CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU VỀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC 1.1 Khái niệm Công nghệ Sinh học (CNSH) Công nghệ Sinh học (Biotechnology) thuật ngữ xuất cách khoảng 25 năm sau có có thành tựu công nghệ gen (kỹ thuật tái tổ hợp DNA) Có nhiều định nghĩa khác CNSH, nhiên định nghĩa theo Liên đồn Cơng nghệ Châu âu nhiều người chấp nhận nhất: Công nghệ sinh học q trình sản xuất qui mơ cơng nghiệp có tham gia tác nhân sinh học (ở mức độ thể, tế bào tế bào) dựa thành tựu tổng hợp nhiều môn khoa học, phục vụ cho việc tăng cải vật chất xã hội bảo vệ lợi ích người Như CNSH khơng phải mơn khoa học hố, lý, sinh học, hay sinh học phân tử, … mà phạm trù sản xuất (công nghệ) Tác nhân sinh học mức độ thể động vật, thực vật, mức độ tế bào tế bào vi sinh vật mức độ tế bào gen, enzyme Cơng nghệ sinh học có tính chất liên ngành, ứng dụng thành tựu nhiều ngành khoa học vào sản xuất di truyền học, hoá sinh học, sinh lý học, vi sinh vật học, hoá học, tin học, khí, … Từ định nghĩa cho thấy cơng nghệ gen khơng phải CNSH mà thành phần chủ chốt, sở, động lực để thúc đẩy phát triển nhanh chóng cơng nghệ sinh học 1.2 Phân loại cơng nghệ sinh học Tuỳ theo cách nhìn khác mà công nghệ sinh học phân loại theo kiểu khác Xét tác nhân sinh học tham gia vào q trình CNSH chia thành nhóm sau: - CNSH động vật (Animal Biotechnology) - CNSH thực vật ( Plant Biotechnology) - CNSH vi sinh vật (Microbial Biotechnology) - CNSH enzyme hay CN enzyme (Enzyme Biotechnology) Ngồi cịn có khái niệm khác CN protein (Protein Engineering), CN gen (Gene Engineering) CN gen CN protein luôn xuyên suốt công nghệ chìa khố nằm CN thực vật, CN động vật CN vi sinh vật Dựa đối tượng phục vụ người ta chia CNSH thành: - CNSH nông nghiệp - CNSH y tế - CNSH môi trường - CNSH lượng - CNSH vật liệu - CNSH chế biến thực phẩm - CNSH hoá học… Cách 8000 năm người biết sử dụng vi sinh vật sản xuất bia, phomat, yoghurt, dấm Do số tác giả lại cho CNSH người sử dụng từ lâu Vì CNSH chia thành hai nhóm: - CNSH cổ điển (Ancient Biotechnology) - CNSH đại (Mordern Biotechnology) Trong giảng trình bày theo cách phân loại CNSH theo đối tượng phục vụ 1.3 Lịch sử phát triển CNSH Điểm lại lịch sử cho thấy tổ tiên biết sử dụng qui trình CNSH thực tiễn sống làm bánh mì, nấu rượu bia, làm phomat Tuy nhiên họ không hiểu chất q trình cơng nghệ mà hành động theo kinh nghiệm cảm tính Đến cuối kỷ 19, Pasteure vi sinh vật đóng vai trị định q trình lên men Kết nghiên cứu Pasteure sở cho phát triển ngành công nghiệp lên men sản xuất dung môi hữu aceton, ethanol, butanol, isobutanol vào cuối kỷ 19 đầu kỷ 20 Dần dần trình lên men sản xuất dung môi hữu thay ngành công nghiệp sản xuất hoá chất từ dầu mỏ Cũng giai đoạn có xu hướng cải tiến cơng nghệ lên men truyền thống Ví dụ: cơng nghệ lên men ethanol bổ sung vào môi trường lên men bisulphite (HSO3-) q trình tích luỹ theo hướng tạo glycerol thay hướng tích luỹ ethanol Glycerol cần để chế tạo thuốc nổ Giai đoạn phát triển quan trọng thứ hai trình phát triển CNSH sản xuất thuốc kháng sinh penicilin Năm 1928 Alexander Fleming phát khả kháng khuẩn nấm mốc Penicillum notatum Tuy nhiên đến năm 1940 sản xuất penicillin sản xuất qui mô lớn Thuốc kháng sinh penicillin cứu hàng triệu thương binh chiến thứ hai Trong thời kỳ có số cải tiến kỹ thuật thiết bị lên men vô trùng cho phép làm tăng đáng kể suất lên men Ngày ngành công nghiệp sản xuất thuốc kháng sinh có doanh thu 16 tỷ USD (1994) Sau chiến thứ hai, giai đoạn hồn thiện qui trình CNSH truyền thống, tối ưu hố q trình lên men, chọn lọc tạo chủng vi sinh vật đột biến siêu tổng hợp, làm tăng suất lên men Song song với kết nghiên cứu sinh học phân tử, hố sinh học có bước phát triển nhảy vọt làm sở cho hình thành phát triển nhanh