tt-hc3b3a-sinh-c491e1baa1i-cc6b0c6a1ng-2013

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme – 2.4.. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme– 2.5.. CÁC PHẢN ỨNG SA LẮNG PROTEIN... • Ứng dụng: – Chiết suất các protein hoạt tính...

THỰC HÀNH HÓA SINH ĐẠI CƯƠNG

NỘI DUNG

• I THỰC NGHIỆM VỀ PROTEIN

– 1.1 Các phản ứng màu

– 1.2 Khảo sát một số lý tính của protein

• II THỰC NGHIỆM VỀ ENZYME

– 2.1 Phản ứng Tromer

– 2.2 Thủy phân tinh bột bởi amylase

– 2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme

– 2.4 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme– 2.5 Tính đặc hiệu của enzyme

I THỰC NGHIỆM VỀ PROTEIN 1.1 Các phản ứng màu

Phản ứng Biure

• Cho vào cả 4 ống 1ml NaOH 10%

• Cho vào cả 4 ống 1-2 giọt CuSO41%

• Lắc đều so sánh màu và giải thích kết quả

Phản ứng Xanthoprotein

• Nguyờn lý:

• Các protein có chứa aa mạch vòng nh :

Phe, Tyr, Trp, … dưới t d ới t ỏc dụng của HNO3

đặc, b nit ị nitơ ơ húa  màu vàng, nếu gặp môi

tr ờng kiềm mạnh muối có màu da cam.

Cỏc bước tiến hành

• 1: 1 ml lũng trắng trứng, 1ml HNO3 đặc

• 2: 1 ml sữa tươi, 1ml HNO3 đặc

• 3: 1 ml gelatin 1%, 1ml HNO3 đặc

• Đun trên đèn cồn un trên đèn cồn  màu vàng ể nguội Đun trên đèn cồn

• Cho từ từ từng giọt NaOH 20% (kho ng 1-2 ml) ảng 1-2 ml)  màu vàng da cam

1 2 3

1.2 CÁC PHẢN ỨNG SA LẮNG PROTEIN

sẽ tủa ở nh ng nồng độ muối khác nhau ững nồng độ muối khác nhau Vỡ vậy

có thể tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp.

• Ứng dụng:

– Chiết suất các protein hoạt tính.

- Để 5 phút, lọc sang ống 3

- Thử phản ứng Biure

Sa lắng bằng cồn

• Nguyờn lý:

– Protein bị kết tủa bông hoặc vẩn trong dung môi h/cơ nh  :

cồn, aceton, eter, Do protein bị mất lớp vỏ thủy hóa

– Tủa càng dễ nếu có thêm NaCl

– Kết tủa bằng cồn có thể là kết tủa thuận nghịch nếu tiến

hành ở nhiệt độ thấp (0 0 đến 15– 0 C) và tủa đ ợc tách khỏi cồn một cách nhanh chóng.

• Ứng dụng:

– Dùng cồn sát trùng

– Tách chiết enzyme

Sa lắng bởi nhiệt độ cao

• Nguyên lý:

– Protein khi b đun nóng sẽ bị xáo trộn về mặt c u truc ị nitơ ấu truc

phân tử, mất lớp vỏ thủy hóa nên mất tính hòa tan và bị

đông vón Hiện t ợng này x y ra mạnh ở điểm đẳng điện ảng 1-2 ml)

– Nếu sự biến tính này x y ra ở pH khác nhau (trong môi tr ảng 1-2 ml) ờng kiềm mạnh, hoặc acid mạnh), protein vẫn ở trạng thái tích điện nên không bị đông vón mà ở dạng dung dịch.

• Ứng dụng:

– Dùng nhiệt độ cao để hấp, sấy nh m tiệt trùng ằm tiệt trùng

các dụng cụ

Các bước tiến hành

Cho vào 5 ống mỗi ống 2ml lòng trắng trứng

1: Đun sôi

2: thêm 1 giọt acid acetic 1%

3: thêm 0.5 ml acid acetic 10%

4: thêm 0.5 ml acid acetic 10% + 3-4 giọt NaCl bão hòa

5: thêm 0,5 ml NaOH 10%

Đun sôi cả 4 ống, quan sát, nhận xét và giải thích kết quả

II THỰC NGHIỆM VỀ ENZYME

Thủy phân tinh bột bởi amylase

• Nguyên lý:

– Tinh bột là polysaccharide gồm nhiều đơn vị

D-glucose nối với nhau nhờ liên kết 1,4- và liên kết 1,6-glycoside Tinh bột không có nhóm aldehyde tự

α-do trong phân tử, nên không cho phản ứng tromer âm tính

– Khi tinh bột bị amylase của nước bọt thủy phân, giải phóng đường đơn glucose tự do cho phản ứng

tromer dương tính

Cỏc bước tiến hành

• Điều chế dung dịch amylase

– Súc miệng bằng n ớc cất

– Ngậm một ít n ớc cất kho ng 1-3 phút, khẽ cử động l ỡi ảng 1-2 ml)

để trộn đều n ớc bọt với n ớc cất, rồi cho qua phễu đó

cú bụng ho c gi y l c, lọc vào ống ặc giấy lọc, lọc vào ống ấu truc ọc, lọc vào ống  được dd c dd

amylase

Amylase

TN ĐC

TN: 3ml tinh bột 1%, 2ml amylase ĐC: 3ml tinh bột 1%, 2ml nước cất

Nhỏ lên phiến sứ 2 dãy lugol 1%

Chú ý:

+ Không nhỏ quá đầy + 1 dãy TN, 1 dãy ĐC

- Nhỏ vài gi t t ng TN ọc, lọc vào ống ừ ống TN ống TN vào 1 l ỗ ở ở dóy TN

- Nh ỏ vài gi t t ng C ọc, lọc vào ống ừ ống TN ống TN Đun trên đèn cồn vào 1 l ỗ ở ở dóy

C Sau kho ng 2

Đun trên đèn cồn ảng 1-2 ml) phỳt l i nh ại nhỏ ỏ vào l ti p ỗ ở ếp theo - Quan sát sự đổi màu và nhận xét.

PhÇn cßn l¹i cña 2 èng thö b»ng ph n ng Tromer ảng 1-2 ml) ứng Tromer

TN ĐC

- Cho vào cả 2 ống mỗi ống:

- 1 ml NaOH 10%, 5-10 giät CuSO4 5%

- Đun sôi, quan sát màu của ống nghiệm

Chú ý: Nếu dd có D-glucose thì dd trong ống nghiệm sẽ chuyển màu đỏ gạch

thân nhiệt Nếu nhiệt độ quá thấp thỡ enzyme

sẽ hoạt động rất yếu, ngựơc lại nếu nhiệt độ cao thỡ enzyme sẽ bị tê liệt và bị huỷ hoại.

- Cho vào cả 3 ống mỗi ống 1 ml tinh bột 1%

- Để yên trong 5-10 phút, thử bằng dd lugol 1%

hoặc bằng phản ứng Tromer Nhận xét và giải

thích kết quả

Tác dụng đặc hiệu c a ủa

– pH mụi trường càng gần pH tối u, tốc độ ph n ảng 1-2 ml)

ng càng cao, nghĩa là enzyme ho t ng

- Lấy thật chính xác vào các ống nghiệm đánh số từ 1- 8 theo

b ngảng 1-2 ml)

- Lắc đều, để 10 rồi thử bằng dd lugol 1%, cho biết kết qu và ’ rồi thử bằng dd lugol 1%, cho biết kết quả và ảng 1-2 ml) nhận xét