Phương Pháp Điện Di

Giới thiệu chung về phương pháp điện di

L/O/G/O

ĐIỆN DI

1 Khái niệm

•  Kỹ thuật tách những hợp chất của một hỗn hợp nhờ điện trường

– VD: tách hỗn hợp các amino acid, nucleic acid, protein

2 Nguyên tắc

•  Các protein có mang điện tích khi nó ở

môi trường có pH khác với pI

•  Các ion mang điện tích ngược dấu nhau sẽ

di chuyển theo 2 hướng ngược chiều nhau

•  Các ion mang điện tích cùng dấu di chuyển

3 Căn bản vật lý của điện di

•  Vận tốc di chuyển của 1 phân tử có điện tích được mô tả theo phương trình

Trong đó: v: vận tốc di chuyển của phân tử

v = E ! q f

•  Điện trường được thiết lập bằng cách áp một

điện thế V vào 2 điện cực, đặt cách nhau 1

khoảng cách d

•  Lực điện trường sẽ là

E = V/d

3 Căn bản vật lý của điện di (tt)

•  Điện tích toàn phần:

– Tổng số điện tích âm và điện tích dương trong phân tử

•  Hệ số ma sát (f) phụ thuộc:

– Khối lượng phân tử – Mức độ chặt chẽ trong cấu trúc phân tử – Độ nhớt của dung dịch đệm

– Độ rỗng của hệ mạng môi trường điện di

3 Căn bản vật lý của điện di (tt)

•  Phân tử càng có nhiều điện tích và kích

thước càng nhỏ thì di chuyển càng nhanh

về điện cực ngược dấu

•  Các phân tử có cùng điện tích nhưng hình

dạng khác nhau sẽ di chuyển với vận tốc

khác nhau

3 Căn bản vật lý của điện di (tt)

4 MÔI TRƯỜNG CHẤT MANG

SỬ DỤNG TRONG ĐIỆN DI

Môi trường chất mang

•  Nguyên liệu dùng làm chất mang trong điện di:

giấy lọc, acetate cellulose, agarose,

polyacrylamide, lớp mỏng silica, alumina,…

•  Phân loại dựa vào sự khác nhau của môi trường

điện di:

– Điện di trên giấy (paper electrophoresis)

– Điện di trên bản gel (gel electrophoresis)

– Điện di trên ống vi quản (capillary tube

electrophoresis)

Giấy Chứa ít nhóm có mang điện tích

Luôn có sẵn

Dễ cầm, thao tác (không cần xử lý)

Độ nhạy thấp Tính lặp lại thấp Không kiểm soát được kích thước các lỗ rỗng

Poly-acrylamide Thường được sử dụng Áp dụng cho protein và acid

nucleic

Độc hại cho thần kinh Gel có khoảng đời sống ngắn

Không gấp xếp bản gel được

Agarose Không cần thêm phụ gia

Không đắt tiền Dùng cho DNA, RNA Mao quản Có thể tái sử dụng Khả năng

tách chất cao Phân tích nhanh Tốn lượng mẫu ít

Dễ áp dụng hệ thống tự động

Cần đầu dò nhạy cảm Dụng cụ đắt tiền Muốn tái sử dụng phải mất thời gian

4.1 Điện di trên giấy

•  Phân tách các phân tử có MW nhỏ

– VD: amino acid, protein có kích thước nhỏ

•  Giấy lọc cắt thành những dãy băng có

chiều rộng 3 – 5 cm

4.1 Điện di trên giấy

4.1 Điện di trên giấy (tt)

•  Ưu điểm: rẻ, kinh tế, tiện dụng

•  Nhược điểm:

– Kết quả không chính xác – Tốn thời gian

– Khó áp dụng cho một số loại phân tử như protein hoặc những đại phân tử có tính thân dầu (hydrophilic) vì giấy sẽ hấp thu à các dãy band bị kéo thành vệt dài

4.2 Acetate cellulose

•  Có tính hấp thu ít hơn giấy

4.2 Acetate cellulose

•  Khi áp dụng cho các loại phân tử như protein hoặc những đại phân tử có tính thân dầu (hydrophilic) cho kết quả là các dãy band sắc nét, không có hiện tượng bị kéo dài thành vệt

