Mee Ree et ee Bs Sữa — Định lượng tế bào xôma _ , waar as gE Phần 2: Phương pháp đếm hạt điện tử Milk - Enumeration of somatic cells Part 2 - Electronic particle counter method
Trang 1TCVN TIEU CHUAN VIET NAM
TCVN 6686 - 2 : 2000 LSO_13366G.-2.:1997
SỮA - ĐỊNH LƯỢNG TẾ BÀO XÔMA
PHẦN 2 : PHƯƠNG PHÁP ĐẾM HẠT ĐIỆN TỬ
Milk — Enumeration of somatic cells
Part 2: Electronic particle counter method
HÀ NỘI - 2000
Trang 2Lời nói đầu
TCVN 6686 - 2 : 2000 hoàn toàn tương đương với ISO 13366 - 2 : 1997
TCVN 6686 - 2 : 2000 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F12 Sữa
và sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn - Đo lường - Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi trường ban hành
Trang 3Mee Ree et ee
Bs
Sữa — Định lượng tế bào xôma _ , waar as gE
Phần 2: Phương pháp đếm hạt điện tử
Milk - Enumeration of somatic cells
Part 2 - Electronic particle counter method
Cảnh báo — Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các chất liệu, thiết bị và các thao tác nguy hiểm Tiêu chuẩn này không đề cập đến các vấn đề an toàn khi sử dụng chúng Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn qui định trước khi sử dụng tiêu chuẩn
1 Pham vi ap dung
Tiêu chuẩn này qui định phương pháp đếm tế bao xôma trong sữa nguyên liệu và sữa bảo quản bằng hoá chất, sử dụng máy đếm hạt điện tử
Chú thích - Người sử dụng tiêu chuẩn này nên biết rằng tuỳ theo nguyên tắc đếm (đếm hạt), mà các kết quả thu được trong tiêu chuẩn này không phải lúc nào cũng có thể so sánh được với các kết quả thu được trong các tiêu chuẩn
TCVN 6686 - 7: 2000 (ISO 13366 - 1) va TCVN 6686 - 3 : 2000 (ISO 13366-3)
2_ Định nghĩa
Trong tiêu chuẩn này áp dụng định nghĩa sau đây :
2.1 Tế bào xôma : Tế bào đếm được bằng máy đếm hạt điện tử, sau khi được nhuộm màu ở ngưỡng nhỏ
hơn và loại bỏ các hạt chất béo phủ lên dãy tế bào xôma
Máy đếm Coulter do Công ty trách nhiệm hữu hạn điện tr Counter cung cấp, Norhwell Drive, Luton LV 33 RH,
Bedfordshire, Anh quéc, day 14 mot thí dụ về sản phẩm bán sắn thích hợp Thông tin này đưa ra tạo thuận lợi cho người sử
dụng tiêu chuẩn và không được Tổ chức tiêu chuẩn hoá Quốc tế xác nhận
Trang 4TCVN 6686 - 2 : 2000
3 Nguyên tắc
Cho dung dịch focmaldehyt (formalin) vào mẫu thử để nhuộm màu các tế bào xôma Pha loãng hỗn hợp chất điện phân tạo nhũ hoá và làm nóng tiếp để phá vỡ các hạt chất béo phủ lên tế bào xôma Đọc trực tiếp
số lượng tế bào xôma hàng nghìn đơn vị trên milili
Chú thích - Trong máy đếm hạt điện tử, sữa lọt qua khe hở giữa các điện cực Khi một hạt đi qua khe hở, nó đổi chỗ chất lỏng có tính dẫn điện cao cho chất lỏng có tính dẫn điện thấp hơn Điện trở tăng sẽ tăng điện áp, tạo xung điện áp tỷ lệ thuận với thể tích của hạt Số lượng xung cho biết số lượng hạt đi qua Chỉ được đếm các xung ở trên mức độ hãm ban đầu
4 Thuốc thử
Cảnh báo - Focmaldehyt là chất độc, Việc chuẩn bị và sử dụng hỗn hợp chất điện phân nhũ hoá phải được thực hiện trong tủ hốt