chóng CNSH đại Đầu tiên phải kể đến cơng trình Watson Crick mơ hình xoắn kép DNA (1953) Sau phát hàng loạt cấu trúc bậc I phân tử protein insulin Sanger (1955) Sự phát restriction enzyme vào năm 1968 công cụ quan trọng kỹ thuật DNA tái tổ hợp Năm 1972 đánh dấu mốc quan trọng CNSH Berg, Boyer Cohen (Mỹ) tạo phân tử DNA tái tổ hợp in vitro Từ thành công mở đầu cho phát triển vũ bão công nghệ gen, cách mạng thực sự phát triển sinh học động lực thúc đẩy phát triển mạnh mẽ CNSH, ngành công nghệ kỷ 21 1.4 Triển vọng phát triển CNSH kỷ 21 Như nhiều nhận định nhà khoa học kinh tế kỷ 21 kỷ nguyên CNSH công nghệ thông tin Một điều lý thú hai nghành công nghệ mũi nhọn kỷ 21 có mối quan hệ chặt chẽ, tương hỗ thúc đẩy phát triển khơng ngừng Ví dụ: máy tính giúp nhà sinh học xây dựng nhanh chóng mơ hình phân tử protein, enzyme, thuốc, tìm mơ hình ưu việt cho hoạt tính sinh học cao hơn, chịu nhiệt tốt cách tạo cầu nối –S-S- Máy tính giúp nhà sinh học thực nhanh chương trình giải mã gen Ngược lại CNSH ngày mở tiềm to lớn cho cơng nghệ máy tính Đó dự án triển vọng sản suất chip sinh học (bọ điện tử) Đó việc phát phân tử protein Bacteriorhodopsine vi khuẩn Halobacterium hấp thụ ánh sáng dẫn đến biến đổi cấu trúc nội giống lý thuyết nhị phân (có, khơng) máy tính Chip sinh học có khả lưu trữ thông tin lớn bit/1nm3 so với 1bit/1012nm máy tính Số lượng toán giải 1s 10 20 so với 1012 máy tính nhanh Ngồi chip sinh học tiêu tốn lượng Triển vọng CNSH phải kể đến chương trình giải mã gen người, vi sinh vật, thực vật (GENOMICS) Đáng ý chương trình giải mã gen người với tỷ nucleotide, chứa 100.000 gen có bước tiến đáng kể dự tính đến năm 2010 giải mã xác định chức tất gen Thành tựu có ý nghĩa quan trọng liệu pháp gen, chữa trị tận gốc bệnh di truyền, bệnh ung thư, AIDS nhiều bệnh khác Công việc tiến hành tương tự với vi sinh vật, thực động vật thành tựu vĩ đại người tìm hiểu sinh giới Các triển vọng khác nông nghiệp động vật chuyển gen (transgenic animal), thực vật chuyển gen (transgenic plant), tiếp tục phát triển nhân rộng Đưa gen kháng thuốc diệt cỏ, gen tổng hợp thuốc trừ sâu sinh học, gen tạo nốt sần cố định nito, gen cho suất cao, chất lượng tốt, dễ bảo quản cho trồng Đối với vật nuôi chuyển gen kháng bệnh, tăng chất lượng thịt, tạo dịng vơ tính (như cừu Dolly) để sản xuất hàng loạt vật nuôi cho suất chất lượng thịt tốt Ngồi đưa gen mã hố cho hocmon, vaccin, thuốc vào thực vật, tuyến sữa vật ni để người phịng chữa bệnh cách ăn chuối uống sữa Tài nguyên sinh học môi trường lãnh vực hứa hẹn phát triển ứng dụng CNSH kỷ 21 Chúng ta tin tưởng CNSH kỷ 21 giúp người phát triển bền vững tài nguyên môi trường sống CHƯƠNG II: KỸ THUẬT TÁI TỔ HỢP DNA Kỹ thuật tái tổ hợp DNA (Recombinant DNA technology) thường gọi kỹ thuật di truyền đời sở hàng loạt thành tựu sinh học phân tử, hoá sinh học, vi sinh vật học, di truyền học, … Kỹ thuật tái tổ hợp DNA bao gồm tập hợp kỹ thuật tách, cắt, nối ghép, chuyển biểu gen mong muốn Sự đời kỹ thuật tái tổ hợp DNA năm 1972-1973 nhóm nghiên cứu Berg, Boyer Cohen (Mỹ) lần tạo phân từ DNA tái tổ hợp từ ba nguồn vật liệu khác gen virus SV 40 gây bệnh ung thư khỉ, phần gen phage λ gen operon lactose vi khuẩn E coli Đến năm 1977 coi mốc lịch sử kỹ thuật tái tổ hợp DNA với thành tựu Boyer tạo hoc môn não Somatostatin từ E coli chuyển gen Sau năm Boyer tạo insulin (hoc mơn tuyến tuỵ) từ E coli Có hai phát quan trọng công cụ kỹ thuật di truyền phát restriction enzyme vector plasmid 2.1 Các enzyme rectriction endonuclease Năm 1962 Arber lần chứng minh vi khuẩn có enzyme đặc biệt có khả phân biệt DNA DNA lạ Các enzyme có khả hạn chế (rectriction) phát triển phage tế bào vi khuẩn cách phân huỷ DNA phage cách đặc hiệu, enzyme gọi enzyme cắt hạn chế (restriction enzyme) Các