•  Đắt tiền nhưng vẫn được sử dụng rộng rãi trong các PTN y khoa trong việc phân tích những mẫu protein (định lượng protein huyết thanh)

4.3 Mao quản (capillary)

•  Vi quản: silica nóng chảy, có tính mềm dẻo

nhờ được bọc polyimide

4.3 Mao quản (capillary) (tt)

•  Diện tích mặt cắt ngang nhỏ è tiêu thụ năng lượng tối thiểu, khả năng tách chất nhanh (chỉ trong vài phút)

•  Hệ thống tự động hóa, ghi nhận kết quả bằng máy ghi (sắc ký đồ) → không phải nhuộm màu bản gel

4.3 Mao quản (capillary) (tt)

•  Đắt tiền → không loại bỏ cột, phải rửa kỹ,

loại bỏ hoàn toàn các mẫu lần trước, để tái

sử dụng

•  5 – 50nl (≈ 1% điện di cổ điển)

•  Cần đầu dò cực nhạy để phát hiện tín hiệu

4.3 Mao quản (capillary) (tt)

•  Phân tích hệ gen, sàng lọc các bệnh

•  Phát hiện tác nhân gây bệnh, định chủng

•  Phát hiện cây trồng chuyển gen (GMO), các sản phẩm trong nông nghiệp

• 

4.4 Gel agarose

•  Polymer (polysaccharide) trích từ loại rong đỏ

•  Không mang điện tích

•  Có kích thước lỗ lớn hơn so với gel

acrylamide

•  Ưu điểm: không cần thêm chất phụ gia và chất

tạo mạng ngang để polymer hóa, không độc

hại, rẻ tiền

•  Dùng tách các phân tử lớn (DNA)

4.5 Gel polyacrylamide

– S2O82- → 2SO42- – Bền cơ học, trơ hóa học

– Có thể thay đổi

độ rỗng → tách những phân tử có cùng điện tích nhưng kích thước

và hình dạng khác nhau

c

4.5 Gel polyacrylamide (tt)

•  Có thể điều chế gel ở một nồng độ nhất định hoặc có nồng độ tăng dần tuyến tính (xác định trọng lượng phân tử, điểm đẳng điện)

•  Nồng độ của acrylamide sẽ tạo gel có lỗ rỗng kích cỡ khác nhau

– <2.5%: tách protein có trọng lượng phân tử ~ 1.000 KDa

– >30%: tách protein có trọng lượng phân tử ~

2 KDa

•  Điện di trong điều kiện biến tính (SDS-PAGE)

•  Điện di trong điều kiện tự nhiên

5 MỘT SỐ KỸ THUẬT ĐIỆN DI

TRÊN GEL POLYACRYLAMIDE

Phân tích các protein kém hòa tan

Điện di với gel polyacrylamide có chứa SDS (sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS – PAGE)

5.1 Điện Di Trong Điều Kiện Bị Biến Tính

5.1 (tt)

•  SDS

– hợp chất có dây alkyl dài 12C, có tính kỵ

nước và 1 đầu mang nhóm sulfat phân cực

– chất hoạt động bề mặt có khả năng hòa tan

rất hiệu quả hầu hết các loại protein

•  Protein được SDS bao bọc đều ở bên ngoài,

thành 1 lớp che phủ đồng nhất, tích điện âm

•  SDS loại bỏ sự khác biệt về điện tích giữa các

đại phân tử trong dung dịch

•  Các phức “protein-SDS” có điện tích toàn phần

giống nhau

→ tách các đại phân tử dựa vào kích

thước phân tử

Mối liên quan giữa T% của gel

và trọng lượng phân tử của hợp

chất điện di T% Trọng lượng phân tử của hợp chất điện di

5.1 (tt)

•  Ưu điểm

– Kỹ thuật đơn giản

– Kết quả có tính lặp lại cao

– Khả năng tách chất rất tốt: tách các protein

có độ dịch chuyển chênh lệch nhau 1% =

phân biệt được sự khác nhau 1KDa giữa

những protein có trọng lượng phân tử

khoảng 100KDa

5.1 (tt)

