ĐẶT VẤN ĐỀ Đánh giá đa dạng di truyền, xác lập chỉ thị phân tử cùng với khảo sát hình thái cũng như đặc điểm nông học của các tập đoàn giống đã được tiến hành phổ biến trên các đối tượn
Trang 1TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT
KHOA SINH HỌC
BÁO CÁO ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN
Trang 2Giáo viên hướng dẫn: LÊ NGỌC TRIỆU
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HOÀNG PHONG (CSK 38)
NGUYỄN THANH TIỀN (CSK 38)MAI TIẾN ĐẠT (CSK 39)
(Persea americana Miller)
ĐÃ QUA SƠ BỘ TUYỂN CHỌN TẠI LÂM
ĐỒNG
Trang 3ĐẶT VẤN ĐỀ
Đánh giá đa dạng di truyền, xác lập chỉ thị phân tử cùng với khảo sát hình thái cũng như đặc điểm nông học của các tập đoàn giống đã được tiến hành phổ biến trên các đối tượng tài nguyên thực vật Đây là những công việc cần thiết nhằm làm tăng hiệu quả cho quá trình nhận dạng, phát triển và chọn tạo giống mới đối với cây trồng
Bơ là một loại cây ăn quả có giá trị kinh tế cao, có tiềm năng phát triên
ở Lâm Đồng Đã có nhiều chủng giống bơ được trồng nơi đây nhưng cơ
sở dữ liệu cho việc nhận dạng, chọn tạo và công nhận giống còn chưa hoàn thiện, cần phải được nghiên cứu thêm Trước mặt cần triển khai ghi nhận đặc điểm sơ bộ về hình thái quả và năng suất của các dòng bơ đang được phát triển; đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn này và xác lập chỉ thị phân tử cho việc nhận dạng các dòng bơ tiềm năng nhằm:
- Bổ sung cho cơ sở dữ liệu nhận dạng dòng đối với cây trưởng thành cũng như ngay từ giai đoạn vườn ươm.
- Tạo cơ sở cho chiến lược chọn tạo và phát triển giống.
Đó là lý do đề tài này được đăng ký và triển khai thực hiện.
Trang 4Vật liệu:
Qua khảo sát ban đầu, có nhiều dòng/giống bơ nhập nội và được chọn tạo trong nước được canh tác tại Lâm Đồng Tuy vậy có 11 dòng bơ được chọn tạo trong nước đang được phát triển Đây là đối tượng nghiên cứu chính của đề tài
Trong đó, 06 dòng cần được xác lập chỉ thị phân tử, gồm:
04 05 Hải triều 1 Hải Triều 2 34
36
11 dòng được khảo sát các đặc
điểm cơ bản về năng suất và hình
thái quả và đánh giá đa dạng di
truyền gồm:
04 05 Hải triều 1 Hải Triều 2 34
36
34 lai HO TO BM00 BM02
Trang 5Nội dung, phương pháp và kết quả
Các đặc điểm ghi nhận gồm:
+ Đặc điểm quả: màu sắc, độ dày vỏ, chất lượng thịt quả, kích thước hạt, trọng lượng và hình dạng chung của quả.
+ Đặc điểm năng suất
thông qua các phiếu hỏi.
Trang 6Kết quả:
DÒNG BƠ 04
Địa chỉ thu mẫu: Đức Giang – Bảo Lâm
Năng suất: 300kg/cây/năm
Quả thon dài, thịt quả vàng nhạt, ráo, dẻo Khi chín vỏ quả màu xanh
Cỡ hạt: Trung bình
Trang 7DÒNG BƠ 05
Địa chỉ thu mẫu: Thôn 8 – Tâm châu – Di Linh Năng suất: 220kg/cây/năm
Thịt qủa vàng, hạt nhỏ
Quả thuôn dài
Vỏ quả chín có màu xanh
Cỡ hạt: Trung bình
Trọng lượng quả trung bình: 600g
Trang 8DÒNG BƠ 34
Địa chỉ thu mẫu: khu 4 – Phường B’Lao – Bảo Lộc.