restriction enzyme có vai trị quan trọng kỹ thuật tái tổ hợp DNA Các restriction enzyme endonuclease nghĩa chúng cắt liên kết phospho diester phân tử DNA điểm đặc hiệu nằm chuỗi DNA Các restriction enzyme chia làm ba nhóm, nhóm II nhóm thường sử dụng kỹ thuật tái tổ hợp DNA Các restriction enzyme nhóm II nhận biết DNA mạch kép trình tự nhận biết cắt điểm nhận biết kế cận Các trình tự nhận biết (recognition sequences) thường có – cặp nucleotide, đơi tới cặp nucleotide Những trình tự nhận biết đối xứng đảo ngược gọi palindrom Mỗi restriction enzyme có trình nhận biết đặc trưng Nếu vị trí cắt restriction enzyme trình tự nhận biết tạo nên chuỗi DNA đầu (blunt ends) Ví dụ: - Enzyme Hae III (Từ vi khuẩn Haemophilus aegyptium) có trình tự: -G G C C Hae III G G C C -C C G G -Trình tự nhận biết C C -G G -Đầu Nếu vị trí cắt nằm cạnh trình tự nhận biết tạo đầu lệch, cịn gọi đầu dính (cohesive ends) Khi tạo thành đầu dính base bổ sung nên phân tử DNA dễ gắn lại với lúc chưa bị cắt Ví dụ: - Enzyme EcoR I ( Từ vi khuẩn E.coli): G A A T T C EcoR I G C T T A A G -Trình tự nhận biết EcoR I G G A T C C amyloliquefaciens) C C T A G G -Trình tự nhận biết Bam HI A A T T C -C T T A A G -Đầu dính Bam HI- Enzyme Bam HI (Từ GVi Tkhuẩn Bacillus G A C C -C C T A G G -Đầu dính Hiện người ta phát 500 restriction enzyme với 120 trình tự nhận biết khác 2.2 Thu nhận gen Ngay từ năm 1969 Becwitt Shapiro phân lập gen từ operon lactose E.coli phương pháp vật lý di truyền vi sinh cổ điển Ngày nguồn gen thu nhận ba phương pháp: 2.2.1 Tách thu nhận gen từ gen Đây phương pháp sử dụng rộng rãi từ buổi đầu kỹ thuật tái tổ hợp DNA Toàn bộ gen sinh vật cắt nhỏ thành đoạn 15.000 – 20.000 cặp base phương pháp học restriction enzyme Sau đoạn DNA gắn vào plasmid tạo DNA tái tổ hợp Đây phương pháp mang tính chất ngẫu nhiên, mị mẫm gen sinh vật chứa nhiều gen nên khó phân lập gen cần thiết cách xác (Ví dụ: người có 100.000 gen) Tuy nhiên phương pháp sử dụng để thành lập ngân hàng gen sinh vật (bank of genomic DNA) 2.2.2 Tổng hợp gen phương pháp hố học Năm 1969 nhóm Khorana tổng hợp nhân tạo gen gen mã hoá tổng hợp tRNA alanin nấm men Gen có chiều dài 77 cặp nucleotide, khơng có trình tự điều hồ nên khơng hoạt động Để tổng hợp nhân tạo gen phương pháp hoá học cần biết trình tự nucleotide gen Trình tự nucleotide gen xác định phương pháp nghiên cứu trình tự axit amin protein mà gen mã hoá phương pháp xác định trình tự nucleotide Lần vào năm 1977, Itakura Boyer tổng hợp thành cơng gen mã hố cho hoc mon somatostatin động vật có vú, gen biểu tế bào E coli Sau thành công nhiều gen tổng hợp nhân tạo gen mã hoá cho protein gen tổng hợp hoc mon tăng trưởng người somatotropin, hoc mon trị tiểu đường insulin 2.2.3 Sinh tổng hợp gen từ mRNA tương ứng Đây phương pháp mà ngày kỹ thuật tái tổ hợp DNA sử dụng rộng rãi Phương pháp dựa vào trình phiên mã ngược nhờ sử dụng enzyme phiên mã ngược reverse transcriptase Đây enzyme xúc tác cho trình tổng hợp nên DNA mạch từ khuôn mRNA DNA tổng hợp từ mRNA gọi c-DNA (complementary DNA) Từ c-DNA mạch đơn tổng hợp thành c-DNA mạch kép nhờ enzyme DNA polymerase nuclease S1 (hình 2.1) Hình 2.1: Sinh tổng hợp gen từ mRNA Ơ Eukaryote trình phiên mã xảy phức tạp Sau mRNA tổng hợp từ gen (tiền mRNA) mRNA phải trải qua giai đoạn trưởng thành (splicing) cắt bỏ đoạn intron nối đoạn exon lại tế bào chất để tổng hợp protein Như tách m RNA trưởng thành để tổng hợp cDNA gen mã hố cách xác cho protein Để tách mRNA người ta dựa vào tính chất mRNA có gắn poly A nên dễ tách khỏi hỗn hợp RNA cách cho hỗn hợp chảy qua cốt có gắn poly T Ngồi thể động vật có nhiều tế bào chun hố tế bào tuỷ xương tổng hợp hồng huyết cầu tế bào giàu mRNA globin, tuyến tơ tằm chứa nhiều mRNA mã hoá tổng hợp fibroin dễ tách mRNA Bằng