•  Nhược điểm

– Khó tách các polypeptide <10KDa

– Khó phân biệt các protein có cùng kích

thước hoặc kích thước gần giống nhau

– Protein không giữ được hoạt tính sinh học

– …

5.2 Điện di trong điều kiện tự nhiên

•  Điện di với hệ thống bất liên tục – Áp dụng với các mẫu protein hòa tan và không bị kết tủa trong quá trình điện di – Môi trường điện di có pH bất liên tục, gồm

2 lớp gel khác nhau có pH ban đầu hoàn toàn khác nhau, được đặt liền kề nhau

5.1 (tt)

•  Điện di với hệ thống bất liên tục (tt)

•  Stacking gel (gel chồng đống mẫu, gel chuẩn bị)

– lớp gel phía trên, có chiều cao ~ 1/5 tổng

chiều cao bản gel

– Nồng độ polyacrylamide loãng (3 – 5%), pH

trung tính (6.9)

– Gel có lỗ rỗng to, lực ion yếu

6 Điện di hội tụ (Isoelectric focusing, IEF)

•  Điểm đẳng điện (isoelectric point, pI): giá trị pH mà protein không còn điện tích

Giá trị điểm đẳng điện của một số

protein

•  Muốn xác định pI, cần phải thiết lập 1 gel với gradient pH ổn định

– Sử dụng chất điện ly lưỡng tính: hợp chất tổng hợp, sản phẩm của sự polymer hóa các loại acid oligoamino (-NH2) oligocarboxylic (-COOH) có MW nhỏ

– Trộn các hợp chất điện ly khác nhau (không

có sự hiện diện của điện trường): hỗn hợp chỉ

có 1 pH duy nhất – Khi có dòng điện, từng chất riêng lẻ di chuyển đến vị trí pI của nó à chúng hoạt động như dung dịch đệm và có pH gradient

Điện di hội tụ có pH tuyến tính

nhờ các chất bất động

•  Sử dụng những hợp chất là dẫn xuất của

acrylamide (CH2=CH-CONH2, chất bất

động), trong cấu trúc có chứa các nhóm

acid yếu (CH2=CH-CONH-COOH, acid

carboxylic), hoặc base yếu (CH2

=CH-CONH-NH2, amin tam cấp)

6 (tt)

•  Ưu điểm:

– Loại gel này tương thích được với urea và các chất tạo nhũ

– Không bị ảnh hưởng bởi các muối chứa trong mẫu protein

6 (tt)

Ứng dụng của IEF để đo pI

•  Khi một protein được đặt vào bản gel

gradient pH, protein này di chuyển về vị trí

pI của nó

•  Nếu protein ở trong môi trường có pH cao

hơn giá trị pI của nó, protein có điện tích

toàn phần là điện tích âm, và di chuyển về

phía anod và ngược lại

•  Chỉ ở môi trường pH = pI, protein có điện

tích toàn phần = 0 (zero net charge) và

không di chuyển trong điện trường

7 Điện di SDS-PAGE 2 D

7.1 Nguyên tắc – Protein được tách theo chiều thứ nhất bằng điện di đo điểm đẳng điện (dựa vào sự khác biệt về giá trị điểm đẳng điện) và chiều thứ 2 bằng SDS-PAGE (dựa vào sự khác biệt về MW)

•  Điện di đo điểm đẳng điện (IMF): gel có dạng

hình cái que

–  Mẫu phân tích được đặt lên 1 đầu que, mỗi que chứa 1

mẫu, điện di nhiều que 1 lúc

•  Điện di SDS-PAGE:

–  Các que gel được thụt tuột ra khỏi ống chứa, rồi đặt

lên trên 1 tấm agarose ấm

–  Khi agarose nguội, que gel đã gắn dính vào tấm

agarose

7.2 CÁC THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG SDS – PAGE 2 CHIỀU

•  Thực hiện IEF trên tấm gel đặt trong hình ống trụ làm bằng thủy tinh, đường kính ống 5mm, chiều dài 14cm

•  Sau khi thực hiện IEF xong, que gel được thụt tuột ra khỏi ống chứa, rồi được đặt trên một agarose ấm và khi nguội lại, que gel đã gắn dính vào tấm agarose Tấm agarose này được đặt nằm ngang, ở phần lớp gel chuẩn bị của một tấm gel SDS-PAGE

