Các phương pháp chỉnh tương phản trong kính hiển vi

Hiển vi quang học Light Microscopy Hiển vi quang học đại cương o Các bộ phận cơ bản của kính hiển vi o Ba thông số hiển vi quang học cơ bản o Phân loại kính hiển vi quang học Kính hiển

Trang 1

Nội dung

1 Tổng quan về kính hiển vi Carl Zeiss

Kính hiển vi quang học (Light Microscopes)

Kính hiển vi tia X (X-ray Microscopes)

Kính hiển vi điện tử (Electron Microscopes)

2 Hiển vi quang học (Light Microscopy)

Hiển vi quang học đại cương

o Các bộ phận cơ bản của kính hiển vi

o Ba thông số hiển vi quang học cơ bản

o Phân loại kính hiển vi quang học

Kính hiển vi phức hợp (Compound Microscopes)

o Các loại kính hiển vi phức hợp của Carl Zeiss

o Hai hệ dẫn quang trong kính hiển vi phức hợp

o Các phương pháp chỉnh tương phản trong kính hiển vi phức hợp

o Chụp, xử lí và phân tích hình ảnh hiển vi

Kính hiển vi soi nổi (Stereo Microscopes)

3 Hiển vi tia X (X-ray Microscopy)

4 Hiển vi điện tử (Electron Microscopy)

- Kỹ thuật chỉnh tương phản truyền thống, thường để quan sát các mẫu nhuộm

sinh học, mẫu vật liệu tự nhiên

- Ứng dụng ở cả hai hệ: thấu quang và phản quang

Thin section of bone - brightfield H&E staining of gastric mucosa - brightfield

Các phương pháp chỉnh tương phản

Trường sáng (Brightfield)

Trang 2

- Quan sát các cấu trúc nhỏ, ngay cả ở dưới mức giới hạn độ phân giải của kính.

- Ánh sáng chiếu trực tiếp bị chặn

- Chỉ ánh sáng tán xạ, khúc xạ được phép qua

- N.A của vật kính phải nhỏ hơn N.A

của tụ quang

- Đường dẫn quang phải sạch!

Diatom

Trường tối (Darkfield)

Polarizer 1

Specimen Interaction

Polarizer 2 (Analyzer)

- Quan sát các cấu trúc có tính lưỡng chiết quang (vd: tinh thể…)

- Mọi tia sáng đi qua kính phân cực thứ nhất (Polarizer 1) đều có cùng một hướng

- Kính phân cực 2 (Polarizer 2) triệt tiêu ánh sáng có hướng trùng với hướng tia sáng

đi qua Polarizer 1

- Chỉ những tia sáng bị đổi hướng khi đi qua mẫu vật mới được bộ cảm biến ghi lại

Phân cực (Polarization)

Trang 3

• Dr Frits Zernike, The Netherlands

1934 development, 1953 Nobel Prize

• Carl Zeiss, the first one produces commercial

Phase Contrast microscope

• Quan sát tế bào sống hoặc tế bào không

nhuộm

• Cấu trúc mẫu (tế bào) có chỉ số chiết quang cao

hơn môi trường giảm tốc độ đi qua của ảnh

sáng và làm nhiễu xạ

• Cấu trúc càng dày lệch pha càng rõ

• Mắt thường không thấy được sự lệch pha

• Ứng dụng chỉ ở hệ thấu quang

Typical phase shift

in living cells:

l/4

Phản pha (Phase Contrast)

Transmitted Light Contrasting Methods

- Light exhibits properties of waves

- Light Interference,

the addition (superposition) of two waves that results in a new wave pattern

wave1

wave2

+

180 degree phase shift

Trang 4

Phase Stop

Diffracted light

Retarded light

Phase Ring

condenser specimen objective

tube lens

- Biến đặc tính lệch pha ánh sáng thành đặc tính khác biệt mật độ quang

- Áp dụng trong quan sát mẫu mô mỏng, hay tế bào có cấu trúc mảnh, mẫu

không cần nhuộm

- Multi-well plate

- Flask

- Petri dish

Trang 5

microscopy.fsu.edu

Phase Stop

Phase Ring

Alignment (remove one of eyepieces)

Phản pha: hiệu chuẩn phase stop và phase ring.

• Tia sáng được tách thành 2 chùm sáng hẹp với dao

động điều hòa

• Hai chùm sáng đi qua mẫu vật độc lập nhau

• Ánh sáng hội tụ được so sánh:

– Nếu cả hai chùm sáng đi qua vùng mẫu có chỉ số

chiết quang tương tự nhau không tạo tương

phản

– Nếu cả hai chùm sáng đi qua vùng mẫu có chỉ số

chiết quang khác nhau tạo tương phản do có

sự thay đổi mật độ quang thông qua giao thoa

• Ứng dụng ở cả hai hệ: thấu quang và phản quang

Giao thoa biệt hóa (Differential Interference Contrast - DIC)

Trang 6

Polarizer &

DIC Prism

Analyzer DIC Prism

condenser specimen objective

tube lens

- Biến đặc tính khác biệt chỉ số chiết quang thành khác biệt mật độ quang

- Mẫu vật: dày, không nhuộm

Trang 7

Polarizer DIC Prism Condenser

Objective DIC Prism Objective

Analyzer

Specimen

Mouse kidney

• Kính đảo ngược

• Phối hợp tốt nhất với phản pha

• Quan sát tế bào nuôi/đặt trong đĩa nhựa

PlasDIC - Slider

Giao thoa biệt hóa Plastic (PlasDIC)

