2.2. Trang thiết bị, dụng cụ và phương pháp nghiên cứu
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2.1.Phương pháp kiểm tra vi sinh vật bằng nuôi cấy truyền thống
Phương pháp truyền thống là phương pháp phổ biến nhất trong các nghiên cứu vi sinh vật học. Trên môi trường đặc mỗi vi sinh vật sẽ phát triển thành khuẩn lạc hoặc sự sinh khí và biểu hiện đục ở ống nghiệm. Dựa trên đấy có thể kiểm tra số lƣợng vi sinh vật trong mỗi đơn vị thể tích của dịch nghiên cứu. Phương pháp đếm khuẩn lạc thường được sử dụng để kiểm tra số lượng nấm men, nấm mốc.
+ Ưu điểm của phương pháp là không phát hiện nhầm các vi sinh vật chết hoặc các mảnh xác hữu cơ, vì chỉ có bào tử hoặc các tế bào sống mới phát triển thành khuẩn lạc hoặc cho phản ứng sinh khí.
+ Nhƣợc điểm: Khi làm dịch pha loãng không phải mọi vi sinh vật đều có thể tách khỏi bề mặt chất rắn để hòa tan vào nước. Không có loại môi trường dinh dƣỡng nào cho phép tất cả các nhóm vi sinh vật cùng phát triển. Các vi sinh vật phát triển trên mỗi loại môi trường chỉ tồn tại một nhóm sinh lý nhất định.
Đối với vi sinh vật mà những bào tử thường dính chặt vào nhau thành từng chuỗi, từng đôi, từng khối thì khi phát triển trên môi trường, thì mỗi chuỗi, mỗi khối chỉ hình thành một khuẩn lạc. Vì vậy số khuẩn lạc chƣa phản ánh đƣợc chính xác số tế bào, bào tử trong dịch nghiên cứu.
Khi cấy dịch pha loãng chênh nhau 10 lần không bao giờ thấy đƣợc số khuẩn lạc chênh nhau 10 lần. Vì vậy muốn kết quả phân tích có giá trị so sánh
27
tốt, chúng ta nên sử dụng một độ pha loãng thống nhất với từng nhóm vi sinh vật.
2.2.2.1.1. Phương pháp xác định tổng số Coliform và E.coli
Cấy vào 5 ống đựng môi trường canh thang lỏng nồng độ kép với một lƣợng 10 mL mẫu (hoặc dung dịch mẫu pha loãng), trong mỗi ống đều thả ống duham lộn ngược. Tiếp theo, cấy vào 5 ống đựng môi trường canh thang lỏng nồng độ đơn với một lƣợng 1 mL mẫu (hoặc dung dịch mẫu pha loãng), trong mỗi ống đều thả ống duham lộn ngƣợc. Cấy vào 5 ống đựng môi trường canh thang lỏng nồng độ đơn với một lượng 0.1 mL mẫu (hoặc dung dịch mẫu pha loãng), trong mỗi ống đều thả ống duham lộn ngƣợc.
Ủ các ống sau khi cho mẫu vào ở nhiệt độ 35oC trong 24 hoặc 48 h và quan sát. Với những ống có biểu hiện đục và sinh khí, chuyển tiếp lần lƣợt 10
mL , 1mL, 0.1mL vào 5 ống môi trường brilliant kép và 5; 5 ống môi trường Brilliant đơn, nuôi tiếp ở 35oC sau 48 h. sau đấy quan sát và đọc kết quả theo bảng kết quả trong ISO 9308-phần II. Mẫu có coliform với biểu hiện đục và sinh khí ở ống.
Chuyển tiếp 10 mL, 1mL, 0.1 mL vào 5 ống môi trường tryptone kép và 5; 5 ống môi trường Tryptone đơn, nuôi tiếp ở 44oC sau 24 h. Cho vào mỗi ống vài giot Kovacs, nếu biểu hiện màu hồng trong ống, chứng tỏ sự có mặt của E.coli.
2.2.2.1.2. Tính tổng số nấm men, nấm mốc
Chuẩn bị dịch pha loãng và môi trường đĩa thạch. Nấu từng loại môi trường thích hợp cho từng nhóm vi sinh vật. Hòa tan môi trường rồi phân phối vào các lọ, khử trùng bằng nồi hấp áp lực ở 121oC trong 15 phút. Lấy 1mL mẫu với tỷ lệ pha loãng nhất định cho vào các hộp đĩa thạch đã đƣợc khử trùng, mỗi mức pha loãng dùng 4 đĩa thạch. Sau đấy rót vào mỗi hộp đĩa khoảng 10 mL môi trường thạch sau khử trùng và để nguội ở 40-50oC. Đậy nắp và xoay tròn mỗi hộp trên mặt tủ cấy, để nguội đến khi mặt thạch đông lại, ghi số mẫu và nồng độ pha loãng lên mỗi đáy hộp petri và bọc giấy báo rồi đem nuôi ở 35oC và đọc kết quả sau 48h ± 3.
2.2.2.1.3. Tổng vi sinh vật hiếu khí
Sử dụng môi trường R2A agar, hòa tan với lượng 15,2g/1000 mL, tiếp theo đem hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút.
Lấy 1 mL mẫu hoặc mẫu đã pha loãng cho vào hộp petri đã đƣợc khử trùng, rót vào khoảng 10 mL môi trường R2A agar đã khử trùng, đậy nắp và xoay tròn đều mỗi hộp trên mặt tủ cấy, để nguội, đợi khi mặt thạch đông lại hoàn toàn sau đấy ghi tên mẫu và nồng độ pha loãng lên đáy hộp petri, bao giấy rồi đem nuôi ở 35oC trong vòng 48h ± 3. Khi đủ thời gian, đem ra đọc kết quả bằng cách đếm các khuẩn lạc trên đĩa thạch. Sau đấy báo cáo số khuẩn lạc trên một đơn vị thể tích mẫu tương ứng.