Chỉ sử dụng thuốc thử đạt chất lượng tinh khiết phân tích, trừ khi có qui định khác và chỉ sử dụng nước cất
hoặc nước đã loại ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương
4.1 Hỗn hợp điện phân nhũ tương
4.1.1 Thanh phan
Poly(etylen glycol)mono-p- (1,1 ,3,3-tetrametylbutyl) phenyl ete * 20,0 mi
Dung dịch muối natri clorua, 0,9 g/100 ml 885,0 mi
Trộn kỹ poly(etylen glycol) và etanol Cho thêm dung dich natri clorua Lọc hỗn hợp qua bộ lọc thích hợp (5.6)
Hàng ngày phải kiểm tra để xác định lượng hạt lạ có trong hỗn hợp điện phân nhũ tương Hỗn hợp này và dụng cụ bằng chất dẻo và thuỷ tỉnh được coi là sạch nếu số lượng hạt nhỏ hơn 20 trong 0,1 mililit hỗn hợp
điện phân nhũ tương
Để ngăn ngừa vi khuẩn phát triển, có thé cho 10 ml dung dich focmaldehyt, 35% (nưm) vào hỗn hợp điện
phân nhũ tương (4.1)
Chú thích - Có thể sử dụng dung dịch điện phân nhũ tương có bán sẵn, thí dụ, dung môi Xômaton 2
? _ Xômaton là thí dụ của sản phẨm thích hợp có bán sắn Thông tin này đưa ra tạo thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn và
không được tổ chức tiêu chuẩn hoá Quốc tế xác nhận
4
Trang 5TCVN 6686 - 2 : 2000
4.2 Dung dịch nhuộm màu
421 Thanh phan
1) Nồng độ focmaldehyt của focmalin thương mại dao động từ 35% (m/m) đến 40%
-| (mí) Điều này cần được tính đến khi chuẩn bị dung dịch nhuộm màu
422 Chuẩn bị
Chuyển eoxin và dung dịch focmaldehyt vào vào bình định mức dung tích 100 ml và trộn Pha loãng bằng
nước đến vạch mức 100 mi và trộn lại Lọc hoặc ly tâm chất lỏng để loại bỏ các hạt
Chú thích - Eoxin có trong dung dịch nhuộm màu để cố định màu mẫu thử
5_ Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị của phòng thí nghiệm thông thường và đặc biệt như sau:
Tất cả các dụng cụ thuỷ tinh trước khi sử dụng phải rửa sạch các chất hạt
5.1 Máy đếm hạt, máy đếm hạt điện tử có ống mao dẫn đường kính 100 um và thể tích đếm là 0,1 ml hoặc 0,5 mi (thí dụ, máy đếm Coulter Counter F hoặc FN) Cách khác, máy đếm tự động (thí dụ, máy đếm tế bào
sữa) có thể sử dụng với ống có đường kính lỗ 140 um và thể tích đếm là 0,3 mi
Chú ý - Khi lắp đặt máy đếm cần đảm bảo là đã loại trừ hết các ảnh hưởng điện từ Liên tục kiểm tra màn
đếm và thời gian đếm
Hiệu chuẩn thiết bị trước khi xác định mối quan hệ giữa thể thích hạt cần đếm và ngưỡng đếm cao hơn Hiệu chuẩn theo chỉ dẫn của nhà sản xuất bằng dung dịch huyền phù hạt chuẩn a
Kiểm tra việc hiệu chuẩn bằng các phép đếm khác nhau trên một số mẫu có các số đếm từ 300 000 tế
bào/ mi đến 1 000 000 tế bào / ml Phải chứng minh được rằng đường-kính mẫu của các tế bào là từ 5,45 um
đến 6,25 um Đánh giá giá trị giới hạn cho số ước đoán thông thường theo đường kính tương đương từ
4,7 um đến 5,0 um, dựa trên sự phân bố kích cỡ tìm được Kiểm tra từng áp kế để chắc chắn rằng số tế bào đếm được trong 0,1 mi là đúng bằng 1/5 của số tế bào đếm được trong 0,5 mi (về chi tiết xem
TCVN 6686 -3 : 2000 (ISO 13366-3), phu luc C)