Năng suất: khoảng 300kg/cây/năm
Chín vỏ da màu xanh thuôn dài, cơm vàng, hạt bé ( có trái không hạt ) Chiều dài quả từ 25 cm đến 35 cm
Khối lượng quả từ 300g đến 800g
Trang 9DÒNG BƠ 34 LAI
Địa chỉ thu mẫu: Trang trại giống bơ Hải Triều – Đambri – Bảo Lộc
Năng suất: khoảng 250kg/cây/năm
Khi chín vỏ quả có màu xanh, quả hơi tròn
Hạt trung bình, không dính vỏ
Trang 10DÒNG BƠ 036
Địa chỉ thu mẫu: Trang trại PGS Nguyễn Văn Kết - Đức Trọng- Lâm Đồng
Năng suất: 200- 300 kg/cây/năm
Vỏ quả chín có màu xanh, quả hình bầu dục, thịt quả dày màu vàng đậm, dẻo, béo
Trọng lượng quả trung bình 750g
Kích cỡ hạt: Trung bình
Trang 15DÒNG BƠ HẢI TRIỀU 2
Địa chỉ thu mẫu: Trang trại giống bơ Hải Triều – Đambri - Bảo Lộc
- Năng suất: Vẫn chưa rõ
- Màu quả khi chín : Xanh
- Hình hạng quả: Oval hơi dài
- Thịt quả: Vàng nhạt, không sơ, đặc đều
- Hạt: Tròn, không lắc
- Khối lượng của quả: 250- 475g
DÒNG BƠ HẢI TRIỀU 1
Địa chỉ thu mẫu: Trang trại giống bơ Hải Triều – Đambri - Bảo Lộc
- Năng suất: 650 kg/cây/năm
- Màu quả khi chín : Xanh
- Hình hạng quả: Oval dài đều
-Hạt: Dính thịt quả , không lắc, hình tròn
-Khối lượng của quả: 420- 680g
Trang 16Nội dung 2: Tách chiết, kiểm tra nồng độ và chất lượng DNA
DNA từ mẫu lá được tách chiết theo quy trình CTAB I có cải tiến (bổ sung SDS 10% vào đệm chiết)
DNA sau tách chiết được kiểm tra nồng độ và chất lượng bằng
phương pháp kiểm tra mật độ quang ở các bước sóng 260nm và 280nm.Kết quả
+ 11 mẫu DNA của 11 dòng bơ khảo sát, trong đó có 6 dòng cần phát triển marker nhận dạng với 3 mẫu/dòng đã được tách chiết và tinh sạch
+ Các mẫu DNA sau tách chiết đạt độ tinh sạch cao với lượng đủ cho các thực nghiệm tiếp theo
Trang 17Nội dung 3: Làm nảy sinh đặc trưng nhận dạng DNA dựa trên PCR Phương pháp:
Sử dụng kỹ thuật ISSR (Khuếch đại đoạn giữa các trình tự lặp đơn giản) để làm nảy sinh đặc trưng nhận dạng DNA với 10 mồi được sử dụng sau:
( 0 C)
Số band ghi nhận cho đánh giá đa dạng di truyền11 dòng bơ
Số band ghi nhận cho việc xác lập chỉ thị phân tử nhận dạng 6
Trang 18Khuếch đại DNA: Phản ứng PCR được thực hiện với dung tích 20
µl chứa 2 mM MgCl2, 0.25 mM mỗi loại dNTP, 1U Taq DNA polymerase (ThermoScientific), 0.2 µM mồi và khoảng 30 ng khuôn mẫu DNA, BSA 0.5%
Chương trình nhiệt sau:
94 0C trong 5 phút;
10 chu kỳ, mỗi chu kỳ có tiến trình nhiệt
94 0C trong 45 giâyNhiệt độ bắt mồi thích hợp +5 (Ta +5) 0C (Ta trong bảng trên) trong 45 giâygiảm dần 0,5 0C/chu kỳ
Kéo dài mạch ở 720C trong 1 phút 30 giây;
36 chu kỳ, mỗi chu kỳ có tiến trình nhiệt
94 0C trong 45 giâyNhiệt độ bắt mồi thích hợp (Ta) trong 45 giâyKéo dài mạch ở 720C trong 1 phút 30 giâyBước kéo dài mạch cuối cùng ở 720C trong 15 phút
