Chơng 2: Đối tợng, nội dung và phơng pháp nghiên cứu
2.3. Phơng pháp nghiên cứu
Định lợng AZI trong HT là quá trình phân tích phức tạp yêu cầu phơng pháp phân tích phải có tính chọn lọc tốt, độ nhạy, độ chính xác cao. Sau khi tìm hiểu sâu về đối tợng nghiên cứu, mục tiêu của đề tài và tham khảo tài liệu chúng tôi đã lựa chọn hai phơng án để tiến hành khảo sát đó là: HPLC với detector huỳnh quang và LC-MS.
2.3.1. Khảo sát quy trình định lợng AZI trong dung môi bằng HPLC detector huỳnh quang.
*Chuẩn bị dung dịch:
- Dung dịch chuẩn AZI nồng độ lần lợt là 5, 10, 25, 50, 100 àg/ml trong methanol
- Dung dịch nội chuẩn CLA (IS) 50 àg/ml
- Dung dịch dẫn xuất huỳnh quang FMOC-Cl: 0,5mg/ml - Dung dịch đệm Borat 0,1M pH 7,4
* Khảo sát điều kiện chạy sắc ký.
Khảo sát về cột, nhiệt độ cột, pha động, tốc độ dòng, detector huỳnh quang (bớc sóng kích thích, bớc sóng phát xạ)
* Khảo sát điều kiện tạo dẫn xuất huỳnh quang.
- Khảo sát nhiệt độ phản ứng tạo dẫn xuất: Giữ nguyên các điều kiện phản ứng khác, chỉ thay đổi nhiệt độ từ 30 đến 70oC, cách 10oC
- Khảo sát thời gian phản ứng: Giữ nguyên nhiệt độ phản ứng tối u là 50oC, thay đổi thời gian phản ứng trong khoảng từ 30 đến 60 phút, cách 10 phút.
* Đánh giá một số thông số kỹ thuật của phơng pháp.
- Tính chọn lọc.
- Tính phù hợp của hệ thống sắc ký.
- Khoảng tuyến tính.
- Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lợng (LOQ).
2.3.2. Khảo sát xây dựng quy trình định lợng AZI trong HT bằng LC-MS.
2.3.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn.
Để giảm các yếu tố ảnh hởng đến kết quả phân tích và tăng độ chính sác chúng tôi chọn phơng pháp nội chuẩn. Sau khi tìm hiểu, tham khảo một số tài liệu chúng tôi chọn hai chất có cùng cấu trúc phân tử là CLA và ROXI để tiến hành khảo sát chọn làm chuẩn nội.
- Pha dung dịch chuẩn gốc AZI: cân chính xác chất chuẩn AZI, hòa tan trong methanol để đợc dung dịch gốc. Từ đó pha thành các dung dịch chuẩn thứ cấp có nồng độ 0,2- 20àg/ml trong methanol.
2.3.2.2. Sử lý mẫu
Từ các tính chất lý hóa của AZI và theo các tài liệu đã công bố, chúng tôi chọn xây dựng quy trình sử lý mẫu theo phơng pháp chiết lỏng - lỏng.
2.3.2.3. Khảo sát điều kiện để định lợng AZI.
Tiến hành chạy thử trên từng mẫu AZI, chuẩn nội (IS) và hỗn hợp AZI và IS trong dung môi pha động để:
* Khảo sát điều kiện khối phổ.
- Kỹ thuật MS một lần: phân tích toàn thang để xác định ion phân tử.
- Kỹ thuật SIM sử dụng ion phân tử để định lợng.
* Khảo sát điều kiện sắc ký.
- Cột sắc ký: khảo sát khả năng tách của AZI và IS trên các cột: Thermo C18 (50 x 2,1mm; 5àm) và Zorbax C18 SB (150 x4,6; 5àm).
- Pha động: dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát trên hệ pha động acetonitril : amoni acetat 0,05M với tỷ lệ khác nhau và chạy chế độ
đẳng dòng hay gradient.
- Tốc độ dòng: thay đổi lu lợng pha động từ 0,2 – 0,6ml/phút để xác
định đợc tốc độ phù hợp cho thời gian lu tối u.
