Kỹ thuật chuyển gien trên thục vật docx

Công tác lai tạo có thể thực hiện từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhauNguồn gien sơ cấp trong cùng loài • Các giống ưu việt • Giống địa phương primitive cultivars • Giống hoang dại của c

Kỹ thuật chuyển gien trên

thục vật

Hiện nay, diện tích GMO trên thế giới khoảng 215 triệu acresCây trồng chuyển gien (GMO)

Gien là 1 đoạn ADN mã hóa 1 loại protein chuyen biệt
biểu hiện 1 tính trạng.

transcription

translation

expression

Cây trồng chuyển gien là gì ?

• Thuật ngữ ‘chuyển gien’ (Transgenic) dùng để chỉ việc đưa gien vào 1 đối tượng SV nào đó bằng KT ADN tai tổ hợp Gien được chuyển từ các loài khác hay trong cùng 1 loài

• Từ đồng nghĩa (Synonym):

Genetically modified organism (GMO)Genetically engineered organism (GEO)

Những cây trồng nào được phát triển từ các loài này ?

Bắp (corn) Cà rốt (carrot) cải salade (lettuce) Những cây trồng nào được phát triển từ các loài này ?

Teosinte Bắp (maize)

Sinapis

Từloài hoang dại trở thành loài trồng

• Mất khả năng phát tán hạt tự nhiên (rụng, lông, gai )

Quá trình chọn giống gồm 2 bước cơ bản

I Tạo ra (hoặc nhận diện) các dạng biến dị

•Thu thập từ nơi hoang dại hay ruộng nông dân

•Lai tạo (lai giữa 2 hay nhiều cây)

•Gây đột biến, hoặc đa bội

II Chọn lựa các tính trạng mong muốn

Các đặc tính đầu tiên được nhà chọn giống quan tâm trong quá trình thuần hóa là: hạt to, không bị ngủ đông, và không bị rụng hạt

Công tác lai tạo có thể thực hiện từ nhiều

nguồn nguyên liệu khác nhauNguồn gien sơ cấp (trong cùng loài)

• Các giống ưu việt

• Giống địa phương (primitive cultivars)

• Giống hoang dại của cùng loàiNguồn gien thứ cấp (khác loài)

• Giống trồng, giống địa phương, hoặc cây hoang dại của các loài khác (species) hoặc giống khác (genera)

• Giống lúa mì ‘Clearfield’, mang gien kháng thuốc trừ cỏ, được tạo

ra do xử lý đột biến, sắp được đưa ra thị trường

KT chuyển gien có phải là bước mở rộng của PP chọn giống truyền thống hay là sự phát triển nhảy vọt hoàn toàn mới ?

• KT chuyển gien cho phép khai thác các biến dị di truyền trong thế giới SV, thay vì chỉ giưới hạn trong cùng loài hay cùng giống trong

Qui trình tạo cây chuyển gien

• Phân lập và nhân dòng (cloning) gien cần chuyển

• Gắn thêm vào gien các đoạn khởi động và điều hòa hoạt động của gien

• Gắm thêm marker chọn lọc (selectable marker)

• Đưa cấu trúc được thiết kế (cassette) và TB của cây (chuyển gien - transformation)

• Chọn lọc các Tb hay mô mang gien chuyển

• Tái tạo lại Regenerate whole plants

Xác định và nhân dòng (cloning) gien cần chuyển

• Đây là bước đàu tiên, và cũng là giới hạn của thành tự về chuyển gien

• Các phòng thí nghiệm quốc gia cũng như tư nhân đang tập trung rất nhiều công sức vào việc xác định , định vị, kháo sát tính chất

và nhân dòng những gien kiểm soát các tính trạng nông học quan trọng (chiều cao, trổ hoa, số trái, số hạt, năng suất )

Bước 1:

Arabidopsis thaliana

•Việc giải mã trình tự bô gien hoàn tất vào tháng 12/2000: bộ gien chứa khoảng ~120

Mb (ADN ), và có khoảng 25.000 gien

•‘Dự đoán’ chức năng của gien được thực hiện cho khoảng 70% các gien

•N hững vùng lặp chiếm khoảng 58% bộ gien, dường như do sự nhân đôi của toàn

bộ gien xảy ra vào khoảng 100 triệu năm

về trước

Thông tin có được từ nghiên cứu trên Arabidopsis

•Có nhiều loại gien huộc nhom Protein-kinase hơn dự đoán Điều này

co thấy tầm quan trọng trong cơ chế truyền phát tín hiệu trong TB

•N hũng gien kiểm soát các hoạt động cơ bản của TB được bảo tồn trong quá trình tiến hóa (có tỉ lệ giống nhau cao giữa người và Arabidopsis) N gược lại, các gien kiểm soát sự trao đổi thông tin của

TB thì rất thay đổi, bao gồm:

♦ Các gien kiểm soát các chức năng cơ bản của TB tồn tại ừ thời

tổ tiên

♦ N hưng khi đến giai đoạn đa bào thì tiến hóa theo hướng khác nhau giữa ĐV và TV

Các dạng đột biến trên Arabidopsis được tạo ra bằng KT chuyển gien (Đột biến “knock-out”) cho phép phát hiện chức năng của các gien

(Các đột biến liên quan đến cấu tạo hoa)

Mục tiêu tương lai trong nghiên cứu bộ gien TV

• Xác định chức năng của tất cả các gien trên Arabidopsis (2010)

• Giải mã trình tự bộ gien của cây lúa (bộ gien nhỏ nhất trong nhóm ngũ cốc)

• Giải mã trình tự của cây cỏ 3 lá (Medicago truncatula) (đại diện cho nhóm cây họ đậu)

• Giải mã trình tự nhũng vùng mang nhiều gien (gene-rich regions) của nhóm cây ngũ cốc với bộ gien lớn, VD: bắp, lúa mì

• Bào tử của csc VK đất Bacillus thuringiensis (Bt) có chứa các tinh thể (crystalline - Cry) protein Tromg hệ thống tiêu hóa của côn trùng, các tinh thể này bị phá vở và giải phóng ra các độc tố để liên kết và làm thủng đường ruột của côn trùng

• 1 đoạn của gien Cry được sử dụng trong chuyển gien để tạo ra các giống cây trồng Bt

Gien Bt

Đoạn mã hóa cho độc tố

Đoạn không cần thiết cho độc tính

Bước 2:

gắn thêm các đoạn ADN để kiểm soát biểu hiện của gien

• Promoter = điểm bắt đầu của quá trình sao mã; có tính chuyên biệt cho thời điểm, vị trí mô, mức độ biểu hiện của giean

• Termination sequence = điểm kế thúc của quá trình sao mã

Promoter Bt coding Terminator

sequenceBước 2:

Transgene promoters

• Thường được sử dụng là CaMV 35S promoter của víu gây bệnh khảm trên cây bông cải Đây là promoter mạnh và biểu hiện ở mọi nơi, mọi lúc (constitutive promoter) ở TV

• Các Promoter có tính chuyên biệt hơn đang được nghiên cứu: đặc trưng cho cơ quan, giai đoạn phát triển của TV hay trong các đ/kiện đặc biệt khác

Transgene Terminator

• Thường được sử dụng nhất là nopaline synthase (nos) transcription terminator của VK Agrobacterium tumefaciens

Gắn thêm các marker chọn lọc (Selectable markers

• Bởi vì hiệu quả chuyển gien rất thấp (từ 1 - 5% TB nhận được gien chuyển), do đó cần phải có PP để nhận diện các TB đã nhận được gien chuyển để tiếp tục

• Hiện nay, các gien kháng vói kháng sinh (antibiotic) hoặc với thuốc trừ cỏ thường được sử dung làm marker nhận diện

Bước 3:

Thiết kế gien Bt (cassete) cho chuyển gien

Antibiotic orherbicide resistance gene

Promoter

Bt gene

Termination sequence

Chuyển thiết kế gien vào TB TV (chuyển gien - Transformation)

• Súng bắn gien (Gene gun = biolistics, microprojectilebombardment)

• Chuyển gien bằng VK AgrobacteriumBước 4:

Các loại mô TV được sử dụng trong chuyển gien

Việc chọn lựa các mô TV để chuyển gien tùy thuộc vào từng loại cây trồng, thường là các phôi chưa trưởng thành (immatureembryos), dĩa lá (leaf disks) và mô phân sinh ngọn (apicalmeristems)

Các mô được chọn phải có khả năng tạo callus (undifferentiated tissue), từ đó tái tạo lại cây

Trên Arabidopsis, PP chuyển gien có thể thực hiện đơn giản bằng cách phun ddịch có chứ gien cần chuyển + vector lên trên các chồi

PP sử dụng súng bắn gien (“Gene gun” method)

DN A

TB TV

Source: Monsanto

N ST của TVGien cần chuyểnpellets

Đây là PP vật lý:

• Các hạt kim loại (vàng hoặc titan) rất nhỏ có ADN bám xung quanh, nằm trong ddịch huyền phù, được sử dụng thành giọt nhỏ trong súng bắn gien

• Các hạt được bắn ra do áp lực từ buồng nén khí của súng bắn gien

• Các hạt lớn bị giữ lại ở màng ngăn (stopping plate), nhưng các hạt nhỏ tiếp tục di chuyển và đi vào các TB TV phía dưới

• Kết quả là ADN cần chuyển sẽ được đưa vào TB TV

PP sử dụng súng bắn gien (“Gene gun” method)

Súng bắn gien được sử dụng thành công trên bắp lúa lúa mì, lúa mạch và nhiều loại hoa màu khác.