phương pháp người ta tổng hợp gen globin người, động vật, chim, gen mã hoá ovalbumin trứng, fibroin tơ tằm, inteferon người… 2.3 Các vector chuyển gen Để chuyển gen từ sinh vật sang sinh vật khác thực biến nạp DNA bơm thẳng DNA vào tế bào Tuy nhiên cách đơn giản hiệu thấp phần lớn DNA lạ xâm nhập vào tế bào bị phân huỷ, DNA khơng tái tổ hợp khơng thể tự chép thành nhiều bản, dần Vì cần phải có vector để vận chuyển gen Vector chuyển gen phân tử DNA có khả tự tái sinh, tồn độc lập tế bào mang gen cần chuyển Các vector phải thoả mãn yêu cầu tối thiểu sau đây: - Có trình tự khởi chép ori (Origin) để tự chép mà tồn độc lập - Có trình tự nhận biết (recognition sequence) để restriction enzyme cắt gắn gen lạ vào Các trình tự nhận biết phải cách xa trình tự khởi chép để tránh bị cắt nhầm - Có trình tự điều hồ (promoter) để phiên mã gen lạ - Có gen đánh dấu để dễ dàng phát gen lạ trình chọn lọc tế bào tái tổ hợp - Các vector phải có kích thước nhỏ tốt để mang lượng tối đa DNA lạ Hơn kích thước vector nhỏ dễ dàng xâm nhập vào vi khuẩn chép nhanh, hiệu 2.3.1 Các vector chuyển gen plasmid Plasmid đoạn DNA ngắn (2-5 kb), dạng vòng, nằm ngồi nhiễm sắc thể, tìm thấy lần vi khuẩn Sự chép plasmid không phụ thuộc vào chép nhiễm sắc thể vi khuẩn Plasmid thường mang gen kháng thuốc kháng sinh gen kháng tetracilin (TcR), gen kháng ampicilin (ApR) Mỗi tế bào vi khuẩn chứa tới hàng trăm plasmid Các vector plasmid nhận 8-9 kb DNA lạ Ví dụ: plasmid pBR 322 plasmid thông dụng, pBR 322 có 4363 bp, mang hai gen kháng thuốc kháng sinh ApR TcR 20 vị trí nhận biết nhất restriction enzyme (hình 2.2) 11 số nằm vào gen kháng thuốc kháng sinh nên việc gắn xen gen lạ vào vị trí làm tính kháng kháng sinh tương ứng, điều tiện lợi để chọn lọc tế bào tái tổ hợp Hình 2.2: Cấu trúc plasmid pBR 322 với 20 trình tự nhận biết restriction enzyme Hiện plasmid trải qua ba hệ, plasmid không ngừng cải tiến, ngày có thêm nhiều đặc tính q cho kỹ thuật tái tổ hợp 2.3.2 Các vector phage Phage (thực khuẩn thể) virus xâm nhiễm làm tan vi khuẩn Việc sử dụng phage làm vector có nhiều ưu điểm so với plasmid : - Phage trang bị hệ thống xâm nhập vào tế bào vi khuẩn có khả sinh sơi nhanh hiệu xâm nhiễm phage cao nhiều so với plasmid - Kích thước đoạn gen lạ mà vector phage mang lớn nhiều so với plasmid Phage tiếp nhận gen lạ có kích thước từ 15-23 kb Phần lớn vector phage sử dụng bắt nguồn từ phage λ Phage λ có kích thước 48502 bp Tuy nhiên phage λ có 1/3 số base khơng quan trọng (stuffer) cắt bỏ để tăng khả nhận gen lạ có kích thước lớn 2.3.3 Các loại vector khác Nhóm bao gồm vector thông dụng hơn, vector cosmid, nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men, nhiễm sắc thể nhân tạo động vật có vú Trong nhiễm sắc thể nhân tạo động vật có vú (MAC- Mammifere Artificial Chromosome) hệ thống phát triển vector trình tự TEL (telomeric sequencetrình tự đầu cuối nhiễm sắc thể) trình tự CEN (centromeric sequense- trình tự trung tâm nhiễm sắc thể) có nguồn gốc từ người, điều cho phép đưa MAC vào tế bào động vật có vú giữ chúng ổn định tế bào MAC thường ứng dụng liệu pháp gen 2.4 Tạo plasmid tái tổ hợp Có ba phương pháp tạo plasmid tái tổ hợp phương pháp sử dụng đầu dính (cohesive ends), phương pháp sử dụng đoạn nối (polylinkers) phương pháp dùng enzyme terminal transferase 2.4.1 Phương pháp sử dụng đầu dính (cohesive ends) Ở phương pháp vector chuyển gen plasmid (DNA vòng tròn) cắt loại restriction enzyme (Ví dụ: EcoRI) chuyển thành dạng thẳng có hai đầu dính AATT ngược lại Phân tử DNA lạ cắt enzyme EcoRI để tạo thành đoạn DNA có hai đầu dính Trộn lẫn DNA vector DNA lạ cắt EcoRI lại với nhau, đầu dính DNA lạ vector bổ sung bắt cặp với Enzyme ligase nối DNA lạ DNA vector lại với cầu phosphodiester tạo nên phân tử DNA tái tổ hợp (hình 2.3) Hình 2.3: Gắn DNA lạ vào vector phương pháp dùng đầu dính 2.4.2 Phương pháp dùng đoạn nối (linkers) Các đoạn nối (linkers) đoạn oligonucleotide có chiều dài từ 10-20 nucleotide tổng hợp hoá học Trong đoạn linker phải mang trình tự nhận biết đặc hiệu restriction enzyme Sau dùng enzyme DNA ligase phage T4 nối đoạn với DNA lạ Cắt vector chuyển gen DNA lạ nối linker restriction enzyme tương ứng với trình tự nhận biết linker (dĩ nhiên vector chuyển gen phải có trình tự nhận biết restriction enzyme đó).tạo đầu dính hai đầu vector DNA lạ Nhờ mà DNA lạ gắn vào vector hỗn hợp với có xúc tác ligase (hình 2.4) Phương pháp thường dùng trường hợp DNA lạ vector khơng có trình tự nhận biết restriction enzyme Ví dụ : mạch kép cDNA, DNA có đầu (blunt ends) 10 Hình 2.4: Phương pháp dùng đoạn nối linkers tạo DNA tái tổ hợp 2.4.3 Phương pháp dùng enzyme terminal transferase Enzyme terminal transferase có hoạt tính xúc tác tổng hợp đoạn homonucleotide (ví dụ: GGGG CCCC) đầu 3’-OH chuỗi DNA để hình thành đầu dính cho DNA lạ vector chuyển gen (hình 2.5) 11 Hình 2.4: Phương pháp dùng enzyme terminal transferase gắn DNA lạ vào vector Vector chuyển gen DNA lạ cần gắn cắt exonuclease restriction enzyme (Ví dụ: Pst I) Sau vector ủ với enzyme terminal transferase loại nucleotide (dGTP), kết tạo thành hai đầu mút ’OH vector đoạn poly G (3’ GGGGG) Đoạn DNA lạ sau cắt exonuclease ủ với enzyme terminal transferase bổ sung vào môi trường ủ dCTP để tạo đuôi ’ CCCCC bổ sung với đuôi GGGGG vector Nhờ mà DNA lạ gắn vào vector bắt cặp bổ sung G C Giai đoạn cuối dùng enzyme DNA polymerase I lấp chỗ trống ligase hàn dính DNA lạ với vector tạo nên DNA tái tổ hợp Với phương pháp gắn DNA lạ vào vector chuyển gen 2.5 Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào Sau tạo DNA tái tổ hợp, DNA tái tổ hợp đưa vào tế bào (vi khuẩn, tế bào động vật thực vật) để gen lạ hoạt động Quá trình gọi biến nạp 2.5.1 Hoá biến nạp Để biến nạp DNA tái tổ hợp vào vi khuẩn dùng tế bào vi khuẩn không chứa plasmid xử lý với CaCl2 lạnh kèm theo sốc nhiệt 420C phút DNA tái tổ hợp xâm nhập vào tế bào vi khuẩn Đối với tế bào động vật có vú khó biến nạp Người ta sử dụng phsphate canxi làm trung gian cho DNA tái tổ hợp biến nạp Hiệu thấp, từ 1-2% tế bào hấp thụ 2.5.2.Điện biến nạp Sử dụng dòng điện cao cục (ngắt quãng) giúp tế bào hấp thụ DNA tái tổ hợp Vì phương pháp gọi điện biến nạp (electrotransformation) Phương pháp có hiệu biến nạp cao hố biến nạp tỷ lệ tế bào bị chết sốc điện cao, từ 50-70% 2.5.3 Phương pháp vi tiêm Đối với tế bào động vật có vú tiêm thẳng DNA vào tế bào (thường hợp tử) hình chụp (hình 2.6) 12 Hình 2.6: Tiêm DNA lạ vào tế bào trứng (hợp tử) chuột 2.5.4 Phương pháp bắn DNA vào tế bào Ở tế bào thực vật có vách tế bào dày cấu tạo cellulose khó biến nạp Để khắc phục khó khăn người ta dùng phương pháp bắn DNA vào tế bào DNA thường bọc hạt kim loại vàng, tungsten có kích thước khoảng µm bắn bào tế bào Phương pháp phổ biến để tạo thực vật chuyển gen Ngoài phương pháp vector cấu tạo từ virus chúng có hệ thống tự xâm nhiễm vào tế bào hiệu hiệu biến nạp cao 2.6 Phương pháp chọn lọc, tạo dòng biểu gen Sau tiến hành biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn , công việc kiểm tra diện DNA lạ mong muốn, chọn lọc tế bào có mang DNA lạ nhân lên thành dòng tạo điều kiện cho biểu gen lạ (DNA lạ) 2.6.1 Phương pháp xác định dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp Do hiệu suất tái tổ hợp vàbiến nạp thường thấp, dịng vi khuẩn mọc lên có ba loại: - Tế bào vi khuẩn không nhận plasmid - Tế bào nhận plasmid không mang gen la - Tế bào nhận plasmid tái tổ hợp Hiện có nhiều phương pháp để chọn lọc dịng vi khuẩn có mang gen tái tổ hợp phương pháp lai DNA với mẫu thử đánh dấu phóng xạ, phương