Kỹ thuật chuyển gen cho động vật ppt

mục đích chuyển gen • Chuyển gen vào các dòng tế bào động vật nuôi cấy để sản xuất protein in tái tổ hợp • Tạo vật nuôi chuyển gen với đặc tính cải tiến mới về các sản phẩm sữa, thịt, lô

Kỹ thuật chuyển gen cho

động vật

I KháI NIệM Về chuyển gen Cho động vật

1.1 Định nghĩa

Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đ−a một hay nhiều

gen lạ đ đ−ợc thiết kế ở dạng ADN tái tổ hợp vào tế

bào chủ của động vật làm cho gen lạ có thể tồn tại ở

dạng plasmit tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào

chủ Trong tế bào chủ, các gen này hoạt động tổng hợp

nên các protein đặc tr−ng dẫn tới việc xuất hiện các

đặc tính mới của cơ thể chuyển gen

đối với các thể nhân chuẩn, việc chuyển gen đ−ợc

xem là thành công khi gen chuyển vào đ−ợc tổ hợp vào

genom của tế bào chủ, đặc tính của gen chuyển nạp

đ−ợc duy trì ổn đinh qua các thế hệ con cháu

1.2.Lược sử phát triển

1977 Gurdon chuyển ARNm và ADN vào

phôi Xenopus (ếch) và quan sát thấy sự biểu

hiện chức năng của chúng

1980 Brinster và cs nhận được kết quả

tương tự ở chuột

1981 Wagner và cs đã cấy chuyển thành

công gen β-globulin của thỏ vào phôi chuột

Từ 1985 nhiều tác giả thành công trong tạo

thỏ, cừu, lợn, bò… chuyển gen và các vật

nuôi chuyển gen tăng trưởng nhanh được

ứng dụng mạnh mẽ trong nông nghiệp

1.3 mục đích chuyển gen

• Chuyển gen vào các dòng tế bào động vật nuôi cấy để sản

xuất protein in tái tổ hợp

• Tạo vật nuôi chuyển gen với đặc tính cải tiến mới về các

sản phẩm sữa, thịt, lông…

• Biến vật nuôi thành bioreacter sản xuất protein tái tổ hợp

• Tạo vật nuôi chuyển gen “knock out” làm mô hình nghiên

cứu về y sinh học các bệnh di truyền

• Chuyển gen liệu pháp nhằm chữa trị các bệnh di truyền

(của người)

1.4 Đối tượng chuyển gen

Hầu hết các phương pháp chuyển gen được phát

triển trên mô hình chuột và sau đó chúng được ứng

dụng trên gia súc, gia cầm

Việc chuyển gen thường được thao tác trên:

- Tế bào trứng đ thụ tinh

- Tế bào tinh trùng

- Mô phôi ở giai đoạn sớm

- Tế bào gốc phôi

II.Các phương pháp chuyển

gen vào tế bào động vật

Phương pháp chuyển gen trực tiếp :

-Chuyển gen nhờ phốt phát canxi

-Chuyển gen nhờ xung điện

-Chuyển gen nhờ vi tiêm

-Chuyển gen nhờ liposom

Phương pháp chuyển gen gián tiếp :

Chuyển gen nhờ virus

II.1.Các phương pháp Chuyển gen

trực tiếp

1.Chuyển gen nhờ phosphat canxi

Kỹ thuật phosphat canxi để đưa gen vào tế bào

động vật có vú lần đầu được Graham và Vander

Eb đề xuất năm 1973 và cho đến nay vẫn được áp

dụng rộng rãi

Kỹ thuật này có thể sử dụng để đưa DNA vào tế

bào động vật có vú với mục đích các test thể hiện

chuyển nạp hay biến nạp lâu dài

1.Chuyển gen nhờ phosphat

canxi

Nguyên tắc:

• Các DNA ngoại lai được trộn với CaCl2 sau đó

được chuyển vào một dung dịch chứa ion phosphat

Một phức hợp đồng ngưng kết (coprecipitate) giữa

canxi phosphat và DNA sẽ được hình thành

• Phức hợp này sẽ được các tế bào động vật có vú tiếp

nhận khi nuôi cấy thông qua thực bào , kết quả là

có thể tạo tế bào chuyển gen với sự thể hiện gen

ngoại lai trong tế bào

• Các DNA chuyển nạp mang một gen chỉ thị chọn

lọc (như gen aminoglycoside phosphotransferase)

để giúp cho việc thanh lọc các tế bào không tiếp

nhận DNA

2.Chuyển gen nhờ xung điện

Nguyên tắc:

• Khi trong điện trường có một mật độ tế bào cao

và tạo ra một xung điện (điện thế cao trong một thời gian rất ngắn), lúc đó trên màng tế bào xuất hiện các lỗ nhỏ.

