BÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG

BÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANGBÀI 2 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP

TS Dương Hồng Quân Trung tâm Xét nghiệm, Trường Đại học Y tế cơng cộng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP

Chuẩn đầu ra bài học

Sau khi học xong, sinh viên cĩ khả năng :

1 Diễn giải tầm quan trọng và ý nghĩa của kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trong xét nghiệm mơ bệnh học

2 Phân tích ưu/nhược điểm của các phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang

3 Liệt kê các vấn đề cần lưu ý khi thực hiện kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang và cách khắc phục

4 Thực hiện thao tác kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP

Cố định bệnh phẩm

Chuyển mơ

Lấy mẫu

bệnh phẩm,

cắt lọc

Vùi bệnh phẩm

Phân tích/trả kết quả, lưu

trữ Cắt, dán

mảnh Nhuộm

Analysis based on Ag-Ab interaction

◼ Western blotting / immunoblotting

◼ ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)

◼ Immunohistokimia / immunositokimia

counting )

Ag-Ab recognition

fluorophore

METHODS WB ELISA IHC/ICC IF / Flowcyto

STEPS complex; long cycle simple; short cycle complex; long cycle simple; short

cycle

SENSITIVITY high; specificity simple but with high

false-positive

lower than that of WB

higher than that of IHC > WB

CROSS RX yes and easy to

distinguish yes

yes and hard to distinguish yes

DATA qualitative quanitative positioning Positioning /

Number of target cells

SAMPLE

MW Separated- proteins/

Membrane

Homogenate / enzyme panel

Sectiioning tissue / glass slide

glass slide / cell suspension / tissue

sectioning

DYE RESULTS

Chemical light, chromogen

ic product

chromogenic product , fluorecescent Cromogenic Fluorescent

OBSERAVTION

TOOLS

imaging Elisa reader Bright Field microscopy

fluorescence microscopy /

flowcytometer

WB

IHC/ICC

ELISA IF

Flowcytometry

WB only

Immunofluorescent Staining

Immunofluorescent staining makes use of antibodies to locate and identify patterns of protein expression in cells.

Primary antibody binds to antigen.

Antibody-antigen complex is bound by a secondary antibody

conjugated to a fluorochrome.

Upon absorption of high energy light, the fluorochrome emits light at its own characteristic wavelength (fluorescence) and thus allows

detection of antigen-antibody complexes.

Suitable for: 1 frozen, non-fixed tissues and ethanol fixed tissues

2 paraformaldehyde-fixed or methanol/acetone-fixed cells

Basic Staining Technique

1 Incubate fixed cells in 1% Triton X-100 in PBS+0.02%BSA for 2 minutes at room temperature.

2 Wash the cells 3 times with PBS.

Immunofluorescent Cell Staining

1 Incubate cells with a blocking solution to minimize non-specific staining

2 Incubate cells with a polyconal or monoclonal antibody specific for the protein of interest.

3 Incubate cells with a secondary antibody directed against the primary antibody

The secondary antibody must be conjugated to a fluorochrome

ANTIGEN PRIMARY

ANTIBODY

SECONDARY ANTIBODY

FLUOROCHROME

HOW IS ANTIBODY RAISING

Rabbit anti-X = rabbit IgG

Donkey anti-rabbit IgG

◼ Fewer colors may be available),

more expensive

◼ Potential for cross-reactivity

◼ Secondary antibody may react with

endogenous immunoglobulin

in tissue samples

Giannakakou et al., Nature Cell Biology,2000

FITC conjugated anti-mouse

Direct Staining of Cell Structures

Organelle Probes

Mitochondria MitoTracker mitochondrial membrane potential

Lysosomes LysoTracker hydrolytic activity of enzymes

ER and Golgi Lectin conjugates lipid composition

Other Probes

Stress fibers Phalloidin-conjugaes bind F-actin

Nuclei DAPI binds to minor groove of ds-DNA

MitoTracker-Orange CMTMRos 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)

4

TRAP1 Mouse Monoclonal

+ Goat anti-Mouse-FITC

Felts et al., JBC, 2000

DAPI

Anti-vinculin MoAbGoat anti-mouse-FITCRhodamine-Phalloidin

Stress Fibers Focal Adhesions

Translocation of mutated protein to the mitochondria

deep red-mitotracker GFP-fusion protein MERGE

Use of Biotinylated Antibodies

Streptavidin is a bacterial protein that specifically binds biotin This interaction may be used to label

cellular components.

ANTIGEN PRIMARY

ANTIBODY

SECONDARY ANTIBODY FLUOROCHROME

STREPTAVIDIN BIOTIN

Guinea Pig anti-Insulin PoAb

Donkey anti-Guinea Pig-Cy5

Rabbit anti-Factor H Biotinylated Goat anti-Rabbit Streptavidin-FITC

Mouse anti-Glucagon MoAb

Goat anti-Mouse-Rhodamine Martinez et al., J Endocrinol., 2001

Conventional Fluorescent

Microscopy

Confocal Microscopy Core

Inverted Scope Upright Scope

Preparation of Stained Specimens

For Microscopy

Specimen Mounting

In order for the stained specimen to be visualized on a fluorescent

microscope, it needs to be mounted onto a slide using an appropriate mounting medium.

Mounting medium is usually a PBS/Glycerol mix and is commercially available.

•Biomeda Corporation Aqueous Mounting Medium

•Molecular Probes SlowFade

Specimen Photobleaching

❖ One of the major problems in microscopic examination of

fluorescent specimens is the tendency of fluorochromes to lose fluorescence upon excitation by a high energy light source.