- Tiêm mẫu tự động 25àl
2.3.2.4 Thẩm định phơng pháp phân tích
* Tính chọn lọc Chuẩn bị mẫu:
- HT trắng.
- HT có AZI.
- HT có IS.
- HT có AZI và IS.
Xử lý mẫu và tiến hành phân tích
* Tính phù hợp của hệ thống sắc ký
Chuẩn bị mẫu chuẩn có AZI và IS trong pha động. Tiến hành sắc ký 6 lần liên tiếp, xác định độ lệch chuẩn tơng đối của các thông số: thời gian lu, tỷ số diện tích pic.
* Khoảng nồng độ tuyến tính, hàm đáp ứng
Chuẩn bị các mẫu HT trắng, thêm AZI và IS tạo thành các mẫu có nồng
độ AZI từ 0,02 - 2 àg/ml, xử lý mẫu theo sơ đồ hình 3.1 và tiến hành phân tích.
*LOD và LOQ
LOD là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể xác định đợc nhng không nhất thiết phải định lợng đợc trong điều kiện thí nghiệm cụ thể. LOD đ- ợc coi là nồng độ chất phân tích gây nên sự tăng tín hiệu đáp ứng 3 lần so với
đáp ứng tín hiệu của mẫu trắng (S/N=3). LOQ là nồng độ thấp nhất của chất cần phân tích có thể định lợng đợc với độ đúng và độ chính xác phù hợp. LOQ
đợc chấp nhận nếu đáp ứng của chất phân tích phải ít nhất gấp 10 lần đáp ứng của mẫu trắng. Trong phơng pháp sắc ký độ nhiễu của đờng nền có thể thay cho tín hiệu của mẫu trắng.
Tiến hành xử lý các mẫu HT trắng và mẫu chuẩn có nồng độ AZI thấp dần và tiến hành phân tích.
* Độ đúng
Chuẩn bị các mẫu AZI trong HT trắng ở 3 nồng độ khảo sát, mỗi nồng
độ làm 5 mẫu, xử lý mẫu và tiến hành phân tích, so sánh giá trị trung bình giữa các lần định lợng của mỗi nồng độ với giá trị thực có trong mẫu, tính theo lợng chuẩn đã cân và thể tích đã pha.
*Độ chính xác.
Chuẩn bị các mẫu AZI trong HT trắng ở 3 nồng độ, mỗi nồng độ làm 5 mẫu và xử lý nh trong phần xác định độ đúng, sau khi tiến hành sác ký,
đánh giá độ lệch chuẩn tơng đối của các mẫu theo từng nồng độ.
2.3.2.5. Xác định hiệu suất chiết
Chuẩn bị các mẫu AZI trong HT trắng ở 3 nồng độ khảo sát, mỗi nồng
độ làm 3 mẫu, song song tiến hành sắc ký các mẫu chuẩn pha trong pha động ở 3 nồng độ tơng ứng. Đánh giá hiệu suất chiết thông qua so sánh chỉ số diện tích pic trung bình trong HT so với trong pha động ở từng nồng độ tơng ứng.
2.3.3. Định lợng thăm dò AZI trong HT ngời uống AZI
Tiến hành lấy máu định lợng AZI trong HT 2 ngời tình nguyện sử dụng chế phẩm có chứa AZI ( uống 2 viên nén Athromax hàm lợng 250 mg). Mỗi ngời đợc lấy máu ở 2 thời điểm, sau uống thuốc 1 giờ và 1,75 giờ. Lấy máu tĩnh mạch cánh tay vào ống nghiệm có chứa EDTA, ly tâm lấy HT thêm chuẩn nội, xử lý mẫu và tiến hành phân tích.
2.3.4. Phân tích số liệu thực nghiệm
Tính toán các số liệu: giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, độ lệch chuẩn t-
ơng đối, phơng trình hồi quy và hệ số tơng quan hồi quy bằng chơng trình phần mềm Microsoft Excel.
0,5ml HT+ 0,1ml IS
Hỗn hợp chiết
HT đã kiềm hóa
+ Kiềm hóa bằng 0,4ml đệm Carbonat 0,05M + Lắc xoáy 30 giây
Dịch chiết
Cắn khô
Dung dịch trong
Dịch lọc