Liệu pháp gen sử dụng Adenovirus

Nhóm 10:Sử dụng kháng thể đầy đủ kháng HER-2 đối với sự biểu hiện vượt mức của HER-2 trong tế bào ung thư trung gian qua liệu pháp gen sử dụng Adenovirus... Tế Bào Thượng Bì Và Thụ Thể H

Nhóm 10:

Sử dụng kháng thể đầy đủ kháng HER-2 đối với sự biểu hiện vượt mức của HER-2 trong tế bào ung thư trung gian qua liệu pháp gen sử dụng Adenovirus

Thành viên nhóm:

Phan Thị Phương Thanh: 0615114

Phan Thị Hồng Thanh: 0615113

Phan Thanh Hùng: 0515073

Vũ Đình Kỳ: 0615056

Lê Duy Lung: 0615239

Nguyễn Thị Thìn: 0615135

Nguyễn Đình Phú: 0615288

Lâm Hồng Tú: 0615343

Giáo Viên hướng dẩn:

Ths.Trần Hoàng Minh Tú

Cô Bùi Hoàng Bảo Ngọc

Nội Dung Bài Báo

HER-2 Là Gi?

HER-2 là thụ thể trên màng tế bào.

Thuộc nhóm thụ thể của yếu tố tăng trưởng.

Thụ thể của yếu tố tăng trưởng thượng bì – gọi là EGFR.

Bản chất là một glycoprotein xuyên màng.

Gen quy định thụ thể này nằm trên nhánh q của nhiễm sắc thể số 17.

Thúc đẩy tăng sinh, sinh mạch tế bào.

Tế Bào Thượng Bì Và Thụ Thể HER-2

Thụ Thể HER-2 trên màng tể bào

Mô hình tế bào và thụ thể HER-2

Mô hình sâm nhập của Adenovirus vào tế bào chủ

Nhóm 10: shptyd

Xây dựng Ad5-Tab Adenovirus tái

tổ hợp.

Nhóm 10: shptyd

Fig 1 Full-length trastuzumab antibody expression cassette using IRES

Schematic illustration of adenoviral vector pDC315 with expression cassette

inserteda t E1 region Antibody light andheavy chains, with separate signal peptide,are linkedb y IRES VL, variable region of light chain; CL, constant region of lightchain;VH, variable region of heavy chain; CH, constant region of heavy chain;

SP, signal peptide

Nguyên liệu

 Trastuzumab thương mại: một loại kháng thể đơn dòng đã

được thương mại hóa.

 Vector pDC315, pBGHE3.

 Protein tái tổ hợp Erb-2/Fc Chimera.

 Các loại kháng thể.

Các dòng tế bào

 HEK293: dòng tế bào thận phôi người.

 SKOV-3: tế bào ung thư buồng trứng người (HER-2+).

 BT549: tế bào bình thường (HER-2-).

 L-02: tế bào gan người bình thường.

Phương pháp và kết quả

Nội dung thí nghiệm

 Xem xét sự biểu hiện của kháng thể tạo bởi Ad5-Tab.

 Kiểm tra kích thước kháng thể tạo bởi Ad5-Tab.

 Kiểm tra sự kết hợp đặc hiệu của kháng thể.

 Kiểm tra ái lực của Ad5-Tab.

 Xét sự biểu hiện của kháng thể trong cơ thể chuột.

 Khả năng ức chế sự phát triển khối u của kháng thể.

Xét sự biểu hiện của kháng thể tạo bởi Ad5-Tab

Tế bào L-02 có chứa vector Ad5-Tab

 Tế bào L-02 cho vào môi trường 10%huyết thanh thai bò.

 Ủ trong lò ủ ẩm (t=24h, t 0 =370C, CO2=5%).

 Chuyển tế bào vào môi trường không huyết thanh.

 Tế bào được làm nhiễm với Ad5-Tab có nồng độ cao.

Tế bào L-02 có chứa vector Ad5-Tab

 Sau 2h, chuyển tế bào vào môi trường 5% huyết thanh thai bò.

 Thu hoạch các tế bào nổi (vào ngày thứ 3 và thứ 7).

 Kháng thể đơn dòng mAb anti-human IgG1 chuột làm bất động

kháng thể tạo ra do Ad5-Tab.

 mAb tiếp hợp với horseradish-peroxidase.

 Đọc bằng Microplate reader với bước sóng 450nm.

Sơ đồ

Kháng thể tạo ra từ Ad5-Tab (trong tế bào L-02).

mAb horseradish-peroxidase

Nhóm 10: shptyd

Fig 2 In vitro antibody expression in Ad5-TAb -infected L-02 cells.The L-02 cells were infectedw ith Ad5-TAb at a multiplicity of infection of 10 Cell culture supernatants were harvestedat different time points after

infection for protein analysis A, ELISA analysis of supernatants of Ad-TAb

- infected L-02 cells

Kết Quả

Kiểm tra kích thước kháng thể tạo bởi Ad5-Tab

Western Blot

 Các tế bào: dịch nổi, huyết thanh chuột, trastuzumab thương mại

điện di trên SDS-PAGE 12%.