5.2_ Nổi cách thuỷ, có thể duy trì nhiệt độ ở bất kỳ điểm nào trong khoảng từ 20°C đến 37°C
Trang 6TCVN 6686 - 2 : 2000
5.3 Nồi cách thuỷ, có thể duy trì nhiệt độ ở 55°C + 1°C và ở 80°C + 1°C
5.4 Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ ở 30°C + 1°C
5.5 Dụng cụ pipet, có thể chuẩn bị dung dịch pha loãng 1 : 100 (không bắt buộc, xem 8.1.2)
5.6 Bộ lọc, chịu được dung môi sử dụng, có cỡ lỗ 0,5 um hoặc nhỏ hơn
5.7 Ống thuỷ tỉnh hoặc ống bằng chất dẻo, thí dụ : loại có chiều dài 100 mm và đường kính 16 mm, đáy
tròn, cổ thẳng và được đóng kín một cách thích hợp
Khi sử dụng ống bằng chất dẻo, cần kiểm tra để chắc chắn rằng các tế bào xôma không bị thất thoát do
bám vào mặt ngoài của ống Sau khi rửa ống, phải tráng lại bằng nước cất đã lọc
5.8 Dụng cụ pipet, có thể phân phối 0,2 mi dung dich nhuộm màu
5.9 Cân phân tích, có độ chính xác đến 0,01 mg
6 Lấy mẫu
6.1 Điều quan trọng là phòng thí nghiệm phải nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay
đổi chất lượng trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản
Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 : 1998 (ISO 707)
6.2_ Nếu sử dụng bộ lấy mẫu tự động, thì chúng phải được kiểm tra một cách chính xác
6.3 Trước khi thử nghiệm hoặc lưu giữ, nên bảo quản mẫu ở nhiệt độ từ 2°C đến 6°C
6.4 Đối với các mẫu sữa nguyên liệu, nếu các mẫu không được thử ngay trong vòng 6 h sau khi lấy mẫu thì
phải bảo quản mẫu bằng cách bổ sung axit boric Nồng độ cuối cùng của axit này có trong mẫu thử không
được lớn hơn 0,6 g trong 100 ml mẫu Bảo quản các mẫu đó ở nhiệt độ từ 6°C đến 15°C không quá 24 h
6.5 Ngay sau khi lấy mẫu xong, các mẫu nên được nhuộm bằng focmalin (xem điều 7) Nên tiến hành bằng cách sử dụng ống mẫu có chứa sẵn một lượng chính xác dung dịch nhuộm.màu Các ống này được hàn kín
để tránh làm bay hơi focmalin
7 Chuẩn bị mẫu thử
Sau khi trộn đều, lấy 10 mi mẫu Dùng pipet (5.8) lấy 0,2 mi dung dịch thuốc nhuộm màu (4.2) cho vào mẫu Trộn để nhuộm màu các tế bào xôma
Việc nhuộm màu các tế bào thông thường được thực hiện bằng cách cho focmaldehyt vào sữa với tỷ lệ - khoảng 1 : 1500, nghĩa là cho 0,2 ml dung dịch thuốc nhuộm vào 10 mi mẫu thử Có thể sử dụng nồng độ
Trang 7TCVN 6686 - 2 : 2000
focmaldehyt cao hơn (thí dụ như với tý lệ khoảng 1 : 500, bằng cách tăng lượng dung dịch focmaldehyt, 35%
(m/m) trong dưng dịch thuốc nhuộm đến 30,0ml ) nhưng đặc biệt chú ý để tránh đánh giá sai các số đếm [thí
dụ, bằng cách làm nóng mẫu đến 55°C trong nổi cách thuỷ (5.3) trong 50 phút]
Giữ các mẫu thử ở 30°C trong tủ ấm (5.4) từ 15 h đến 18 h, hoặc ở nhiệt độ từ 18°C đến 25°C từ 22 h
đến 26 h
Không bảo quản các mẫu đã nhuộm màu quá 48 h ở nhiệt độ từ 6°C đến 15°C, để đảm bảo độ chính xác
của phép đếm nằm trong giới hạn qui định (về chỉ tiết xem TCVN 6686 - 3 : 2000 (ISO 13366-3), phụ lục Bì
8 Cách tiến hành
8.1 Phân mẫu thử
8.1.1 Làm ấm các mẫu thử đã nhuộm màu đã làm đông lạnh trong nồi cách thuỷ (5.2) đến nhiệt độ từ 20°C