Mô hình vận hành của súng bắn gien

VK Agrobacterium tumefaciens chuyển 1 phần ADN của chúng vào TB TV.

Hiejn tượng này được ghi nhận trên nhiều loại cây kiểng, cây

ăn trái
tạo ra khối u trên cây.

Source: Ohio State Univ

PP chuyển gien sử dụng Agrobacterium

T-DN A (mang gien chuyển)

(Ti) plasmid mang gien chuyển

Trong cơ chế chuyển gien bằng Agrobacterium, cần tác động của nhiều gien vir (nằm trên T-DN A):

Cơ chế chuyển gien bằng Agrobacterium

+ T-DN A đi vào bên trong TB TV qua vết thương, sau đó di chuyển vào nhân và gắn vào bộ gien của TB TV

+ Một giả thuyết cho rằng, khi vào được bên trong TB TV,

T-DN A sẽ đợi đến khi T-DN A của TB TV nhân đôi, hoặc sao mã mới gắn vào bộ gien của TB TV

Cơ chế chuyển gien bằng Agrobacterium

Event = Là những dòng nhận gien chuyển một cách thành công.Các dòng mang chuyển gien sẽ khác nhau ở thành phần gien chuyển nhận được và ở vị trí mà gien gắn vào trên bộ gien của

TB nhận

Dòng mang chuyển gien (Transgenic “event”)

Bắp có 10 N ST, bất cứ N ST nào cũng có thể nhận gien chuyển
có thể có nhiều dòng mang chuyển gien khác nhau

N hận diện các TB/mô đã nhận được gien chuyển bằng cách sử dụng môi trường chọn lọc.

Cá thể đã nhận được gien chuyển

Bước 5:

Môi trường chọn lọc (chứa kháng sinh, thuốc trừ cỏ )

Tái tạo lại cây bằng phương pháp nuôi cấy

mô (in vitro).

Nguồn: USDABước 6:

N hững kỹ thuật mới sẽ được ngày càn hoàn thiện để nâng cao hiệu quả chuyển gien và khắc phục các ảnh hưởng có thể có đối với sức khỏe và môi trường, cụ thể là:

• Định hướng chính xác vị trí gắn của gien chuyển

• Sử dụng các marker chọn lọc mới tay cho các gien kháng với kháng sinh đang được sử dụng phổ biến hiện nay

• Kiểm soát tốt hơn biểu hiện của gien chuyển trong cơ thể nhận (định hướng được thời gian và vị trí biểu hiện của gien chuyển)

• Có tể chuyển gien vào lục lạp (chloroplasts) thay vì chuyển gien vào trong nhân

Tương lai của KT chuyển gien trên thực vật

Đánh giá biểu hiện của cây chuyển gien

• Kiểm tra sự hiện diện của gien chuyển và hoạt động của chúng

• Khảo sát ảnh hưởng của gien chuyển trên sự sinh trưởng phát triển của cây nhận

• Khảo sát ảnh hưởng của gien chuyển đến môi trường

• Khảo sát tính an toàn của gien chuyern khi được sử dụng làm thứ ăn cho người hay gia súc

Bước 7:

Kiểm tra sự hiện diện và hoạt động của gien chuyển trên cây nhận (cây chuyển gien)

• KT lai Southern (Southern blot)
xác đinh xem gien chuyển

có nằm trên bộ gien của cây nhận ?

• KT lai N orthern (N orthern blot)
xác định xem gien chuyển

co sao mã thành ARN m trong cây nhận ?

• KT lai Western (Western blot)
xác định xem protein có được tổng hợp từ gien chuyển, bên trong cây nhận ?

• Cây nhận có biểu hiện ra tính trạng mong muốn hay không ?

Sử dụng PP hồi giao (Backcross) để đưa gien chuyển từ các cây chuyển gien vào các giống ưu tú đang phổ biến trong SX

• Đối với hầu hết các loài TV, chỉ có 1 vài dòng/giống cho hiệu quả chuyển gien cao, tuy nhiên các dòng/giống này thường mang các đặc tính nông học và chất lượng không cao

• Vì vậy, sau khi tạo được các cây chuyển gien đầu tiên, cần sử dụng PP hồi giao nhiều lần để đưa gien chuyển từ các cây chuyển gien vào các giống ưu tú đang được sử dụng phổ biến trong SX

Các ứng dụng trên thực vật đang được áp dụng KT chuyển gien

• Kháng thuốc trừ cỏ

• Kháng côn trùng

• Gia tăng năng suất và phNm chất

• Thực phNm chức năng

• Sử dụng cây trồng như ‘lò P/ứ sinh học’ (bioreactors)

• N ăng lượng sinh học (Biofuels)

• Gia tăng chất lượng gỗ

• Liệu pháp sinh học dùng trong y học (Bioremediation)

Hết seminar 3