Trang 8

Page 79

Hiển vi huỳnh quang (Fluorescence Microscopy)

Page 80

Trạng thái kích động singlet Trạng thái kích động triplet

Biến đổi nội năng

Giao hệ

Hấp thu năng lượng HUỲNH QUANG

Biến đổi nội năng, ngoại năng

Hồi phục dao động

LÂN QUANG

Trạng thái nghỉ

Huỳnh quang: quá trình hồi phục bức xạ

Trang 9

Page 81

Đặc tính chất nhuộm huỳnh quang

(Fluorescence dyes)

Kích thích và ghi huỳnh quang

Trang 10

Page 83

Đèn thủy ngân

(50W 200W)

Hiển vi huỳnh quang

Nguồn sáng (illumination)

Page 84

Bộ phin lọc

(cho từng dải sáng huỳnh quang riêng biệt)

Bộ phin lọc (filter set)

Trang 11

Page 85 Phin lọc ánh sáng phát xạ

Kính tách sắc

Phin lọc ánh sáng kích thích

Mẫu huỳnh quang

Vật kính

Đèn hồ quang

Cảm biến hình ảnh Màn chập Màn chập

Trang 12

Page 87

Emission filter Excitation filter

Cảm biến

Ghi ảnh huỳnh quang Kích thích Mẫu vật

Mẫu vật

Nguồn sáng

Phân loại kính lọc ánh sáng

Page 88

Các bộ phin lọc ánh sáng

Bộ phin lọc số 01: DAPI

Bộ phin lọc số 09: GFP / FITC

Bộ phin lọc số 15: Rhodamine / DsRed

Trang 13

Page 89

Mẫu huỳnh quang

Mẫu huỳnh quang Cảm biến ảnh

Cảm biến ảnh

Đèn chiếu sáng Màn chập

Màn chập Màn chập Màn chập

Vật kính

Thiết kế trên-xuống

(upright)

Thiết kế dưới-lên

(inverted)

Đèn chiếu sáng

Đường dẫn quang

Nhân tế bào (DAPI)

Tế bào dương

tính GFAP

(Alexa 488)

Vật kính: Plan-Apochromat 20x/0.75

Tiêu bản mô não chuột

Nhuộm DAPI & Alexa Fluor 488

Trang 14

Page 91

Nhân tế bào (DAPI)

Tế bào cơ (Cy3)

Phản pha + huỳnh quang

Vật kính: EC Plan-Neofluar 20x/0.6 Ph

Tương phản DIC + huỳnh quang Vật kính: EC Plan-Neofluar 40x/0.75

Tiêu bản mô ruột non chuột

Nhuộm DAPI & Cy3

Page 92

Ưu điểm của ảnh huỳnh quang đa kênh tiêu sắc phức

Điểm hạn chế của ảnh huỳnh quang đa kênh

HBO

Hiệu chỉnh tiêu sắc phức

Kính tách ánh sáng Kính thu sáng

Mặt phẳng mẫu vật

Huỳnh quang tiêu sắc (apochromatic)

Trang 15

Page 93

Các phương pháp nhuộm huỳnh quang

eGFP, eCFP, eYFP, DsRed hoặc mCherry gắn vào bất cứ protein cần nghiên cứu

Gắn protein phát huỳnh quang (fluorescent

protein tagging)

Ca 2+ -imaging (Fura-2, Fluo-4, Calcium green),

pH imaging (SNARF-1, BCECF) Chất phát huỳnh quang đặc hiêu ion

Ti thể (Mitotracker red) Chất phát huỳnh quang phụ thuộc điện áp môi

trường

Màng tế bào (DiI), DNA, lưới nội chất , hệ lưới Golgi, ti thể

Chất phát huỳnh quang phụ thuộc tính chất lý

hóa của môi trường tế bào và các bào quan.

Endosomes, lysosomes, phagosomes.

Nhập bào huỳnh quang: các thể phát huỳnh

quang được đưa bào nhờ các cơ chế vận

chuyển của tế bào.

Các protein tế bào, các glycoprotein và cấu trúc polysaccharide bề mặt tế bào.

Huỳnh quang miễn dịch: sử dụng kháng thể

được gắn chất phát huỳnh quang.

Nhuộm gì?

Nguyên lý

Các phương pháp nhuộm huỳnh quang

Trang 16

Page 95

Các bộ kít nhuộm huỳnh quang

Nghiên cứu hình thái tế bào, sợi actin và

vi ống của các loại tế bào khác nhau

Adapted from Poster Presentation: "Simultaneous, Quantitative Monitoring of Cytoskeleton Rearrangement and Morphology Changes in Cells Using High Content Analysis " by Suk J Hong, Richik N Ghosh

Page 96

Một số ứng dụng kính hiển vi trong khoa học

nông nghiệp (Open discussion)

• Lai tạo và Chọn giống cây trồng

• Công nghệ sinh học nông nghiệp

• Thú ý và Chăn nuôi

• Bảo vệ thực vật

• (Video & Photo presentation)

Trang 17

We make it visible.

h.pham@zeiss.com.sg

Một số kính hiển vi Carl Zeiss

http://www.zeiss.com.sg

Trang 18

Các kiểu kính hiển vi soi nổi

Kính soi nổi thường

Stemi 2000 Stemi DV4

Các kiểu kính hiển vi soi nổi

Kính soi nổi dùng trong nghiên cứu

Định dạng
Số trang	18
Dung lượng	4,9 MB