pháp sử dụng kháng thể Tuy nhiên hai phương pháp đơn giản sử dụng phương pháp bổ sung α phương pháp dùng gen kháng kháng sinh đánh dấu + Phương pháp bổ sung α: Nhiều vector chuyển gen có mang gen lacZ (mã hố cho enzyme β-galactosidase) Khi mơi tường ni cấy có chất X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-galactose) enzyme β-galactosidase phân huỷ X-gal cho màu xanh Khi gắn gen lạ vào vector người ta cho gắn vào gen làm cho hoạt tính β-galactosidase, chất X-gal có màu trắng Vì sau ni cấy hỗn hợp tế bào vi khuẩn tái tổ hợp mơi trường có bổ sung X-gal khuẩn lạc màu trắng chứng tỏ có mang gen lạ để chọn lọc nhân lên thành dòng (cloning) + Phương pháp sử dụng gen kháng kháng sinh đánh dấu: 13 10 Một số vector plasmid thương mang gen kháng ampicillin (Ap R) kháng tetracillin (Tc R) Khi gắn gen lạ vào vector người ta thương chủ tâm gắn vào vị trí hai gen làm hoạt tính kháng thuốc (ví dụ : hoạt tính gen Tc R) Khi cấy vi khuẩn biến nạp mơi trường có thuốc kháng sinh ampicillin tetracillin vi khuẩn bị ức chế tetracillin chứng tỏ bị hoạt tính kháng tetracillin xen đoạn gen lạ chọn lọc nhân lên thành dòng 2.6.2 Sự biểu gen tạo dịng Khơng phải tất gen lạ tái tổ hợp đưa vào tế bào biểu Sự biểu gen trải qua hai bước là: - Gen phiên mã để tơng hợp nên mRNA - m RNA có đầy đủ chức để tham gia vào trình dịch mã tổng hợp nên protein Vì gen biểu tối đa cần có yêu cầu sau: - Gen phải có promoter mạnh để phiên mã tốt - mRNA phải có có trình tự khởi đầu, kết thúc, có điểm bám ribosome (rbs) cho q trình dịch mã 2.7 Cần có số lượng hợp lý vector plasmid tế bào Gen tái tổ hợp phải có ổn định lâu dài Một số ứng dụng kỹ thuật tái tổ hợp DNA Tóm tắt bước kỹ thuật tái tổ hợp DNA số ứng dụng trình bày hình 2.7 đề cập chương sau Hình 2.7: Kỹ thuật tái tổ hợp DNA số ứng dụng CHƯƠNG III: CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG CÔNG NGHIỆP 14 Trong chương đề cập cách khái quát qui trình cơng nghệ cơng nghiệp thực phẩm hố chất có tham gia vi sinh vật đóng góp CNSH nâng cao hiệu suất qui trình 3.1 CNSH công nghiệp chế biến thực phẩm Trước công nghiệp thực phẩm, nghiên cứu CNSH chủ yếu tập trung để hồn thiện qui trình cơng nghệ lên men truyền thống (như nghiên cứu tối ưu môi trường nuôi cấy, thiết bị nồi lên men, …) Hiện nghiên cứu CNSH chủ yếu liên quan đến việc tạo chủng có suất sinh học cao, phương pháp gây đột biến đại ứng dụng kỹ thuật di truyền tạo dòng (cloning) kỹ thuật lên men đại kỹ thuật cố định tế bào, enzyme CNSH cơng nghiệp thực phẩm gồm có qui trình chế biến sữa, chế biến tinh bột, qui trình sản xuất nước uống lên men, qui trình sản xuất thực phẩm giàu protein, … 3.1.1 Công nghiệp chế biến sữa Các qui trình chế biến sữa sản xuất phoma, sữa chua, có từ lâu Tuy nhie6 qui trình truyền thống sử dụng chủng vi khuẩn tự nhiên (Lactobacillus, Streptococus) có mặt sữa để lên men khó kiểm sốt, chất lượng khơng ổn định hiệu không cao Ngày nhờ việc tạo chủng có hoạt tính cao, khiết nên điều khiển q trình lên men cách có định hướng rút ngắn qui trình sản xuất, nâng cao ổn định chất lượng Ví dụ: qui trình sản xuất phoma truyền thống sau: Lên men, tạo acid Tách sữa đông Lê Sữa Đơng tụ L.bulgaricus đun nóng, tạo hình S lactis Ủ chín Tạo mùi vị Phoma – 20 tháng Ơ bước (1) sữa lên men với vi khuẩn lên men tạo axit gây đông tụ protein, để rút ngắn giai đoạn ngày người ta thường thêm renin (enzyme gây đông tụ sữa bê non) thúc đẩy q trình đơng tụ Sau tách sữa đơng đun nóng, tạo hình, thêm muối để ủ chín Giai đoạn ủ chín dài (ở nhiệt độ thấp) với mục đích tạo hương vị để tăng chất lượng phoma Để rút ngắn giai đoạn mà không làm giảm chất lượng phoma, gần người ta tìm enzym peptidase Bacillus subtilis thích hợp với mục đích này, làm rút ngắn thời gian ủ chín cịn nửa thời gian 3.1.2 