (II) và tổng lượng Sắt

Sinh viên thiết lập phương trình đường chuẩn bằng chương trình excell và tính toán nồng

độ Fe2+, Fe tổng trong mẫu đo được

15

V.CÂU HỎI

Câu 1: Nguyên tắc của phương pháp định lượng bằng phương pháp trắc quang?

Câu 2: Khoảng bước sóng bao nhiêu thì mắt con người nhìn thấy được?

Câu 3: Những chất có bản chất như thế nào về cấu trúc thì có thể xác định bằng phương

pháp trắc quang?

Câu 4: Ưu điểm của phương pháp trắc quang

16

Bài 6 Sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột

Mục tiêu

 Chiết chlorophyll từ lá cải bó xôi

 Khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ acetone và hexane trên độ phân tách của bản mỏng

 Xác định giá trị Rf của các chất trong sắc đồ bản mỏng

I Tổng quát

Chlorophylls (chất diệp lục) là những sắc tố màu xanh lục đóng vai trò đóng vai trò quang tổng hợp trong các loài thực vật Chlorophyll có khả năng hấp thụ những bước sóng nhất định của ánh sáng khả kiến và chuyển hóa nó thành năng lượng hóa học Hai cấu trúc của chlorophyll có thể tìm thấy trong thực vật là chlorophyll A và B Trong thí nghiệm này, chúng ta sẽ thử tách chlorophylls từ cải bó xôi bằng TLC

17

II HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ

Kẹp gắp bản mỏng Ống nhỏ giọt thủy tinh (1 nhóm 2 cái)

III.1 Chiết Chlorophylls từ cải bó xôi

1 Làm sạch cải bó xôi với nước và lau khô bằng khan giấy Cắt 2 gram lá cải bó xôi thành

từng mảnh nhỏ bằng kéo và bỏ vào chày Thêm vào 3 ml acetone vào chày và nghiền lá bằng cối Gạn dung dịch chiết qua phễu lọc có nhét bông gòn vào ống nghiệm có nắp Lưu ý bóp nhẹ phần bã để lấy được thêm dịch chiết

2 Cho tiếp 3 ml acetone vào cối và dùng chày nghiền bã một lần nữa Tiếp tục gạn vào ống

nghiệm có nắp đậy bằng phễu lọc có nhét bông gòn Cho thêm 3 ml acetone và 5 ml hexane vào bã và nghiền tiếp Tiếp tục gạn vào ống nghiệm qua phễu lọc có nhét gòn Bã sau cùng phải có màu xanh lục rất nhạt

3 Thêm 3 ml nước muối bão hòa vào ống nghiệm có nắp đậy Vặn nắp chặt và lắc mạnh ống

nghiệm để rửa dung dịch Chlorophyll-acetone-hexane Lưu ý trong quá trình lắc, thỉnh thoảng phải mở nắp cho khí thoát ra Sau khi lắc xong, đặt ống nghiệm vào giá để và để yên cho các pha phân tách Lúc này lớp ở mặt trên phải có màu xanh đen và lớp dưới có màu xanh nhạt và trong

4 Nếu nhũ phát sinh trong quá trình lắc, bỏ thêm nước muối bão hòa vào để hỗ trợ quá trình

phân tách Sau khi hai pha đã phân tách rõ ràng, dùng ống nhỏ giọt để hút lấy lớp dung môi hữu cơ ở trên và cho vào ống nghiệm có nắp đậy sạch Còn lớp dung dịch nước ở dưới thì

đổ chung vào 1 lọ dựng dung dịch bỏ

giấy lọc vào erlern 25 ml

18

III.2: Khảo sát dịch chiết cải bó xôi bằng sắc ký lớp mỏng

1 Dùng bút chỉ vẽ một đường ngang cách ở 2 đầu của bản mỏng 1 cm Ở đây một đường sẽ

đánh dấu cho quá trình bắt đầu và một đường sẽ đánh dấu cho quá trình kết thúc Sau đó dùng bút chì đánh dấu đánh dấu điểm sẽ chấm dung dịch Sau đó dùng ống mao quản hút nhẹ dung dịch chlorophyll đã chiết từ erlen và chấm nhẹ nhàng trên điểm đã đánh dấu trên bản mỏng Sau khi chấm, đợi cho dung môi bay hơi rồi tiếp tục nhẹ nhàng chấm tiếp Lập lại quá trình này cho đến khi chỗ chấm hiện màu rõ

2 Cho hỗn hợp dung môi acetone và hexane (2:8) vào bình thủy tinh chạy sắc ký Độ cao của

dung dịch trong bình chứa phải thấp hơn 1 cm Sau đó đậy nắp của bình lại và cho dung môi bão hòa trong bình

3 Đặt một lớp giấy lọc dựa vào thành trong của bình sắc ký và một lớp giấy lọc ở đáy bình

sắc ký

4 Dùng kẹp gắp bản mỏng và bỏ bản mỏng theo chiều dựng đứng vào bình thủy tinh có chứa

dung môi đã bão hòa để cho quá trình sắc ký bắt đầu Khi dung môi di chuyển đến đường kết thúc, dùng kẹp gắp lấy bản mỏng ra

5 Lập lại quá trình với hỗn hợp dung môi acetone và hexane khác (3:7 và 4:6) để xem hỗn

hợp dung môi nào cho đô phân giải tốt nhất Tính giá trị Rf

Câu hỏi

1 Tại sao chúng ta cần phải cắt nhỏ và nghiền lá?

2 Có thể dùng Dietyl ether làm dung môi chiết để thế cho acetone được không? Giải thích

3 Nêu rõ thành phần của pha động và pha tĩnh trong thí nghiệm này

4 Vì sao hỗn hợp của các phần tử hữu cơ có thể phân tách được bằng sắc ký lớp mỏng?

5 Đề xuất hai loại sắc ký khác có thể sử dụng?

6 Làm sao có thể nhận biết được chlorophyll A và chlorophyll B từ sắc đồ?

7 Trong sắc ký lớp mỏng, ống mao quản được dùng để chấm dung dịch vào bản mỏng Vậy

kích thước của điểm chấm của ống mao quản ảnh hưởng thế nào đến sắc đồ?

Carotenoids là một phần lớn hơn của các hợp chất chiết tách từ thực vật, được gọi là terpense Những hợp chất tự nhiên này thường có 10, 15, 20, 25, 30 và 40 carbon phân tử, và thường được tạo ra bởi sự cấu thành các đơn vị isoprene, thông thường theo quy tắc đầu-đuôi

Isoprene là tên thông dụng của 2-methyl-1,3-butadiene

Carotenoids là các tetraterpene (tám đơn vị isoprene) Lycopene là chất làm nên sắc tố đỏ trong cà chua và dưa hấu và฀ β-carotene, chất làm cho cà rốt và trái mơ có màu cam là những

ví dụ của carotenoids

β-carotene cũng là chất phụ gia màu được sử dụng phổ biến trong bơ magarine Khi tiêu hóa, β-carotene được cắt thành hai phân tử vitamin A Vitamin A, hay còn gọi là retinol, đóng vai trò quan trọng trong thị lực

20

Trong thí nghiệm này, chúng ta sẽ phân lập các sắc tố của lá cải bó xôi bằng việc sử dụng những độ phân cực khác nhau để tác động đến sự phân tách Do các cấu tử khác nhau sẽ có màu khác nhau, chúng ta có thể quan sát sự phân tách này bằng mắt thường

Sắc ký cột hoạt động cùng nguyên tắc với sắc ký lớp mỏng, nhưng thay vì dùng một bảng mỏng có tráng sẵn silica gel, sinh viên sử dụng cột được nhồi bằng silica gel Dung môi sẽ di chuyển theo chiều dọc cột xuống thay vì di chuyển theo chiều dọc lên bảng mỏng Beta

carotene và chlorophyll đều có màu và màu của chúng là do ánh sáng bị hấp thụ bởi các hợp chất này do chúng có nhiều nối đôi C=C

Cột có thể được nhồi bằng phương pháp “ướt” bằng việc rót dung dịch cần phân tách vào cột, hay “khô” bằng cách nhồi côt với chất phân tách khô Ở bài này, chúng ta sẽ dùng phương pháp ướt Hỗn hợp cần phân tách sẽ được hòa vào một lượng tối thiểu pha động và cho nhẹ

nhàng vào đầu cột đã nhồi để tránh xáo động đầu cột Sau đó cột sẽ được triển khai bằng cách cho tiếp dung môi vào đầu cột và thu các phân đoạn ở đầu ra bằng các ống nghiệm đã được dán nhãn Ở các loại sắc ký cột nhanh (flash column), áp suất được sử dụng để đẩy dung môi nhanh qua cột Để khảo sát mức độ phân tách trong cột và các thành phần của các phân đoạn

đã được tách ra, người ta dùng sắc ký lớp mỏng bằng cách chấm điểm của phân đoạn bất kỳ và

so sánh với dung dịch ban đầu trước khi triển khai lên sắc ký cột

Sắc ký cột có thể triển khai bằng hệ đơn dung môi hay bằng hệ phân cực giảm dần Ví dụ trong bài này, cột sẽ được triên khai đầu tiên bằng hệ dung môi rất kém phân cực như hexane,

và sau đó các phân đoạn sẽ được thu thập khi chúng ta thay đổi hệ dung môi sang 70:30

hexane:acetone, sau đó là 50:50 hexane:acetone Hệ dung môi có độ phân cực thay đổi thường được sử dụng để tách các hỗn hợp chất với các độ phân cực khác nhau

IV.2 Vật liệu và dụng cụ

Ống nhỏ giọt thủy tinh (1 nhóm 2 cái Bình chạy sắc ký bản mỏng

Chuẩn bị ống nghiệm 10 ml sạch và xếp sắc vào giá ống nghiệm

1 Chuẩn bi cột sắc ký sạch, lắp cột sắc ký vào giá đỡ theo sự hướng dẫn của kiểm nghiệm viên Xé 1 miếng bông gòn nhỏ bằng nửa đầu ngón tay và thả vào đầu ra của cột sắc ký Thấm ướt miếng bông bằng cách nhỏ 1 chút hexane bằng ống nhỏ giọt