8 Hiện hình bản gel

•  sau khi điện di, bản gel cần được làm cố định,

nghĩa là làm cho các protein kết tủa, cố định trên

bản gel và đồng thời loại bỏ những thành phần

không phải là protein vì các thành phần này có thể

gây trở ngại cho quá trình hiện hình bản gel

•  Phương pháp cố định tốt nhất: ngâm bản gel trong

dung dịch 10 – 20% w/v acid trichloroacetic hoặc

hỗn hợp acid trichloroacetic và acid

sulphosalicylic (10% w/v cho mỗi chất), ngâm ở

nhiệt độ phòng trong khoảng 2 giờ

8 Hiện hình bản gel (tt)

Thuốc nhuộm Loại chất phát hiện phát hiện Giới hạn

Ponceau red (thuốc nhuộm thuận

Bis-1-anilino-8-napthalen

8.1 Nhuộm màu bản gel bằng

Coomassie Brilliant Blue

•  Protein hiện hình màu xanh dương

•  Ưu điểm:

– Phẩm màu không xuyên qua hệ thống mạng

gel nên quá trình tẩy bản gel xảy ra nhanh

chóng

– Thao tác đơn giản

•  Nhược điểm

– Phẩm màu kém nhạy, chỉ phát hiện khoảng

0.5µg protein/cm 2 gel

8.2 Nhuộm màu bằng dung dịch

bạc nitrat

kim loại bạc tại các vùng có sự hiện diện của protein hoặc DNA tạo thành vùng màu đen

•  Ưu điểm:

– Độ nhạy cao gấp 20 – 200 lần so với CBB

các protein ở lượng vết

•  Nhược điểm – Các protein như Ig dây ngắn cho hiện màu rất kém

– Đắt tiền, tốn nhiều thời gian

9 Western blotting

•  Kỹ thuật điện thấm (electroblotting): áp dụng điện trường vuông góc với bản gel

•  Protein >15kDa: màng nitrocellulose với đường kính lỗ rỗng 0.45 µm

•  Protein <15kDa: màng nitrocellulose với

9 Western blotting (tt)

•  Lai protein (antigen) với kháng thể (antibody

- Ab) đặc hiệu

•  Nghiên cứu protein và enzyme

9.1 Kháng nguyên và kháng thể

•  Kháng nguyên: các chất miễn dịch – Hợp chất có trọng lượng phân tử nhỏ (các phân tử đường)

– Hợp chất polymer sinh học có cấu trúc phức tạp (protein)

•  Kháng thể: protein nhận biết kháng nguyên

9.1 (tt)

•  1 protein và 1 kháng thể gặp nhau

– Tương tác đặc trưng xảy ra giữa vùng biến đổi

(variable region) của kháng thể và epitope

(vùng đặc biệt ở trên kháng nguyên) của

kháng nguyên

•  Các epitope khác nhau trong những cấu trúc

protein có thể nhận diện bởi các Ab đặc trưng

– PAb: nhận diện nhiều epitope trong cùng 1 Ag

– MAb: nhận ra 1 epitope

9.1 (tt)

•  Với kháng thể đa dòng (polyclonal antibody): một số epitope hiện diện trên bề mặt của 1 antigen

•  Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody, Mab): 1 epitope hiện diện trên 1 antigen

9.1 (tt)

•  Sử dụng lượng thừa Ag hoặc Ab, sau khi

nhuộm màu phức tạo thành giữa Ag-Ab à

đo nồng độ của Ag hoặc Ab

9.2 Nguyên tắc

•  Tách chiết protein

•  điện di

•  Chuyển lên màng lai

•  Rửa màng lai với “dung dịch khóa” (dung dịch protein, blocking solution): khóa vị trí không đặc trưng trên kháng thể

•  Lai protein trên màng với các protein kháng thể đặc hiệu (VD: IgG thỏ: gắn vào epitope của protein)

9.2 (tt)

•  Kháng thể này sẽ được phát hiện nhờ kháng thể

thứ 2, có ái lực đặc trưng với kháng thể thứ nhất

(VD: IgG kháng thỏ)

•  Làm hiện màu protein:

– Hiện hình phát huỳnh quang: cho tác dụng với

fluorescein isothicyanat

• 

Bài giảng SHPT & KT Gene _