Cơng nghệ sinh học chế biến tinh bột Trong công nghiệp chế biến tinh bột chủ yếu tạo sản phẩm thuỷ phân tinh bột Cho đến năm 50 tinh bột chủ yếu thuỷ phân axit Ngày cơng nghệ thay hồn toàn enzyme amylase, glucoamylase nấm mốc Aspegillus niger, enzyme chịu nhiệt độ 100 0C thuận tiện cho cơng nghệ thuỷ phân tinh bột Ngày công nghệ chế biến tinh bột quan trọng sản xuất siro fructoseglucose dùng công ngiệp nước giải khát, công nghiệp bánh kẹo Cơng nghệ thực theo qui trình sau: 15 Hồ hoá, amylase Tinh bột Glucose isomerase Glucose siro glucose, fructose Glucoamylase Sau thuỷ phân tinh bột thành đường glucose, phần glucose đồng phân hoá thành fructose (ngọt đường saccharose 1,5 lần) enzyme glucose isomerase, tạo thành hỗn hợp siro với 51% glucose 42% fructose Ngày công nghệ có bước cải tiến đáng kể sử dụng enzyme glucose isomerase cố định, theo số liệu gần cho thấy Công nghệ enzyme cố định glucose isomerase sử dụng liên tục tháng, 1kg enzyme cố định sản xuất 22000 kg sản phẩm Công nghệ phát triển Mỹ hàng năm giới sản xuất triệu sản phẩm siro glucose-fructose 3.1.3.Công nghệ sản xuất nước uống lên men Trong công nghệ sản xuất nước uống lên men chủ yếu sử dụng nguyên liệu đường, chủng vi sinh lên men Saccharomyces cerevisiae để lên men nguyên liệu đường thành ethanol Quan phải kể đến qui trình sản xuất bia _ Nguyên liệu Giai đoạn chuẩn bị Sản xuất bia Sản phẩm phụ _ Lúa mạch Nước Đường mía Hoa bia Mầm mạch Nghiền Phế thải làm thức ăn GS Bể chứa Bể trộn Thức ăn gia súc Dịch đường Sấy Đun dịch đường Phân hữu Làm lạnh Thùng giữ bia Ủ bia Bia tươi Vô chai 3.1.4 Sản phẩm giàu protein Sinh khối tế bào vi sinh vật hay protein đơn bào (SCP, single cell protein) ln có hàm lượng protein cao (40-50% chất khô), vi sinh vật lại sinh sản, tăng sinh khối nhanh dễ sản xuất với qui mô lớn, ngày CNSH ý đến lãnh vực Một ưu điểm công nghệ hầu hết qui trình sử dụng nguồn nguyên liệu phế thải nhà máy chế biến thực phẩm, chế biến giấy, dầu mỏ, có lợi ích to lớn vừa giải vấn đề ô nhiễm môi trường tạo sản phẩm giàu protein 16 Đáng ý qui trình sản xuất SCP hãng BP(Anh) sản xuất protein nấm men từ dầu mỏ có tên thương mại Toprina Ơ Nhật có qui trình tương tự với công suất 200.000 tấn/năm Liên xô (cũ) sản xuất SCP với sản lượng triệu /năm Hiện cơng ty ICI(Anh) có dự án sản suất 700.000 tấn/năm lấy tên thương mại Pruteen Dự án sử dụng vi khuẩn Methyllophilus methylotrophus AS có hiệu suất lên men cao nhờ cải biến di truyền cách gắn plasmid có mang gen mã hoá cho enzyme glutamate dehydrogenase Tuy nhiên hầu hết sản phẩm SCP sử dụng cho chăn ni hàm lượng protein cao khơng hấp dẫn, ngon miệng Ngồi hàm lượng axit nucleic sản phẩm cao dễ gây bệnh thống phong (Goutte) Ngoài SCP từ nấm men vi khuẩn cịn có sản phẩm giàu protein khác, có nhiều triển vọng từ tảo Trong đáng ý tảo Spirulina lồi tảo có mặt Việt nam lâu Hiện có pilot ni trồng cơng nghiệp Bình thuận 3.2 Cơng nghệ sinh học sản xuất hố chất CNSH ngày sở cho nhiều qui trình sản xuất sản phẩm hố học dung môi hữu cơ, axit hữu cơ, kháng sinh, axit amin, cơng nghiệp khai khống khai thác đồng, vàng, … 3.2.1 Lên men sản xuất dung môi hữu Trước dung môi hữu acetone, butanol, isopropanol sản xuất cách chưng cất gỗ, ngày thay qui trình lên men yếm khí nhờ vi khuẩn Clostridium acetobutylicum mơi trường chứa tinh bột Quá trình diễn sau: Tinh bột Glucose Trioso-3-P Acetone Pyruvate Isopropanol Butyrate Acetyl-CoA Glucoso-6-P n-Butanol Acetoacetyl-CoA 3.2.2 Sản xuất axit hữu Axit acetic axit hữu thông dụng nhất, riêng Mỹ hàng năm sản xuất tiêu thụ 1,5 triệu tấn, tương đương 500 triệu USD Công nghệ trước sản xuất axit acetic cách lên men rượu ethanol Hiện nước tiến công nghệ thay hồn tồn cơng nghệ sử dụng vi khuẩn chịu nhiệt biến đổi cellulose thành axit acetic Gần