3.3.4.1. Đánh giá tính chọn lọc.
Chuẩn bị mẫu:
- HT trắng.
- HT trắng có thêm AZI.
- HT trắng có thêm ROXI.
- HT trắng có thêm AZI và ROXI.
Xử lý mẫu theo sơ đồ hình 3.1 và tiến hành phân tích theo điều kiện sắc ký đã xác định. Kết quả thu đợc trình bày ở hình 3.16.
Sắc ký đồ mẫu HT trắng
C hua n A zi 80 0pp b #1 19R T:3 ,14A V :1NL :3 ,1 7E 5 T:+ c E S I S IM m s [ 7 48 ,0 0-7 50 ,0 0 ]
7 4 8 ,0 7 4 8,2 74 8,4 7 4 8 ,6 7 48 ,8 7 49 ,0 7 49 ,2 7 49 ,4 74 9,6 74 9,8 m /z
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1 00
Relative Abundance
7 4 9 ,3 4
74 8,50
Sắc ký đồ v phổ khối mẫu HT có AZIà
836,0 836,2 836,4 836,6 836,8 837,0 837,2 837,4 837,6 837,8 m/z
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Relative Abundance
RT:0,00 - 8,46SM:7B
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Time (min) 0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Relative Abundance
RT: 5,97 NL:
2,37E6 TIC F: MS Avalon T1c
Sắc ký đồ và phổ khối mẫu HT có ROXI
RT: 0,00 - 8,50 SM: 7B
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Time (min) 0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Relative Abundance
RT: 3,13
RT: 6,01
NL:
2,37E6 TIC F: MS Genesis C4a
Sắc ký đồ mẫu HT có AZI và ROXI
Hình 3.16. Các sắc ký đồ đánh giá tính chọn lọc của phơng pháp.
Nhận xét: Trên sắc ký đồ mẫu trắng tại các vị trí tơng ứng với thời gian lu của AZI và ROXI không xuất hiện pic lạ, các pic AZI và ROXI cân đối, sắc nét, tách riêng biệt. Phổ khối của pic tại thời điểm 3,12 phút có m/z=749,3 và tại thời điểm 6 phút có m/z=837,08 trùng với giá trị m/z của chất chuẩn AZI và ROXI khi tiến hành các điều kiện chạy MS. Từ các kết quả trên, chúng ta thấy phơng pháp có tính chọn lọc tốt.
3.3.4.2. Đánh giá tính phù hợp của hệ thống.
Chuẩn bị mẫu chuẩn có AZI nồng độ 1àg/ml và ROXI nồng độ 2àg/ml trong pha động, phân tích theo điều kiện LC-MS đã xác định. Tiến hành phân
tích 6 lần liên tiếp, kết quả các thông số: thời gian lu, diện tích pic, tỷ số diện tích pic đợc trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống LC-MS
Lần tiêm
Thời gian lu AZI (phút)
Diện tích pic AZI (relative Abundance*s)
Thời gian lu ROXI (phút)
Diện tích pic ROXI (relative Abundance*s)
Tỷ số diện tích AZI/ROXI
1 3,24 83975382 5,97 55977799 1,50
2 3,25 97146667 5,97 60627152 1,60
3 3,26 106438830 5,95 63970613 1,66
4 3,27 108898880 5,94 67171078 1,62
5 3,25 100948268 5,93 65374934 1,54
6 3,24 108645034 5,93 69106856 1,57
TB 3,25 5,95 1,58
SD 0,01 0,02 0,06
RSD
(%) 0,36 0,31 3,67
Nhận xét: độ lệch chuẩn tơng đối của các thông số phân tích đều nhỏ hơn 4%, điều này chứng tỏ hệ thống sắc ký có tính thích hợp chấp nhận đợc, có thể ứng dụng phân tích mẫu để cho kết quả tin cậy.
3.3.4.3. Xác định khoảng nồng độ tuyến tính.
Chuẩn bị các mẫu HT trắng, thêm AZI và ROXI tạo thành các mẫu có nồng độ AZI lần lợt là 0,02àg/ml; 0,05àg/ml; 0,15àg/ml; 0,5àg/ml; 1,5àg/ml và 2àg/ml, nồng độ ROXI cố định 2àg/ml. Xử lý mẫu theo quy trình đã xây dựng nh trong sơ đồ hình 3.1 và tiến hành phân tích theo điều kiện sắc ký đã
xác định. Kết quả thu đợc trình bày trong bảng 3.5
Bảng 3.5. Sự phụ thuộc giữa tỷ số diện tích pic và nồng độ AZI trong HT
Mẫu 1 2 3 4 5 6 7
Nồng độ (àg/ml) 0,02 0,05 0,15 0,50 1,00 1,50 2,00
Tỷ số diện tích
(AZI/ROXI) 0,0367 0,0742 0,2387 0,5807 1,0956 1,6322 2,3405
Phơng trình hồi quy: Y= 1,1237 X + 0,019 Hệ số tơng quan: R2= 0,9966
Trong đó: X là nồng độ của AZI trong HT (àg/ml)
Y là tỷ số giữa diện tích pic của AZI và diện tích pic của ROXI
y = 1,1237x + 0,019 R2 = 0,9966
0 0,5 1 1,5 2 2,5
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Nồng độ m g/l
Tỷ số diờn tớch pic
Hình 3.17. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa tỷ số diện tích pic(AZI/ROXI) và nồng độ AZI trong HT
Nhận xét: từ các kết quả trong bảng 3.5. và hình 3.17 cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính giữa tỷ số diện tích pic (AZI/ROXI) và nồng độ AZI trong HT. Đờng chuẩn hồi quy có dạng thẳng và hệ số tơng quan lớn hơn 0,99
R T :0 ,0 0 - 8 ,4 9S M :7 B
0 1 2 3 4 5 6 7 8
T i m e (m i n ) 0
1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0
Relative Abundance
R T : 5 ,9 7 S N: 2 7 0
R T : 3 ,1 3 S N: 1 5
N L : 1 ,6 4 E 6 T IC F : M S C 7 a _ 0 8 1 2 1 6 0 9 0 4 0 4
chứng tỏ có sự tơng quan tuyến tính chặt giữa tỷ số diện tích pic (AZI/ROXI) và nồng độ AZI trong HT ở khoảng nồng độ khảo sát.