(Touchdown PCR)
Điện di, chụp ảnh gel: Sản phẩm khuếch đại được phân tách trên gel agarose 2%,
sử dụng đệm TBE với điện thế 60 Volt, gel sau điện di được nhuộm với ethidium bromide (0.5 µg/ml), và được chụp ảnh dưới các ánh sáng cực tím có bước sóng 254/312 nm
Trang 19Kết quả:
Ảnh gel Đặc trưng nhận dạng DNA phục vụ cho đánh
giá đa dạng di truyền 11 dòng bơ theo 10 mồi
Mồi ISSR 808 Mồi ISSR 844B Mồi ISSR 856C Mồi ISSR 856T
Mồi ISSR 17899B Mồi ISSR HB13 Mồi ISSR UBC859G Mồi ISSR UBC873
Mồi ISSR HB14 Mồi ISSR HB9
Ghi chú: 1: dòng 04, 2: dòng 05, 3: dòng Hải Triều 2, 4: dòng Hải Triều 1, 5: dòng 34; 6: dòng 36; 7: dòng 34 lai; 8: dòng HO, 9: dòng TO; 10: dòng BM00, 11: dòng BM020.
Trang 20Ảnh gel Đặc trưng nhận dạng DNA phục vụ cho việc xác lập marker phân tử nhận dạng 06 dòng bơ theo 10 mồi
Ghi chú: 1, 2, 3: các mẫu dòng 04; 4, 5, 6: các mẫu dòng 05; 7, 8, 9: các mẫu dòng Hải Triều 2; 10, 11, 12: các mẫu dòng Hải Triều 1; 13, 14, 15: các mẫu dòng 34; 16,
17, 18: các mẫu dòng 36.
Dựa trên sự xuất hiện hay vắng mặt các band trên gel, thiết lập ma trận 0/1 để đánh giá đa dạng và xây dựng marker cho việc nhận dạng dòng
Mồi ISSR 808 Mồi ISSR 844B Mồi ISSR 856C Mồi ISSR 856T
Mồi ISSR 17899B Mồi ISSR HB9 Mồi HB13 Mồi HB14
Mồi ISSR UBC873 Mồi ISSR UBC859G
Trang 21Nội dung 4: Đánh giá đa dạng di truyền
Sử dụng phương pháp đánh giá đa dạng di truyền trong tập hợp mẫu của de Vicente và cs., 2003 với công cụ Microsoft Excel, các chỉ tiêu:
Với hj là mức độ dị hợp tử của locus thứ j, pi là tần số của allele thứ i ở
locus thứ j, He là mức độ dị hợp trông đợi trung bình cho tất cả các locus khảo sát và L là tổng số locus
Ngoài ra, phần mềm Popgen32 được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền tập hợp các dòng bơ khảo sát, hai chỉ số đa dạng là chỉ số đa dạng gene (h)
và chỉ số đa dạng Shannon (I) cho tập hợp mẫu thu được
Trang 22Kết quả
Sử dụng công cụ Excel với các công thức như trình bày như trên, thu được kết quả về sự đa dạng di truyền tập hợp 11 mẫu khảo sát như sau:
+ Tỷ lệ phần trăm band đa hình:
PPB = 91,84%
+ Mức độ dị hợp trông đợi trung bình:
He = 0,3072
Sử dụng phần mềm Popgen 32, thu được kết quả sau:
+ Chỉ số đa dạng gene (tương ứng với mức độ dị hợp trông đợi trung bình):
Trang 23Nội dung 5: Xây dựng marker phân tử cho việc nhận dạng 06 dòng bơ tiềm năng
Phương pháp:
Dựa trên Kết quả phân tích ảnh điện di và ma trận dữ liệu về sự xuất hiện/thiếu vắng các band một cách đặc biệt trên gel điện di, hai kiểu chỉ thị phân tử đơn và kép được xác định để nhận dạng các dòng.