• Qua các lỗ này, DNA có thể đi sâu vào trong tế bào và ở một số tế bào chúng có thể tương tác với genome của tế bào tạo tế bào chuyển gen

• Máy tạo xung điện thường được thiết lập một côngsuất ổn định và cả thời gian gây xung ổn định vớicác điện thế biến đổi từ 500-1500 v/cm

• Đối với hầu hết tế bào, sự thiết lập như vậy đảm bảo 20-50% số tế bào còn sống sau khi thực nghiệmchuyển DNA

• Quá trình chuyển gen nhờ xung điện được thựchiện ở nhiệt độ phòng còn các tế bào được giữ liêntục trong đá để kéo dài thời gian mở lỗ các tế bào

M¸y t¹o xung ®iÖn

2.Chuyển gen nhờ xung

Chú ý

• Các DNA đã được duỗi thẳng cho hiệu quả chuyển gen

cao hơn các DNA ở dạng siêu xoắn, do ở dạng thẳng

chúng dễ tương tác hơn vào bộ genome của tế bào đích

• Để chuyển gen bằng kĩ thuật này cần sử dụng huyền

phù tế bào đơn, tránh sử dụng các tế bào dính lại với

nhau vì các khối tế bào này hay dính vào thành bình

làm giảm hiệu quả chuyển nạp

• Nói chung, để chuyển gen bằng phương pháp này cần

sử dụng nhiều DNA cũng như tế bào hơn so với phương

pháp hoá học

• Mỗi loại tế bào có các thông số kỹ thuật tối ưu khác

nhau khi sử dụng kĩ thuật này

3.Chuyển gen nhờ vi tiêm

Nguyên tắc:

• Tiêm trực tiếp ADN ngoại lai vào nhân tế bào động vật nhờ dụng cụ

vi tiêm với kim tiêm rất mảnh

• Phương pháp này cho kết quả rất cao nhưng số lượng tế bào được xử

lý nhỏ do phải thao tác trên từng tế bào

• Phương pháp này thường dùng để đưa ADN vào hợp tử hoặc các tế

bào phôi sớm

• Việc chuyển gen vào tế bào động vật tốt nhất là chuyển vào một

trong những nhân con của trứng đ thụ tinh trước khi các nhân con

kết hợp với nhau để tạo ra hợp tử lưỡng bội

• Bằng cách chuyển gen vào giai đoạn tiền nhân, gen chuyển vào sẽ

được truyền cho các thế hệ phôi tiếp theo và có thể di truyền cho con

cháu

3.chuyển gen bằng vi tiêm (tiếp)

Các bước tiến hành:

• Thiết kế cấu trúc gen chuyển

• Gây siêu bài non ở con cái, thu nhận hợp tử

sau khi giao phối

• Chuẩn bị dung dịch ADN cho vi tiêm

• Chuẩn bị tế bào hợp tử

• Vi tiêm ADN vào tiền nhân

• Chuyển phôi vi tiêm vào cơ thể nhận

• Kiểm tra gen chuyển ở con non Lai tạo để

củng cố di truyền

ThiÕt bÞ chuyÓn gen b»ng vi tiªm

4.Chuyển gen nhờ Liposom

4.1.Nguyên lý thiết kế vectơ chuyển gen liposom

• Phương pháp dựa trên sự tương tác ion của DNA và thể liposome

tạo ra một thể phức hợp, phức hợp này có thể phóng thích các DNA

chức năng vào tế bào nuôi cấy

• Liposom cấu tạo từ các lớp màng lipid tạo dạng túi, bên trong chứa

nước, kích thước khoảng 10 nm đến 1000 nm Liposom thường có

một lớp lipid mang điện tích dương (lipofecamin) và các phân tử

lipid trung tính nên liposom có điện tích dương (+) vì vậy nó có thể

kết hợp với các phân tử, hoặc các chất mang điện tích âm (-) tạo

thành phức hợp ổn định.