3.3.4.4. Xác định LOD và LOQ
Tiến hành chiết, phân tích mẫu HT có nồng độ 0,05àg/ml AZI, phân tích cho đáp ứng có tỷ số S/N=75. Phân tích với mẫu có nồng độ 0,02àg/ml AZI cho đáp ứng với tỷ số S/N=15, chỉ số gần với 10 nên xác định LOQ khoảng 0,02àg/ml và LOD vào khoảng 0,006 àg/ml.
(A) (B)
Hình 3.18. Sắc ký đồ mẫu HT xác định LOQ
(A) có nồng độ AZI 0,05 àg/ml; (B) có nồng độ AZI 0,02àg/ml 3.3.4.5. Độ đúng
Chuẩn bị các mẫu AZI có ROXI trong HT trắng ở 3 nồng độ 0,05àg/ml; 0,5àg/ml và 1,5àg/ml; mỗi nồng độ làm 5 mẫu, xử lý mẫu theo sơ
đồ hình 3.1 và tiến hành phân tích theo điều kiện sắc ký đã xác lập, rồi so sánh
R T :0 ,0 0 - 8 ,4 9S M :7 B
0 1 2 3 4 5 6 7 8
T i m e ( m i n ) 0
1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0
Relative Abundance
R T : 6 ,0 0 S N: 1 8 3
R T : 3 ,1 4 S N: 7 5
N L : 1 ,9 2 E 6 T IC F : M S G e n e s i s C 6 e
giá trị trung bình giữa các lần định l- ợng của mỗi nồng độ với giá trị thực có trong mẫu. Kết quả đánh giá độ đúng đợc trình bày ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả xác định độ đúng của phơng pháp phân tích
Mẫu
STT
0,05àg/ml 0,50àg/ml 1,50àg/ml
Nồng độ
đo đợc (àg/ml)
Độ
đúng (%)
Nồng độ
đo đợc (àg/ml)
Độ đúng (%)
Nồng độ
đo đợc (àg/ml)
Độ đúng (%)
1 0,0502 100,48 0,5555 111,10 1,4357 95,71
2 0,0491 98,23 0,4999 99,98 1,5088 100,58
3 0,0477 95,46 0,4956 99,12 1,3059 87,06
4 0,0486 97,17 0,5693 113,87 1,3899 92,66
5 0,0515 103,09 0,4868 97,37 1,4131 94,21
TB 0,0494 98,89 0,5214 104,29 1,4107 94,05
Nhận xét: kết quả khảo sát cho thấy phơng pháp định lợng có độ đúng biến thiên từ 94,05% - 104,29%, chứng tỏ phơng pháp có độ đúng cao.
3.3.4.6. Độ chính xác
Tiến hành tơng tự nh phần xác định độ đúng nhng kết quả dựa trên đánh giá độ lệch chuẩn tơng đối của tỷ số diện tích pic các mẫu ở từng nồng độ. Kết quả xác định độ lặp lại trong ngày đợc trình bày trong bảng 3.7.
Bảng 3.7. Kết quả xác định độ lặp lại trong ngày của phép phân tích
STT Tỷ số diện tích píc ở các nồng độ
0,05àg/ml 0,50àg/ml 1,50àg/ml
1 0,0755 0,5555 1,6322
2 0,0742 0,4999 1,7144
3 0,0726 0,4956 1,4864
4 0,0736 0,5693 1,5809
5 0,0769 0,4868 1,6070
TB 0,0746 0,5214 1,6042
SD 0,0017 0,0380 0,0827
RSD (%) 2,24 7,29 5,16
Nhận xét: kết quả từ bảng 3.7 cho thấy phơng pháp có độ lặp lại trong ngày đạt yêu cầu (RSD tại 3 nồng độ đều <15%). Trong phân tích dịch sinh học, với giá trị RSD dao động từ 2,24% - 7,29% thì phơng pháp này đợc coi là có độ chính xác trung bình (5 - 10%), [19].