TCVN 6401:1998

4.2 Phân lập và nhận dạng sơ bộ Cấy từ mẫu thử trong môi trường tăng sinh 4.1 vào môi trường phân lập, nuôi ấm ở 37C và sau 48 h kiểm tra sự có mặt các khuẩn lạc được coi là Listeria spp

TCVN TIEU CHUAN VIET NAM

TCVN 6401 : 1998 ISO 10560 : 1993 (E)

gm

SUA VA CAC SAN PHAM SỮA -

PHAT HIEN LISTERIA MONOCYTOGEN

Milk and milk products — Detection of Listeria monocytogenes

om

HA NOI — 1998

TCVN 6401 : 1998 hoàn toàn tương đương với ISO 10560 : 1993 (E)

TCVN 6401 : 1998 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F12 Sữa và sản

phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn - Đo lường - Chất lượng đề nghị,

Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi trường ban hành

Phát hiện Listeria monocytogen

Milk anc milk products — Detection of Listeria monocytogenes

Tiéu chuan nay qui dinh phuong phap phat hién Listeria monocytogens trong stra va san phẩm sữa

2_ Tiêu chuẩn trích dân

TCVN 6404: 1998 (ISC 7218:1997) Vi sinh vật học - Nguyên tắc chung về kiểm tra vi sinh vật

TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261:1989) Sữa và sản phẩm sữa - Chuẩn bị mẫu thử và các dung dịch pha loãng để kiểm tra vi sinh vật

3 Định nghĩa

Áp dụng định nghĩa sau đây trong tiêu chuẩn này :

¢ Listeria spp : Cac vi sinh vat tao thanh cac khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường đặc chọn lọc và

cho thấy rõ các đặc tính hình thái học, sinh lý học và sinh hoá như mô tả, khi tiến hành thử theo tiêu

Nhìn chung việc phái hiện Listeria spp đòi hỏi ít nhất ba giai đoạn liên tục như trong 4.1 đến 4.5 Xem

thêm: se đồ qui trinF thử trong hình 7

4.1 Tăng sinh trong môi trường lỏng chọn lọc

Cấy phần mẫu thử vào môi trường chọn lọc và nuôi ấm ở 30°C trong 48 h

4.2 Phân lập và nhận dạng sơ bộ

Cấy từ mẫu thử trong môi trường tăng sinh (4.1) vào môi trường phân lập, nuôi ấm ở 37C và sau 48 h

kiểm tra sự có mặt các khuẩn lạc được coi là Listeria spp giả định theo dáng vẻ bên ngoài

5.2 Môi trường nuôi cấy

5.2.1 Môi trường chọn lọc: Môi trường tăng sinh

5.2.1.1 Môi trường cơ bản

5.2.1.1.1 Thành phần

Cao men : 6g Nước : † 000 ml

1) Thành phần của canh thang đậu tương : Tripton (thuỷ phân pancratic từ casein ) : 17g Soyton (thuỷ phân papaic từ bột đậu tương): 3g

© Dextroza : 2,59

Natri clorua : 5g Dikali photphat : 259

Phân phối từng lượng 225 ml vào các bình thí nghiệm dung tích 500 ml (hoặc các bội số của 225 mi vào

các bình thí nghiệm có dung tích thích hợp) Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực (6.1.1.2) ở 121°C

Hoatan acrifiavin hidrociorua trong nước Khử trùng qua lọc

Chú thích ¡ - Về chỉ tiết kỹ thuật khử trùng bằng cách lọc, có thể tham khảo bất kỳ tài liệu nàc thích hợp

về vị sinh vật học

Hoa tan xicloheximid trong hỗn hợp etanola/nước Khử trùng qua lọc

5.2.1.5 Môi trường hoàn chỉnh

Bảo quản riêng môi trường cơ bản (5.2.1.1) và các phần bổ sung đã chuẩn bị (từ 5.2.1.2 đến 5.2.1.4 )

chỗ tối ở nhiệt độ từ 2°C đến 5”C Chuẩn bị môi trường hoàn chỉnh bằng cách thêm : 1 mi của phần bổ

sung 1; 2 mi của phần bổ sung 2 và 2 ml của phần bổ sung 3 vào 225 mi môi trường cơ bản (5.2.1.1)

Chú thích 2 — Khi cần có thể sử dụng các bình thí nghiệm có dung tích thích hợp khác, như các bội số tương ứng với 1 mi, 2ml và 225 mi

5.2.2 Môi trường phân lập (thạch Oxford)

5.2.2.1 Môi trường thạch cơ bản

5.2.2.2 Phần bổ sung cho 500 mì mơi trường trên

5.2.2.2.1 Thanh phan

Xicloheximid : 200 mg Colistin sunfat : 10 mg

Xefotetan : † mg

Fosfomixin : Etanola : Nước :

5meg 2,5 ml

2,5 mi

5.2.2.2.2 Chuan bi

Hồ tan các thành phần rắn trong hỗn hợp etanola/nước Khử trùng qua lọc

5.2.2.3 Chuẩn bị mơi trường hồn chỉnh

MA Lấy 500 ml mơi trường thạch cơ ban (5.2.2.1) Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực (6.1.1.2) ở nhiệt

độ 121 °c Lam nguội tới 50°C va bằng thao tác vơ trùng thêm phần bổ sung (5.2.2.2) Độ pH của mơi

trường cuối cùng này phải là 7,0 ở 25°C

Phân phối mơi trường vào các đĩa Petri vơ trùng với các lượng khoảng 15 ml và để cho đơng lại