• Thiết kế tạo vectơ liposom thực chất là tạo các phức hợp liposom

-DNA Phân tử DNA có điện tích âm (-) có thể kết hợp với liposom

tạo nên các phức hợp ổn định, được sử dụng làm vectơ chuyển gen

Sơ đồ cấu trúc và

hoạt động của

vec tơ liposom

4.Chuyển gen nhờ Liposom (tiếp)

4.2.Cơ chế hoạt động của vectơ liposom

• Vectơ liposom có khả năng tiếp xúc với màng tế bào

của các tế bào đích và chui qua màng tế bào, khi đó lớp

các phân tử lipid bị phân huỷ làm cho các gen mục tiêu

đ−ợc đ−a vào trong tế bào

• Gen mục tiêu có thể đ−ợc đ−a vào trong nhân, tồn tại

trong nhân nh− những đơn vị gen độc lập Trong nhân

các gen mục tiêu có thể có quá trình tái tổ hợp làm cho

gen này đ−ợc gắn vào bộ gen của tế bào chủ tạo tế bào

đ−ợc chuyển gen

ii.2 chuyển gen gián tiếp nhờ virus

Nguyên lý chung

Khi xâm nhiễm vào tế bào, virus có khả năng

chuyển bộ gen của nó vào tế bào chủ.

 Một số nhóm virus có thể gắn bộ gen hoặc một

số gen của chúng vào bộ gen tế bào chủ, tạo

thành một thể thống nhất

Các gen virus gắn với bộ gen của tế bào chủ có

thể tồn tại lâu dài cùng với quá trình phân chia

của tế bào chủ, tạo nên các provirus.

ii.2 chuyển gen gián tiếp nhờ

virus (tiếp)

Khi trong cơ thể hay từ ngoài môi trường có

một tác nhân nào đó không bình thường tác

động vào provirus, làm cho bộ gen virus tách

khỏi bộ gen tế bào chủ, thực hiện quá trình tái

bản gen virus và các thành phần của virus

trong tế bào chủ

Quá trình lắp ghép các thành phần của virus

tạo nên các virion, các virion hoạt động tạo nên

vô số virus mới phá vỡ tế bào chủ, tiếp tục xâm

nhiễm các tế bào khác

• Chu trình

lây nhiễm

của virus

ii.2 chuyển gen gián tiếp nhờ

virus (tiếp)

 Trên cơ sở hiểu biết đặc điểm và cơ chế xâm nhiễm

của virus vào tế bào chủ, con người đ tìm ra các biện

pháp loại bỏ hoặc gây bất hoạt các gen có hại của

virus, nhưng vẫn giữ lại các gen virus giúp cho sự xâm

nhiễm và gắn gen vào bộ gen của tế bào, tạo nên các

vectơ chuyển gen

 Vectơ chuyển gen hình thành từ những virus biến đổi

gen như trên được gọi là vectơ chuyển gen có bản chất

virus Trong các vectơ này, gen ngoại lai cần chuyển

nạp được thay thế vào vị trí một số gen của virus,

nhưng vẫn đảm bảo để virus có khả năng xâm nhiễm

và chuyển gen vào tế bào, hoặc gắn gen ngoại lai với

bộ gen của tế bào đích nhằm thực hiện chức năng

chuyển gen

ii.2 chuyển gen gián tiếp nhờ

virus (tiếp) Vectơ virus gồm một số loại chủ yếu:

+Vectơ retrovirus (ARN)

+Vectơ adenovirus (ADN sợi kép)

+Vectơ adeno-associated virus (ADN sợi đơn)

+ Vectơ herpes simplex virus (ADN sợi kép)

+ Vectơ baculovirus (ADN vòng kép)

1.chuyển gen nhờ Vectơ retrovirus

1.1 Đặc điểm cấu tạo và di truyền của retrovirus

• Retrovirus là loại virus RNA có khả năng xâm nhiễm tế bào

chủ cao và có khả năng gắn bộ gen virus với bộ gen tế bào

chủ Đó là cơ sở thuận lợi để thiết kế các vectơ chuyển gen

hiệu quả.

• Cấu trúc retrovirus gồm:

 Phần vỏ có 3 lớp:lớp vỏ ngoài cùng là glycoprotein, tiếp đến

lớp vỏ kép lipid, lớp trong cùng là vỏ capsid

 Bên trong lớp vỏ capsid là phần lõi RNA gồm 2 sợi đồng

dạng và các loại enzym của virus:

 Enzym phiên mã ngược (reverse transcriptase) giúp virus

chuyển bộ gen RNA sang dạng cDNA mạch kép

 Enzym cài xen (integrase) giúp cho quá trình cài xen bộ gen

của virus với bộ gen của tế bào chủ ở những điểm tương

đồng.

