HIỂN VI HỌC ĐẠI CƯƠNG

Hiển vi quang học Light Microscopy  Hiển vi quang học đại cương o Các bộ phận cơ bản của kính hiển vi o Ba thông số hiển vi quang học cơ bản o Phân loại kính hiển vi quang học  Kí

Trang 1

HIỂN VI HỌC ĐẠI CƯƠNG

(Basics in Microscopy)

Phạm Q Hùng Application Specialist Carl Zeiss SEA

Trang 2

Giới thiệu về Carl Zeiss?

• Lịch sử thành lập lâu đời (tiên phong)

• Sản phẩm kính hiển vi Carl Zeiss được sử dụng rộng rãi, nhất là tại các lab hàng đầu thế giới

1846 Carl Zeiss thành lập xưởng cơ khí chính xác và quang học tại Jena, Đức

1847 Bắt đầu sản xuất kính hiển vi

1866 Hợp tác giữa Ernst Abbe và Carl Zeiss

1872 Học thuyết tạo ảnh hiển vi của Abbe giúp cải tiến chất lượng kính hiển

vi Mọi kính hiển vi từ cơ bản đến phức tạp đều dựa vào học thuyết

này

1900 - nay Phát triển thành công ty hàng đầu trong nghiên cứu và sản xuất thiết bị

quang học (bao gồm kính hiển vi quang học) và kính hiển vi tia X, kính hiển vi điện tử, với nhiều chi nhánh trên toàn thế giới

1996 Kỷ niệm 150 năm thành lập

Trang 3

Nội dung

1 Tổng quan về kính hiển vi Carl Zeiss

 Kính hiển vi quang học (Light Microscopes)

 Kính hiển vi tia X (X-ray Microscopes)

 Kính hiển vi điện tử (Electron Microscopes)

2 Hiển vi quang học (Light Microscopy)

 Hiển vi quang học đại cương

o Các bộ phận cơ bản của kính hiển vi

o Ba thông số hiển vi quang học cơ bản

o Phân loại kính hiển vi quang học

 Kính hiển vi phức hợp (Compound Microscopes)

o Các loại kính hiển vi phức hợp của Carl Zeiss

o Hai hệ dẫn quang trong kính hiển vi phức hợp

o Các phương pháp chỉnh tương phản trong kính hiển vi phức hợp

o Chụp, xử lí và phân tích hình ảnh hiển vi

 Kính hiển vi soi nổi (Stereo Microscopes)

3 Hiển vi tia X (X-ray Microscopy)

4 Hiển vi điện tử (Electron Microscopy)

Trang 4

Nội dung

Trang 5

Widefield Stereo

Confocal

Superresolution

Focused Ion Beam

Helium Ion Beam

Light Sheet

X-Ray

Scanning Electron

Tổng quan về kính hiển vi Carl Zeiss

Dãy sản phẩm với độ phân giải từ mức macro tới mức nguyên tử

KHV quang học (LM)

KHV điện tử (EM)

KHV tia X

(X-ray M)

Trang 6

Nội dung

Trang 7

Nội dung

Trang 8

Hiển vi quang học (Light Microscopy)

Đại cương – Các bộ phận cơ bản của kính hiển vi quang học (1)

Trang 9

Đại cương – Các bộ phận cơ bản của kính hiển vi quang học (2)

Trang 10

Đại cương - Ba thông số hiển vi quang học cơ bản

1 Độ phóng đại (magnification)

2 Độ phân giải (resolution)

3 Độ tương phản (contrast)

Trang 11

• Để quan sát một vật rất nhỏ bằng mắt thường, vật đó cần phải được phóng to lên một cỡ nhất định

Đại cương - Ba thông số hiển vi quang học cơ bản - Độ phóng đại

Trang 12

• Các chi tiết của mẫu vật phải được phân biệt dưới ảnh phóng đại

Đại cương - Ba thông số hiển vi quang học cơ bản - Độ phân giải

Trang 13

• Chi tiết của mẫu vật đã được phóng đại và phân giải phải hiển thị được trên nền ảnh

Đại cương - Ba thông số hiển vi quang học cơ bản - Độ tương phản

Trang 14

Độ phóng đại hữu dụng – Useful Magnification

• Chi tiết mẫu vật cần được phóng đại tới mức thích ứng với độ phân giải giới hạn của mắt thường (cỡ 200  400 µm)

Độ phóng đại hữu dụng (UM) = (500  1000) x N.A

– Phóng đại lớn hơn UM  phóng đại rỗng

– Phóng đại bé hơn UM  mắt thường không xem được

Trang 15

Độ phóng đại hữu dụng – Useful Magnification

Rỗng

Hữu dụng

Phóng đại:

Quá bé

Trang 16

Độ phân giải và chỉ số chiết quang

• Khoảng cách nhỏ nhất để phân biệt được hai chi tiết cạnh nhau

d 0

N.A = n*sinα

d0: khoảng cách tối thiểu để phân biệt

hai chi tiết gần nhau λ: bước sóng ánh sáng tới

N.A.: độ mở số (khẩu độ)

n: chỉ số chiết quang

α: góc mở

Trang 17

Độ phân giải và tụ quang

• Tăng độ phân giải bằng cách tăng

ứng (N.A.tụ quang và N.A.vật kính), vì vậy

tăng độ mở số tổng thể (N.A.effective)

– Chi tiết của mẫu vì vậy đạt độ phân

giải cao hơn

– Độ phân giải đạt tối đa khi:

N.A.tụ quang = N.A.vật kính

Trang 18

Độ phân giải tối đa (d 0 )

• L{ thuyết:

Dạng đơn giản hóa:

Ví dụ: ánh sáng lục  = 550 nm, N.A = 1,4 (môi trường dầu)

Trang 19

Giới hạn độ phân giải kính hiển vi

• Ảnh của một „cấu trúc dạng điểm“ thực tế không phải là một điểm, mà là

một hình mẫu (pattern) nhiễu trải rộng dần có giới hạn

• Hình mẫu 2 chiều  „đĩa Airy“ (Airy disc)

• Ảnh của „cấu trúc hàm trải điểm“  Point-Spread-Function (PSF)

Trang 20

• Độ phân giải đạt tới hạn khi hai „cấu trúc dạng điểm“ không thể phân biệt

được thành hai cấu trúc riêng biệt trên ảnh

• Khoảng cách giữa hai cấu trúc này gọi là giới hạn độ phân giải

Vật d vật = 1 µm Ảnh

Trang 21

Vật d vật = 0,9 µm Ảnh

Trang 22

Trang 23

Trang 24

Trang 25

Trang 26

Trang 27

d vật = 0,3 µm

Trang 28

Trang 29

Trang 30

Trang 31

Độ phân giải kính hiển vi



=

n NA

NA d



ZEISS

EC PlanNeoFluar 10x/0.3

resolution wavelength numerical aperture opening angle

Trang 32

Trang 37

Ảnh hưởng của bước sóng

Trang 38

Trang 39

Trang 40

Trang 41

Trang 42

Trang 43

Tương quan giữa độ phóng đại và độ mở số

Của một số vật kính

Loại

vật kính

Độ phóng đại

Môi trường (immersion)

Độ mở số (N.A.)

Khoảng cách làm việc (mm)

Trang 44

Độ phóng đại

Tương phản

cao

Trang 45

(darkfield)

mẫu vật mảnh, nhiễu xạ nhẹ

Tương phản trường sáng

(brightfield)

mẫu vật đa dạng

Tương phản giao thoa biệt hóa

khác nhau, chứa

trong đĩa nhựa

Trang 46

1. Màu kí tự trên vật kính  kĩ thuật tương

phản:

đen: chuẩn; đỏ: tương phản phân cực (Polarized) và giao thoa biệt hóa (DIC); lục: phản pha

2 Độ phóng đại / Độ mở số:

50x / 0,90

3 Viền màu biểu thị độ phóng đại

đen: 1,0x/1,25x; nâu: 2,5x ; đỏ 4x/5x; cam: 6,3x ; vàng: 10x ; lục: 16x/20x/25x/32x ; lam nhạt: 40x/50x ; lam sậm: 63x ; trắng:

100x/150x

4 Vòng hiệu chỉnh cơ:

môi trường lỏng; độ dày lam-men

5 Viền màu biểu thị chất lỏng phụ trợ:

đen: dầu; trắng: nước ; cam: gly-xê-rin ; đỏ:

đa dạng

Thông số trên vật kính

Trang 47

3 màu

4 màu (>7 màu by Zeiss, UV to IR)

>11 màu by Zeiss (UV to IR)

Hiệu chỉnh quang sai Loại vật kính

Trang 48

Nguồn sáng

• Đèn sợi đốt (incandescent lamps):

– Đèn tungsten-halogen (HAL)

• Đèn hồ quang (arc-discharge lamps): HBO, XBO, X-Cite

– Đèn thủy ngân (mecury: HBO)

– Đèn halogen kim loại (metal halide: XBO, X-Cite)