việc sử dụng công nghệ sản xuất acetic từ CO H2 nhờ vi khuẩn Acetobacter Clostridium Ngoài axit khác axit lactic, axit citric ngày sản xuất với qui mô công nghiệp sử dụng lên men vi sinh vật Ví dụ : axit lactic lên men từ vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus Ngày người ta sử dụng công nghệ cố định tế bào vi khuẩn L bulgaricus gel anginate để sản xuất liên tục Thời gian bán phân huỷ chế phẩm 100 ngày 3.2.3 Sản xuất axit amin 17 Sản xuất axit amin bắt đầu sản xuất công nghiệp vào năm 1908 cách thuỷ phân gluten bột mì (Nhật), cơng nghệ trì tới 50 năm Bắt đầu từ năm 1957 nhà khoa học Nhật phát khả tích luỹ axit amin cao vi sinh vật thay công nghệ cũ lên men vi sinh vật Sản xuất axit amin hàng năm giới thu hàng tỷ USD (1,9 tỷ năm 1979) Ngày axit amin chủ yếu sản xuất công nghệ lên men sử dụng chủng đột biến Corynebacterium, Brevibacterium, E.coli, … Các chủng thể sản xuất lượng lớn axit amin (20-30g/lit) nhờ đột biến mẫn cảm với chế ức chế ngược (feedback) Một số công nghệ sản xuất axit amin sử dụng enzyme cố định Gần kỹ thuật tái tổ hợp DNA ứng dụng công nghệ sản xuất axit amin Một số trường hợp thành công sản xuất tryptophan treonin tăng hiệu suất từ 20 lên 60 g/lit 3.2.4 Sản xuất kháng sinh thuốc steroid Công nghệ sinh học sản xuất thuốc kháng sinh hàng năm thu 10 tỷ USD Kháng sinh tổng hợp chủ yếu nhờ nấm mốc xạ khuẩn sản xuất kháng sinh penicillin từ nấm mốc Penicillum, kháng sinh streptomycine từ xạ khuẩn Streptomyces Hiện công nghệ sản xuất kháng sinh chủ yếu sử dụng chủng đột biến Ví dụ: chủng Penicillum notatum Fleming phát có khả tổng hợp mg/lit, sau nhiều trình chọn lọc đột biến tạo chủng cho hiệu suất 7000 mg/lit Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp kháng sinh nghiên cứu kỹ lưỡng để thu hiệu suất cao Có nhiều tiến CNSH sản xuất thuốc kháng sinh sử dụng enzyme cố định để tổng hợp cải biến thuốc, sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào để tạo kháng sinh lai, có phổ tác dụng rộng gần sử dụng kỹ thuật tái tổ hợp DNA để tạo tổ hợp kháng sinh có phổ rộng suất lên men cao Một ví dụ điển hình CNSH sản xuất thuốc đường sinh tổng hợp cortisone Nếu tông hợp đường hố học 27 phản ứng phức tạp giá thành 200 USD/g Các nhà khoa học tìm chủng nấm Rhizopus thực công việc giá thành hạ xuống cịn 6USD/g 3.2.5 Cơng nghệ sinh học khai khống Lần vào năm 1947 người ta phân lập vi khuẩn Thiobacillus ferrooxidans từ nước thải hầm mỏ Sau người ta phát nhiều vi khuẩn khác tham gia vào trình tuyển quặng, quan trọng Leptospirillum ferroxidans có khả oxy hố quặng pyrite chứa nhiều FeS Chúng có khả sống điều kiện khắc nghiệt pH thấp, nồng độ kim loại độc cao Ví dụ điển hình mỏ Bingham Canyen (Mỹ) có trữ lượng cao 3,6.10 tấn, hàm lượng Cu thấp (< 0,4%) tốn sử dụng công nghệ nhiệt luyện Người ta tiến hành phun tẩm uớt quặng nước (pH=1,5-3,0) tạo điều kiện cho vi khuẩn Thiobacillus ferrooxidans phát triển giúp hoà tan quặng Cu2S thành CuSO4 với hàm lượng khoảng 0,75-2,2 g/l Sau đồng tủa cách thêm sắt: CuSO4 + Fe Cu + FeSO4 Ngồi cơng nghệ khai thác đồng vi sinh vật, ngày người ta cịn ứng dụng cơng nghệ khai thác vàng, uranium 18 19 ... (có, khơng) máy tính Chip sinh học có khả lưu trữ thơng tin lớn bit/1nm3 so với 1bit /10 12nm máy tính Số lượng toán giải 1s 10 20 so với 10 12 máy tính nhanh Ngồi chip sinh học tiêu tốn lượng Triển... thành công mở đầu cho phát triển vũ bão công nghệ gen, cách mạng thực sự phát triển sinh học động lực thúc đẩy phát triển mạnh mẽ CNSH, ngành công nghệ kỷ 21 1.4 Triển vọng phát triển CNSH kỷ 21. .. kháng sinh đánh dấu + Phương pháp bổ sung α: Nhiều vector chuyển gen có mang gen lacZ (mã hố cho enzyme β-galactosidase) Khi mơi tường ni cấy có chất X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-galactose)