Trang 24Vắng band 280bp mồi UBC873 đồng thời vắng band 1500bp mồi HB13 (07 chỉ thị kép).
+ Nhận dạng dòng 05: Vắng band 580bp mồi HB9 đồng thời có band 400bp mồi 17899B ; Vắng band 580bp mồi HB9 đồng thời có band 400bp mồi UBC 856C ;
Vắng band 580bp mồi HB9 đồng thời có band 540bp mồi 808 ; Vắng band 580bp mồi HB9 đồng thời vắng band 750bp mồi 17899B và Vắng band 580bp mồi HB9 đồng thời vắng band 1500bp mồi HB13 (chỉ có 05 chỉ thị kép).
+ Nhận dạng dòng Hải Triều 2: Vắng band 400bp mồi 17899B; Vắng band 400bp mồi UBC 856C ; Vắng band 540bp mồi 808 ; Có band 750bp mồi 17899B
và Có band 1500bp mồi HB13 (05 chỉ thị đơn); Có band 890bp mồi HB9 nhưng vắng band 700bp mồi 17899B ; Vắng band 280bp mồi UBC 873 nhưng có band 520bp mồi UBC 873 và Vắng band 280bp mồi UBC 873 nhưng có band 700bp mồi UBC 856T (03 chỉ thị kép).
Trang 25Kết quả
+ Nhận dạng dòng Hải Triều 1: Có band 790bp mồi HB14 đồng thời có
400bp mồi UBC 856C ; Có band 790bp mồi HB14 đồng thời có band
HB13 và Có band 500bp mồi 844B đồng thời vắng band 700bp mồi 17899B (chỉ có 06 chỉ thị kép).
+ Nhận dạng dòng 34: Có band 700bp mồi 17899B (01 chỉ thị đơn); Có band 890bp mồi HB9 đồng thời có band 400bp mồi 17899B ; Có band 890bp mồi HB9 đồng thời có band 400bp mồi UBC 856C ; Có band
HB9 đồng thời vắng band 750bp mồi 17899B; Có band 890bp mồi HB9 đồng thời vắng band 1500bp mồi HB13 và Có band 500bp mồi 844B đồng thời có band 890bp mồi HB9 nhưng có band 400bp mồi 17899B/ band 400bp mồi UBC 856C/ band 540bp mồi 808 hoặc vắng band 750bp mồi 17899B/ band 1500bp mồi HB13 (06 chỉ thị kép).
+ Nhận dạng dòng 36: Có band 220bp mồi HB9 (chỉ có 01 chỉ thị đơn)
Trang 26Kết luận
Đã khảo sát tình hình canh tác các dòng bơ bản địa tại Lâm Đồng, ghi nhận đặc điểm 11 dòng quan trọng chủ yếu dựa trên đặc điểm quả và năng suất Tuy nhiên dữ liệu thu nhận được chỉ là sơ bộ để hỗ trợ xây dựng bộ dữ liệu về đặc điểm dòng/ giống ở cây trưởng thành.
Đã xác lập được 9 chỉ thị đơn và 25 chỉ thị kép để nhận dạng 06 dòng
bơ tiềm năng được khảo sát Cả 6 dòng đều xác lập được chỉ thị ISSR để nhận dạng Kết quả này có thể ứng dụng được cho việc nhận dạng các dòng
bơ ngay tại vườn ươm.
Mức độ đa dạng di truyền của 11 dòng bơ được khảo sát thấp: mức dị hợp trông đợi đạt 0.3072, chỉ số Shannon đạt: 0.4608, tỷ lệ band đa hình: 91.84% Điều đó cho thấy các dòng bơ được tạo giống và qua tuyển chọn tại Lâm Đồng có nguồn gốc gần nhau.
Kiến nghị
Cần tiến hành nghiên cứu thêm với nhiều mồi ISSR và các kỹ thuật DNA fingerprinting khác để có bộ dữ liệu tốt, dễ ứng dụng hơn trong thực tiễn công tác kiểm tra giống, đặc biệt là giống vườn ươm.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