© sn 37°C Sau khi trộn kỹ, cho vào mỗi ống (5.7) 0,1 mi mẫu thử và pha loãng bằng hỗn hợp chất điện phân
nhũ tương (4.1) để có được 10 mi
8.12 Việc pha loãng này có thể thực hiện bằng tay hoặc bằng pipet (5.5) Sai số không vượt quá + 1,5%
Nên kiểm tra thường xuyên độ chính xác của việc pha loãng bằng cách cân, thực hiện ít nhất 20 lần xác định
riêng rẽ, dùng mẫu thử đã đồng nhất
8.2 Phân bố các hạt chất béo
Làm nóng phần mẫu thử (8.1) khoảng 10 phút trong nổi cách thuỷ (5.3) đến 80°C Kiểm tra nhiệt độ của nổi
cách thuỷ bằng kiểm tra mẫu trắng, để đảm bảo rằng nhiệt độ của phần mẫu thử đã đạt và đã duy trì đúng
nhiệt độ này Chú ý cho nổi cách thuỷ có đủ nước để đảm bảo được mức chất lỏng trong ống nghiệm luôn thấp hơn mức nước
_ay phần mẫu thử ra khỏi nổi cách thuỷ và làm nguội đến nhiệt độ từ 15°C đến 25°C
Chú thích - Màu trắng đục của phần mẫu thử sau khi xử lý nhiệt là do focmalin làm đông cứng các Mixen
casein Các Mixen này có đường kính nhỏ hơn 1 um và không ảnh hướng đến việc đếm
8.3 Tiến hành xác định
Đếm các tế bào có trong phần mẫu thử (8.2) trong vòng 1 h khi làm nguội Trộn kỹ phần mẫu thử ngay trước khi đếm để thu được các tế bào phân bố càng đồng đều càng tốt Chuyển phan mau thử vào bình đong Chú
ý không để tạo bọt khí và các tế bào không bị bỏ sót trong ống nghiệm -
Sau đó tiến hành đếm tế bào bằng máy đếm hạt điện tử (5.1) Trong suốt quá trình đếm, điện cực bên ngoài
ống luôn luôn phải thấp hơn bể mặt chất lỏng
Trang 8TCVN 6686 - 2 : 2000
Trong khi đếm nên kiểm tra bộ phận theo dõi xung để phát hiện khả năng bị gây nhiễu Ngoài ra, thời gian
đếm.của từng phần mẫu thử nên nằm trong khoảng cho phép
1
9_ Biểu thị kết quả
Sử dụng một thể tích đo 0,1 ml và dung dịch pha loãng của 0,1 mi sữa trong 10 mi hỗn hợp điện phân nhũ
tương (4.1), ghi số lượng tế bào xôma theo cách đọc trực tiếp, tính bằng đơn vị hàng nghìn trên 1 mililit sữa
Về việc thảo luận cách dùng các mẫu chuẩn đếm tế bào, xem phụ lục C của TCVN 6686 - 3 : 2000
(ISO 13366-3)
10 Độ chính xác
Phụ lục B của TCVN 6686 -3 : 2000 (ISO 13366-3) đưa ra các khuyến cáo về qui trình kiểm tra chất lượng
11 Báo cáo kết quả
Báo cáo kết quả phải chỉ rõ :
- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
- phương pháp sử dụng;
- kết quả thử nghiệm thu được, và
- nếu kiểm tra độ lặp lại, thì nêu kết quả cuối cùng thu được
Cũng phải đề cập đến tất cả các chỉ tiết thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chỉ tiết
Báo cáo kết quả cũng bao gồm tất cả các thông tin cần thiết về việc nhận biết đẩy đủ mẫu thử
Trang 9TCVN 6686 -2 : 2000
Phụ lục A
(tham khảo)
Tài liệu tham khảo ˆ
[1] TCVN 6400 : 1998 (ISO 707 : 1997) Sita va san phẩm sữa - Các phương pháp lấy mẫu
[2] TCVN 6686 - 1 : 2000 (ISO 13366-
hién vi
rr
[3] TCVN 6686 -3 : 2000 (ISO 13366-3)
quang điện tử
1) Sữa - Định lượng tế bào xôma Phần † : Phương pháp dùng kính Sữa - Định lượng tế bào xôma Phần 3 : PhƯơng pháp huỳnh