• Retrovirus

life cycle

Sơ đồ cấu trúc của Retrovirus

• Bộ gen retrovirus gồm hai sợi RNA có cấu trúc và kích trước

giống nhau (7 kb - 11 kb) Mỗi sợi RNA chứa 3 nhóm gen

chủ yếu: gag, pol, env Cụ thể:

-Gen gag m hoá protein lõi trong thành phần cấu trúc hạt

virion

-Gen pol m hoá enzyme phiên m ngược và các enzyme cần

thiết cho hoạt động của virus

-Gen env m hoá protein trong cấu trúc các lớp vỏ của virus

• Hai đầu mỗi sợi RNA có một trình tự lặp dài tận cùng - LTR

(long terminal repeats) mang một số trình tự cần thiết cho

quá trình biểu hiện gen của virus và một trình tự đặc hiệu

giúp cho quá trình gắn bộ gen của virus với bộ gen của tế

bào chủ.

• Tại đầu 5 ’ -LTR có một trình tự giúp quá trình đóng gói bộ

gen của virus gọi là trình tự ψ (psi) ψ

1.1.chuyển gen nhờ Vectơ

1.2.Nguyên lý thiết kế vectơ retrovirus

Thiết kế vectơ retrovirus là một quá trình phức tạp, gồm nhiều

giai đoạn khác nhau:

 Loại bỏ các gen chủ yếu của virus gag, pol, env và thay thế

bằng gen cần chuyển nạp (gen mục tiêu) tạo thành vectơ bộ

gen (vector genome)

 Xử lý cắt riêng các gen gag, pol và env của retrovirus nh−ng

vẫn đảm bảo chức năng các gen

 Đ−a vectơ bộ gen cùng với các gen gag, pol và env đ xử lý

của virus vào một tế bào đặc hiệu là tế bào đóng gói

 Trong tế bào đóng gói, các gen virus hoạt động tổng hợp các

thành phần vỏ của virus, các thành phần vỏ này kết hợp với

vectơ mang gen mục tiêu hình thành nên vectơ retrovirus

Retrovirus vector

• Retrovirus Packing Kit Ampho ,Company :Takara Mirus Bio, Price$252.00

• This kit is designed to obtain transient high-titer recombinant retrovirus particles by

co-transfection of retrovirus vector plasmid with target gene and two unique vectors for

packaging, using calcium phosphate method This kit contains a gag-pol expression

vector and an amphotropic env expression vector The recombinant virus obtained using

this kit are able to infect most mammalian cells.

1.chuyển gen nhờ Vectơ

1.3.Cơ chế hoạt động của vectơ retrovirus

• Vectơ retrovirus được đưa đến các tế bào đích bằng

nhiều kỹ thuật khác nhau Khi tiếp cận tế bào đích ở

những thụ thể (receiptor), vectơ retrovirus được đưa vào

bên trong tế bào Trong tế bào chất của tế bào đích các

thành phần vỏ của vectơ bị phân huỷ, phần lõi RNA

được giải phóng

• Enzym phiên mã ngược của virus xúc tác quá trình

chuyển RNA sợi đơn thành cDNA sợi kép cDNA qua lỗ

màng nhân vào trong nhân tế bào đích, nhờ enzym cài

xencủa virus làm cho cDNA mạch kép được gắn xen vào

bộ gen ở những điểm tương đồng Gen mục tiêu cũng

đồng thời được gắn vào bộ gen của tế bào đích, phiên mã

và dịch mã tạo nên các protein sản phẩm của gen mục

tiêu trong tế bào đích

Sơ đồ hoạt động của vec tơ retrovirus

Tế bào đóng gói Tế bào đích

2.chuyển gen nhờ Vectơ

baculovirus

2.1.Cấu trúc baculovirus

• Baculovirus có bộ gen ADN vòng, chuỗi kép lớn (từ 88 tới

200Kbp) Bộ gen này được liên kết với protein kiềm- giầu

arginin (6,5KDa.) nằm bên trong nucleocapsid chứa protein

capsid (39KDa.) Kích thước của bộ gen virus xác định theo

kích thước của nucleocapsid (chiều dài khoảng 200 – 400nm,

chiều rộng khoảng 36nm).

• Nucleocapsid được gói trong vỏ lipoprotein để hình thành

tiểu phần virus hay virion

• Các virion được vùi trong nền polyhedron Polyhedron gồm

nhiều protein đơn giản (polyhedrin)

• Polyhedra (hạt baculovirus) là những cấu trúc lớn có kích

thứơc 1 - 15à à àm với vỏ polysacarit cứng bọc ngoài để bảo vệ.