2 Hòa 20 g silica vào lượng vừa đủ hexane, khuấy nhẹ nhàng cho silica thấm đều dung môi

3 Đặt 1 berker 50 ml ở dưới đầu ra của côt và chỉnh van cột ở chế độ mở Đặt phễu lọc lên đầu cột và đổ dung dịch silica đã làm ướt vào Lưu ý quan sát dung môi, không được để khô mặt cột Thêm hexane vào đầu cột liên tục cho đến khi lớp silica được

nhồi chặt (lưu ý hướng dẫn của giáo viên phụ trách) Dung môi hexane ở đầu ra của cột

có thể tái sử dụng lại để châm vào đầu cột Sau khi cột đã được nhồi chặt, xả dung môi cho đến khi dung môi cách bề mặt lớp silica khoảng 4 cm và khóa cột Lúc này đã hoàn thành việc nhồi cột

4 Sau khi cột đã được nhồi chặt, hòa cắn đã bay hơi ở trên bằng lượng tối thiểu hexane và dùng ống nhỏ giọt nhẹ nhàng nạp vào đầu cột Để yên cho lớp mẫu mới nạp vào lắng xuống Bắt đầu cho xả cột và lượng mẫu sẽ thấm vào bề mặt lớp silica Lưu ý nhẹ nhàng nạp dung môi vào đầu cột bằng cách dùng ống nhỏ giọt bơm dung môi vào bề mặt trong của thành cột Lúc này cột đã bắt đầu chạy

5 Tiếp tục châm hexane cho đến khi thấy một lớp màu vàng xuất hiện và tách khỏi lớp màu xanh Lưu ý lớp màu vàng này nhạt màu và di chuyển khá nhanh Khi lớp màu

vàng này di chuyển đến cuối cột, nhanh chóng hứng bằng một ống nghiệm sạch

6 Sau khi đã hứng được hết lớp màu vàng Chuyển sang ống nghiệm sạch khác Đổi hệ dung môi sang acetone và tiếp tục quan sát lớp màu xanh lục di chuyển Hứng lớp màu xanh khi lớp này di chuyển đến đáy cột Nếu đã hứng hết được lớp màu xanh, lúc này quá trình sắc ký kết thúc

7 Khi hoàn thành quá trình sắc ký, làm giàu các phân đoạn bằng cách đun cách thủy (400C) nhẹ nhàng Tiến hành khảo sát sự phân tách bằng cách so sánh các phân đoạn và dịch chiết tổng bằng sắc ký lớp mỏng, pha đông là hexane:acetone (7:3) Quan sát và đánh dấu các chất được tách ra Tính Rf cho các chấm và dán bảng mỏng vào tờ báo

3 Tại sao trong suốt quá trình sắc ký, tại sao luôn phải giữ cho đầu cột sắc ký không bị khô ?

4 Vì sao Beta-carotene di chuyển qua cột nhanh hơn các cấu tử khác ?

23

Bài 7: SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA THÀNH PHẦN PHA ĐỘNG ĐẾN THỜI GIAN LƯU VÀ ĐỘ NHẠY CỦA TỪNG ĐẦU DÒ

I ĐẠI CƯƠNG

Ngày nay phương pháp tách bằng sắc ký lỏng ngày càng chứng tỏ ưu thế của mình nhất

là trong việc phân tích các sản phẩm dược phẩm, dược liệu hay các chất các trong hệ sinh học Mục tiêu của bài thực tập này là nghiên cứu hiệu năng cột tách và độ chọn lọc trong sắc ký lỏng hiệu năng cao có pha tĩnh là pha đảo Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha tĩnh kém phân cực vốn giữ rất chặt các hợp chất kém phân cực và không phân cực và pha động tương đối phân cực chiếm khoảng 70% trong tổng số phép phân tích bằng sắc ký lỏng

Cột sắc ký dùng trong bài thực tập này được nhồi với pha tĩnh là những hạt silica hình cầu, xốp Hydrogen trên nhóm silanol Si-OH phân cực được thay thế bằng nhóm octadecyl (C18) làm cho

bề mặt hạt silica trở nên không phân cực Mức độ không phân cực của bề mặt hạt silica-C18 tùy thuộc vào tương quan mật độ C18- và nhóm silanol Si-OH còn lại, mức độ che phủ C18 và độ xốp của hạt silica

II NỘI DUNG

Trong thí nghiệm này, sinh viên sẽ khảo sát sự phân tách của các chất trong dịch chiết

sâm Viêt Nam (Panax vietnamensis) Các dung dịch chuẩn của sâm (riêng rẽ hay hỗn hợp) có

nồng độ 10 ppm (10 mg/l) được pha sẵn Dung dịch sau khi tách được phát hiện bằng đầu dò

UV tại bước sóng 203 nm và sau đó tiếp tục được khảo sát bằng đầu dò mass Sinh viên sẽ khảo sát sự phân tách của các chất trong dịch chiết trên cột và định danh peak bằng cách so sánh với dung dịch chuẩn

Bài này giáo viên hướng dẫn sẽ thao tác và các em kiến tập