 Ở điều kiện khử và không.

 Chuyển protein trên gel polyacrylamid lên màng nitrocellulose.

 Dò với goat anti-human IgG1 (H+L) polyclonal (gắn với

horseradish peroxidase).

Các bản sao kháng thể dê kháng IgG1 người.

Kháng thể thỏ kháng IgG dê

Horseradish peroxidase

Huyết thanh chuột, Trastuzumab, Ad5-Tab

X-RAY chemiluminescent

Nhóm 10: shptyd

Fig 3 Columns, mean; bars, SD.Western blot analysis of commercial trastuzumab and supernatants from Ad5-TAb – or Ad5-LacZ - infected L-02 cells under nonreducing (B) and reducing (C) conditions

Kiểm tra sự kết hợp đặc hiệu của kháng thể.

 Rửa SKOV-3 và BT549 bằng PBS ba lần.

 Cố định bằng paraformaldehid 4% (5 phút).

 ủ với dịch nổi hoặc trastuzumab (40C, 2h).

 Kháng thể thỏ kháng IgG người tiếp hợp với FITC.

 Quan sát tế bào được đánh dấu dưới kính hiển vi huỳnh

quang.

Nhóm 10: shptyd

Fig 4 Specific binding of HER-2 antibody expressed

trastuzumab was usedas

control Immunofluorescent microscopy analysis for the specific binding of anti-

HER-2 antibody to HER-2 A to

B, BT549 incubatedw ith

supernatant and trastuzumab, respectively C to D, SKOV-3incubatedw ith trastuzumab and culture supernatant, respectively.

Kiểm tra ái lực của Ad5-Tab

 Cho 100 µl HER-2 vào các đĩa ELISA.

 Ủ 15h ở 40C, cố định bằng sữa khô không béo 5%.

 Trộn với protein HER-2 trong albumin huyết thanh bò 1% Ủ trong 1h ở 200C.

 Chuyển vào đĩa ELISA.

 Cho Horseradish peroxidase vào.

 3,3’-diaminobenzidine nhận màu của peroxidase.

 Đọc bằng Microplate reader ở bước sóng 450nm.

 A0/(A0-A)= 1+ (KD/a0).

Nhóm 10: shptyd

Fig 5 Affinity constant of anti-HER-2 antibody Indirect ELISA was applied forestimation of the antibody binding capacity.The proper working concentration ofanti-HER-2 antibody were shown to be in the range of 1 ×10- 5to 5.0 ×10- 5 mg/

mL, andt hen 2.5 × 10- 5 mg/mL was appliedf or the determination of affinityconstant Straight slope is the affinity constant of the antibody.

Xét sự biểu hiện của kháng thể trong cơ thể chuột.

 Tiêm tế bào SKOV-3 vào chuột.

 Chuột đã được tiêm Ad5-Tab thông qua đường tĩnh mạch.

 10 con chuột được lấy máu ở các thời điểm khác nhau.

Nhóm 10: shptyd

Fig 6 Anti-HER-2 antibody expression level in the serum of SKOV-3-inoculatednudemice Ad5-TAbwas given through the tail vein at the dose of 2 × 109

plaque-forming units per mouse at early stage.Mice were bleda t days 3, 7, 10, 14,

21, 28, and3 5, and then serum antibody concentrations were determined by

indirect ELISA on HER2-coated 96-well plates and detected with horseradishperoxidase - conjugated mouse anti-human IgGmonoclonal antibody Points,

mean (ng/mL); bars, SD.Ten mice were analyzeda t each time point

Khả năng ức chế sự phát triển khối u của kháng thể.

 Thí nghiệm 1: điều trị sau khi tiêm SKOV-3 ba ngày.

 Thí nghiệm 2: điều trị sau khi tiêm SKOV-3 16 ngày

 Có 2 nhóm: Nhóm 1 được tiêm Ad5-Tab

Nhóm 2 (đối chứng)được tiêm Ad5-LacZ.

 So sánh thể tích khối u chữa trị bời 2 phương pháp và giữa 2 thí

nghiệm.

Nhóm 10: shptyd

Fig 7 Antitumor activity of Ad5-TAb -generated anti-HER-2 antibody via gene transfer in tumor-burdened nude mice A, early stage with smaller size (˜20mm3) B, late stage with large size (˜200 mm3).

Nhóm 10: shptyd

 Đơn giản và có hiệu quả hơn phương pháp protein kháng thể

truyền thống.

 Mở ra hướng mới để điều trị ung thư và các bệnh khác.

 Tuy nhiên đây chỉ mới là thử nghiệm ban đầu, cần phải nghiên

cứu thêm.

 Hiệu quả chữa trị tốt nhất ở giai đoạn còn sớm.

Nhóm 10: shptyd