A) Baculovirus particles, or polyhedra; B) Cross-section of a

polyhedron; C) Diagram of polyhedron cross-section Electron

micrographs (A&B) by Jean Adams, graphic â by V D'Amico

Baculovirus Polyhedra trong tÕ bµo

2.2 Sự nhân lên của baculovirus in vivo

• Giai đoạn ấu trùng của côn trùng rất dễ bị nhiễm Baculovirus qua

đường tiêu hóa Polyhedra được hoà tan trong môi trường kiềm ở

ruột, giải phóng ra những virion

• Vỏ lipoprotein của virion hoà vào màng bào tương của tế bào thành

ruột và giải phóng nucleocapsid vào trong bào tương

• Nucleocapsid vận chuyển ADN virus vào nhân tế bào

• Baculovirus sản sinh ra 2 dang cấu trúc khác hẳn nhau trong 2 giai

đoạn của chu kỳ nhân virus:

 Tế bào nhiễm vòng một tạo virus xuất ngoại (extracellular virus –

ECV) được giải phóng vào haemolymph (huyết tương) để gây

nhiễm cho các tế bào khác trong chính cơ thể ấu trùng.

 Các tế bào bị nhiễm vòng hai của sự nhân virus trong ấu trùng

cũng sản xuất ECV nhưng có thêm tiểu phần virus (virion) trong

polyhedra Sự tích tụ polyhedra trong côn trùng được tiến hành cho

đến khi vật chủ biến thành một túi virus Giai đoạn cuối này, ấu

trùng hoá lỏng và giải phóng polyhedra đi gây nhiễm cho côn

trùng khác

2.3.Thiết kế vectơ baculovirus

• Bộ gen của baculovirus rất lớn nên rất khó gài trực

tiếp ADN ngoại lai

• Sử dụng plasmid (pUC) làm vectơ vận chuyển gen

ngoại lai và có gài promoter polyhedrin, tạo vectơ

vận chuyển tái tổ hợp

• Đồng chuyển nhiễm vào tế bào côn trùng (sâu

khoang-Spodoptera frugiperda) vectơ vận chuyển tái

tổ hợp và ADN cải biến của baculovirus (Autographa

californica nuclear polyhedrosisvirus -AcNPV)) và

thông qua sự tái tổ hợp đồng nhất trong tế bào sâu

tạo đ−ợc vectơ virus tái tổ hợp mang gen ngoại lai

tính kháng bệnh ở vật nuôi (gen kháng bệnh chuyên biệt, gen

receptor tế bào T, gen mã hoá lymphokine, …)

• Cải tiến chất l−ợng, thành phần sản phẩm: chuyển gen làm

giảm hàm l−ợng lactose trong sữa, tăng hàm l−ợng cystein để

gia tăng sự phát triển lông

• Gene-farming: dùng động vật nh− hệ thống cải biến sinh học

để sản xuất các protein đặc biệt

1 Các hướng nghiên cứu tạo vật nuôi

chuyển gen (tiếp)

• Để kỹ thuật chuyển gen trở thành công cụ hiệu

quả trong tạo giống động vật cần tập trung

nghiên cứu các vấn đề cơ bản sau:

Cải thiện tối ưu các phương pháp chuyển gen

Phân lập và định tính được các gen mục tiêu

Phân lập và đinh tính được các nhân tố điều

hoà thích hợp (promotor, enhance…)

2.Một số thành tựutrong tạo động vật chuyển gen

2.1.Chuyển gen làm tăng

sức sinh trưởng

• Chuyển gen tạo hocmon sinh

trưởng cho chuột, lợn, cừu,

cỏ hồi bằng phương phỏp vi

tiờm gen GH vào nhõn con

của trứng đó thụ tinh, đó thu

được động vật chuyển gen cú

biểu hiện của gen chuyển nạp

• ((Tỷ lệ thành công khi chuyển

gen: chuột 25%, lợn: 10,4%,

cừu: 1,3% và bò 0,6%) Chuột chuyển gen hoocmon sinh trưởng

(phải) và chuột đối chứng

1 Các hướng nghiên cứu tạo vật ni

chuyển gen< /h3> (tiếp)

• Để kỹ thuật chuyển gen trở thành công cụ hiệu

quả tạo giống động vật cần tập trung

nghiên... tựutrong tạo động vật chuyển gen

2.1 .Chuyển gen làm tăng

sức sinh trưởng

• Chuyển gen tạo hocmon sinh

trưởng cho chuột,... nhau:

 Loại bỏ gen chủ yếu virus gag, pol, env thay

bằng gen cần chuyển nạp (gen mục tiêu) tạo thành vectơ

gen (vector genome)

 Xử lý cắt riêng gen gag, pol env retrovirus