2.2.2.2. Phương pháp xác định độ sạch bằng ATP quang sinh Để nghiên cứu
dây chuyền sản xuất hành nhƣ sau:
ứng dụng phương pháp kiểm tra nhanh vệ sinh trong bia bằng đo ATP quang sinh, các bước cần phải tiến - Nhận dạng các điểm kiểm tra: Các điểm kiểm tra đƣợc coi là các điểm kiểm soát tới hạn (CCP), đại diện cho hiệu quả của quá trình vệ sinh. Kết quả thu đƣợc sẽ phản ánh thực tế hiệu quả của quá trình vệ sinh.
Các điểm kiểm tra nói chung đƣợc chia làm hai nhóm:
Bề mặt tiếp xúc trực tiếp với sản phẩm và nhóm bề mặt tiếp xúc gián tiếp với sản phẩm.
- Lập kế hoạch lấy mẫu: Căn cứ sơ đồ sản xuất, xây dựng kế hoạch lấy mẫu, tần suất lấy mẫu cho phù hợp từng vị trí kiểm tra.
- Thu thập dữ liệu và xây dựng giới hạn thường quy: Nội dung này giúp nhận diện tình trạng vệ sinh hiện tại của các vị trí kiểm tra. Những dữ liệu này bao gồm tại các vị trí kiểm tra ở cả trạng thái bẩn và trạng thái đã vệ sinh sạch sẽ.
- Xác định các giá trị giới hạn: Sau khi có đủ các số liệu về tình hình vệ sinh ở từng vị trí kiểm soát, kết hợp với theo dõi quá trình sản xuất và những kết quả kiểm tra vệ sinh thông thường sẽ tiến hành xây dựng mức kiểm soát vệ sinh bằng ATP quang sinh.
- Đo ATP quang sinh bằng thiết bị đo HY_LITE 2.
Đặc tính kỹ thuật của máy:
+ Khoảng tuyến tính 0-99000 RLU + Có thể lưu hơn 2000 kết quả đo + Tín hiệu nền < 10 RLU
+ Các dạng kiểm tra: HACCP, Test and store, Test only
+ Đầu dò: photomultiplier (PMT) loại cực nhạy có chức năng bảo vệ quá tải Trong phương pháp xác định bằng ATP quang sinh có hai dạng dụng cụ lấy mẫu đƣợc sử dụng
+ Que lấy mẫu bề mặt:
Bôi lấy mẫu: Rút que lấy mẫu ra khỏi dụng cụ Clean-trace, bôi lên bề mặt kiểm tra với diện tích khoảng 10cm2
Hoạt hóa/lắc: Cẩn thận đặt que lấy mẫu vào dụng cụ Clean-trace, ấn xuống và lắc để hoạt hóa mẫu trong vòng 10 giây.
Đọc kết quả: Đặt dụng cụ Clean-trace vào bộ phận nhận mẫu của máy và đợi đọc kết quả khoảng 10 giây sau đấy.
+ Que lấy mẫu nước:
Bôi que lấy mẫu: Rút que lấy mẫu khỏi dụng cụ Aqua- trace, nhúng que lấy mẫu vào dung dịch kiểm tra
Hoạt hóa/lắc: Cẩn thận đặt que lấy mẫu vào dụng cụ Aqua-trace, lắc để hoạt hóa mẫu trong vòng 10 giây.
Đọc kết quả: Đặt dụng cụ Aqua-trace vào bộ phận nhận mẫu của máy và đợi đọc kết quả trong vòng 10 giây sau đấy.
2.2.2.3. Ứng dụng máy đo quang UV-VIS U- 1900 Đặc tính kỹ thuật
Hệ quang: Ratio beam Bươc sóng: 190-1100nm Độ rộng dải quang phổ: 4 nm
Stray light: trong 0.5 % (220 nm NaI; 340 nm NaNO2) Độ chính xác bước sóng: ± 0.5 nm
Độ tái lặp bước sóng: ± 0.3 nm
Dạng đo: Photometry, Wavelength scan, Time scan, Multiple, Wavelength measurement
Photometric range: Abs (-3.000 tới 3.000)
% T (0 tới 300%T)
Nồng độ (0.000 tới 9999)
Photometric Accuracy : ± 0.002 Abs ( 0 tới 0.5 Abs)
± 0.004 Abs (0.5 tơi 1.0 Abs)
%0.3T
Photometric repeatability : ± 0.001 Abs ( 0 tới 0.5 Abs)
± 0.002 Abs (0.5 tơi 1.0 Abs)
% 0.15 T
Tốc độ scan bước sóng: 10, 100, 200, 400, 800, 1200, 2400, 3600 nm/phút Baseline stability (độ trôi ): 0.0004 Abs/h (500nm, 2 tiếng sau khi bật máy) Baseline flatness: ± 0.002 Abs (200 tới 950 nm)
Baseline level: ± 0.00015 Abs (500nm) Nguồn sáng: WI và đèn D2
Detector: Silicon photodiode
Tiến hành: Các mẫu môi trường phát quang được chuẩn bị. Sử dụng cuvet 20 mm cho phép đo. Chọn dải quét bước sóng tà 190 nm - 1100 nm.
Chương III