❖ Free radicals generated during fluorochrome excitation are

responsible for this quenching or photobleaching.

❖ Various chemical agents that scavenge free radicals may be

added to the mounting medium to preserve specimen brightness.

Sigma trans-pyridine-2-azo-p-dimethylaniline (PADA)

Molecules absorbing the energy of electromagnetic radiation

will jump to a higher energy level When certain excited molecules return to the ground state they emit radiation This phenomenon

is known as fluorescence Fluorescent molecules are known as

fluorochromes or fluorophores

Absorption Spectra of Fluors Commonly Conjugated to Secondary Antibodies

Fluorescence Microscopy

Since the molecules used for immunofluorescence emit light in the visible range, it is possible to detect them with a microscope.

❖ A mercury lamp is used to illuminate the sample with UV light through the

objective lens A dichroic mirror reflects short l and transmits longer l.

❖ The fluorescence emitted from the sample passes back through

this mirror, but the UV light does not.

❖ An excitation filter in front of the mirror will control the excitation wavelength.

❖ An emission filter in front of the eyepiece will control the wavelength

of the emitted light.

filter

Numerical Aperature (NA)

A solid cone of light that hits the specimen

Lenses with a high NA have a short working distance but, allow more light to be captured from the specimen.

Example:

Phase contrast lens low NA long working distance

High resolution 100x high NA short working distance

Confocal Microscopy

CCBB Confocal Core Facility (1999-2006)

Zeiss LSM510 with 4 color capability

Building 37 Room 1035

UV 351,364nM Argon 488nM HeNe I 543nM HeNe 2 633nM

What is Confocal Microscopy?

Laser Scanning Confocal Microscopy Confocal Scanning Laser Microscopy

Confocal microscopy is a powerful tool for generating high-resolution images

and 3-D reconstructions of a specimen.

In confocal microscopy a laser light beam is focused onto a fluorescent specimen through the objective lens The mixture of reflected and emitted light is captured

by the same objective and is sent to the dichroic mirror The reflected light is

deviated by the mirror while the emitted fluorescent light passes through a

confocal aperature (pinhole) to reduce the “out of focus” light The focused light then passes through the emission filter and proceeds to the photomultiplier.

In order to generate an entire image, the single point is scanned in an X-Y manner

as the laser focus is moved over the specimen

Simplified Optics of a Confocal Microscope

Why is Confocal Microscopy Better?

1 More Color Possibilities

Because the images are detected

by a computer rather than by eye,

it is possible to detect more color

differences

Insulin-Cy5 CRLR-FITC

Glucagon-Rhodamine Overlay

Why is Confocal Microscopy Better?

2 Less Cross Talk

In most applications, fluorochromes have overlapping emission spectra Hence, the emission signals cannot be separated completely into different detection channels resulting in “bleed through” or cross talk.

However, if the fluorochromes have distinct excitation spectra, the fluorochromes can be excited sequentially using one excitation wavelength at a time This is only possible with confocal systems that offer the multitracking feature.

Standard

Microscopy

Brain Slice nerve fibers (FITC)

cell nuclei (propidium iodide)

Courtesy Dr Schild, University of Gottingen

Why is Confocal Microscopy Better?

3 Optical Sectioning of Objects Without Physical Contact

Zebra fish embryo wholemount Neurons (green)

Cell adhesion molecule (red)

Monika Marks, Martin Bastmeyer University of Konstanz

Cultured Cells

Formation of Acini in a 3-D Matrigel Matrix

Three-dimensional culture

of MCF10A mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane leads to the formation of polarized, growth arrested acini-like spheroids that recapitulate several aspects of glandular architecture in vivo

Introduction of oncogenes into MCF10A cells results in

distinct morphological phenotypes

Why is Confocal Microscopy Better?

4 Three-Dimensional Reconstruction of Specimen

3D shadow projection Tight junctions (red) Cytoskeletal structures (green)

Prof Wunderli-Allenpach ETH, Zurich

Animated 3-Dimensional Reconstruction

Laser Scanning Microscopy

LSM510

3D for LSM

www.Zeiss.com

Animated 3-Dimensional Reconstruction

Mitosis

www.Zeiss.com

Why is Confocal Microscopy Better?

5 Improved Resolution

Rat Cerebellum Astrocytes (green)

Mn dismutase (red)

Jorg Lindeman University of Magdeburg

1 Colocalization

2 Live Cell Imaging

FRAP/FLIP GFP-Fusion

3 FRET

Colocalization of insulin and calcitonin receptor-like receptor

Insulin-Cy5 CRLR-FITC

Glucagon-Rhodamine

p53 a-tubulin

Proteins may colocalize but not necessarily interact

Confocal Microscopy is a powerful tool for studying signaling mechanisms

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP

Tĩm lược các ý chính

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP

Câu 1: Phản ứng miễn dịch huỳnh quang

A Là kỹ thuật miễn dịch trong đĩ kháng thể được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang

B Cĩ 2 loại chính bao gồm kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp và kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp

C Đọc kết quả bằng cách soi dưới kính hiển vi huỳnh quang

D A, B và C đều đúng

Câu hỏi lượng giá

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP

Câu 2: Kỹ thuật nào sao đây cĩ ý nghĩa trong chẩn đốn phân biệt u lành-u ác

A Miễn dịch huỳnh quang

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP

Xin chân thành cảm ơn!

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP

Tài liệu phải học

2 Bộ Y Tế Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành giải phẫu bệnh, tế bào học (5199/QĐ-BYT ngày 25/12/2013) NXB

Y học, 2016 ( Trang 349-352 )