• Đèn LED (Light-Emitting Diode):

– Đèn LED thông thường

– Đèn LED Colibri

• Đèn lazer:

– Hệ thống LSM

Trang 49

Nguồn sáng

• Đèn sợi đốt (incandescent lamps):

– Đèn tungsten-halogen (HAL)

• Đèn hồ quang (arc-discharge lamps): HBO, XBO, X-Cite

– Đèn thủy ngân (mecury: HBO)

– Đèn halogen kim loại (metal halide: XBO, X-Cite)

• Đèn LED (Light-Emitting Diode):

– Đèn LED thông thường

– Đèn LED Colibri

• Đèn lazer:

– Hệ thống LSM

Trang 50

– Tuổi thọ đèn không cao (vài trăm giờ)

– Tính đồng nhất suy giảm theo tuổi bóng đèn

– Sinh nhiệt gây nóng

Trang 51

Nguồn sáng

Đèn hồ quang (arc-discharge lamps)

• Ưu điểm:

– Độ tin cậy cao

– Cường đô ánh sáng phát ra rất cao

– Sử dụng rộng rãi trong hiển vi huznh quang

• Nhược điểm:

– Đòi hỏi căn chỉnh khi lắp đặt

– Tuổi thọ đèn không cao

– Tính đồng nhất suy giảm theo không gian và tuổi bóng đèn – Đòi hỏi hộp đèn và nguồn điện chuyên biệt

– Nguy cơ nổ

– Chi phí vận hành cao

Trang 52

Nguồn sáng

Đèn LED (Light-Emitting Diodes)

• Chứa mọi đặc tính mong muốn mà đèn sợi đốt và hồ quang thiếu

– Tuổi thọ bóng đèn rất cao

– Tính đồng nhất cao theo thời gian và không gian

– Chi phí vận hành thấp

– Dễ dàng lắp đặt, sử dụng

• Khả năng cung cấp ánh sáng kích thích huznh quang ở bước sóng tối

ưu trong dãy cực tím (UV), phổ nhìn thấy (Vis) và phổ cận hồng ngoại (near IR):

– Phổ ánh sáng rộng hơn so với phổ ánh sáng cung cấp bởi đèn laser

• Không gây rung:

– Cơ chế bật/tắt không di chuyển

– Nhiệt sinh ra không đáng kể

Trang 53

Nội dung

Trang 54

Kính hiển vi soi nổi

Mẫu vật liệu tương đối lớn

Lát cắt mô trên lam Mẫx vật liệu nhỏ Chiều dày mẫu vật giới hạn

Tế bào sống trong đĩa Petri Chai nuôi cấy tế bào

Mẫu vật liệu dày, nặng

Đại cương – Phân loại kính hiển vi quang học

Trang 55

Nội dung

Trang 56

Nội dung

Trang 57

Upright Microscope

Primo Star

Zebrafish embryos Stained tissue sections Brain slices

Glass slide

Inverted Microscope

Living cells Petri dish Flask Well-plate

Primo Vert Axio Scope.A1

Đại cương – Các kiểu kính hiển vi phức hợp (1)

Trang 58

In vivo imaging

Đại cương – Các kiểu kính hiển vi phức hợp (2)

Trang 59

Tại sao phải đảo chiều?

Slide with tissue section

fixed, stained

cell culture flasks, multi-well plates

living cells, unstained

sometimes fluorescence labelled

Vấn đề???

Cách tiếp cận mẫu vật khác nhau, theo hướng khác nhau

specimen

Đại cương – Các kiểu kính hiển vi phức hợp – Thuận chiều và đảo chiều (1)

Trang 60

Tại sao phải đảo chiều?

mẫu vật

Trang 61

Khác biệt của kính hiển vi đảo chiều?

• Hướng chiếu sáng (illumination)

Trang 62

Nội dung

Trang 63

Kính hiển vi soi xuôi

(Axio Imager)

Kính hiển vi soi ngược

(Axio Observer)

Kính hiển vi phức hợp – Hai hệ dẫn quang trong kính hiển vi

Trang 64

Tia tới truyền qua

Transmitted Light (TL)

Tia tới phản xạ

Reflected Light (RL)

Đèn Halogen (HAL) Đèn Mercury (HBO) Đèn Metal halide (X-cite) Đèn LED huznh quang

Đèn Halogen (HAL) Đèn LED thông thường

Kính hiển vi phức hợp – Thấu quang và phản quang

Hệ phản quang

Hệ thấu quang

Định dạng
Số trang	100
Dung lượng	5,02 MB