5.2.3 Mợtrường nuơi cấy đặc : Thạch cao men tripton đậu tương (TSYEA)

Hồ tan các thành phần hoặc mơi trường hồn chỉnh khơ trong nước bang cach đun sơi

Nếu cần, chỉnh pH để sau khi khử trùng pH là 7,3 ở nhiệt độ 25°G

Phân phối các lượng khoảng 6 ml mơi trường nuơi cấy đặc vào các ống nghiệm (6.2.2)

Khử trùng các ống nghiệm này 15 phút trong nồi hấp áp lực (6.1.1.2) ở nhiệt độ 121 °Q

Đặi các ống ở tư thế nghiêng

Để chuẩn bị các đĩa thạch, khử trùng môi trường nuôi cấy đặc trong các bình hoặc các chai có dung tích

thích hợp Phân phối môi trường này khi chúng vẫn còn lỏng theo các lượng khoảng 15 mi vào các đĩa

Petri vô trùng và để cho đông lại

5.2.4 Môi trường nuôi cấy lỏng : canh thang cao men tripton đậu tương (TSYEB)

5.2.4.1 Thành phần

Thành phần của môi trường này như qui định trong 5.2.1.1.1 Sử dụng 6 g cao men

5.2.4.2 Chuan bi

Chuẩn bị môi trường nay theo 5.2.1.1.2

Phân phối theo các lượng khoảng 6 mi vào các ống nghiệm trước khi khử trùng trong nồi hấp áp lực

Thach (tuy theo cường độ gel của thạch): 12g-18 g

5.2.5.2 Chuẩn bị

Hoà tan môi trường thạch máu khô trong nước bằng cách đun sôi

Nếu cần, chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0, ở nhiệt độ 25°C Phân phối môi trường vào các

ống nghiệm hoặc các bình thí nghiệm dung tích không quá 500 ml

Khử trùng thạch máu 15 phút trong nồi hấp áp luc (6.1.1.2) 6 121°C

Làm nguội môi trường này tới 45°C Bổ sung máu đã loại tơ huyết và lắc đều

Phân phối mó: :rường thec các lượng khoảng 20 ml vào céc đĩc Petr: vô trùng và để cho đồng lại

Để chuẩn bị các đĩa thạch, khử trùng môi trường nuôi cấy đặc trong các bình hoặc các chai có dung tích

thích hợp Phân phối môi trường này khi chúng vấn còn lỏng theo các lượng khoảng 15 ml vào các đĩa

Petri vô trùng và để cho đông lại

5.2.4 Môi trường nuôi cấy lỏng : canh thang cao men tripton đậu tương (TSYEB)

5.2.4.1 Thành phần

Thành phần của môi trường này như qui định trong 5.2.1.1.1 Sử dụng 6 g cao men

5.2.4.2 Chuan bj

Chuẩn bị môi trường nay theo 5.2.1.1.2

Phân phối theo các lượng khoảng 6 ml vào các ống nghiệm trước khi khử trùng trong nồi hấp áp lực

Thạch (tuỳ theo cường độ gel của thạch): 12g-18 g

5.2.5.2 Chuẩn bị

Hoà tan môi trường thạch máu khô trong nước bằng cách đun sôi

Nếu cần, chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0, ở nhiét dé 25°C Phan phối môi trường vào các

ống nghiệm hoặc các bình thí nghiệm dung tích không quá 500 mi

Khử trùng thạch máu 15 phút trong nồi hấp áp lực (6.1.1.2) 6 121°C

Làm nguội môi trường này tới 45°C Bổ sung máu đã loại tơ huyết và lắc đều

Phân phối mô: trường theo các lượng khoáng 2C ml vào cao die Petri vô trùng và để cho đông lại

5.2.6 Canh thang có hidrat cacbon

5.2.6.1 Môi trường cơ bản

Pepton proteoza : 10g Bromocresol do tia : 0,02 9 Cao thit bo : 1g Nước : 1000 mi Natri clorua : 5g

5.2.6.1.2 Chuan bi

Hoà tan các thành phần trên trong nước bang cách đun sôi

Nếu cần, chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 6,8, ở nhiệt độ 25C

Phân phối môi trường này vào các ống nghiệm theo các lượng sao cho sau khi khử trùng còn lại 9 mi

Khử trùng thạch máu 15 phút trong nồi hấp áp lực (6.1.1.2) ở 121°C

5.2.6.2 Các dung dich hidrat cacbon

f 26.2.2 Chuẩn bị

Hoa tan riéng tung hidrat cacbon trong 100 mi nước Khử trùng qua loc

5.2.6.3 Méi trường hoàn chỉnh

Đối với mỗi loại hidrat cacbon, bằng thao tác vô trùng thêm 1 mi dung dịch (5.2.6.2) vào 9 ml môi trường

cơ bản (5.2.6.1) Nếu các thể tích môi trường cơ bản chuẩn bị nhỏ hơn, thì thêm các thể tích dung dịch

hidrat cacbon tương ứng nhỏ hơn

5.2.7.2 Chuan bi

Hoà tan các thành phần trên trong nước bằng cách đun sôi

Nếu cần, chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,3 , ở nhiệt độ 25°C

Phân phối môi trường này vào các ống nghiệm theo các lượng khoảng 5 mI

_ Hoa tan môi trường cơ bản khô trong nước bằng.cách-đun-sôis-——-————— - —- -

Nếu cần, chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0, ở nhiệt độ 25°C

Phân phổi môi trường cơ bản này vào các lọ hoặc bình với lượng khoảng 100 ml

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực (6.1.1.2) ở 121°C Lam nguội tới 45°C -

5.2.8.2 Môi trường máu

5.2.8.2.1 Thanh phan

Môi trường cơ bản (5.2.8.1): 100 ml

Máu ngựa hoặc máu cừu đã loại tơ huyết: 7 ml

5.2.8.2.2 Chuan bi

Thêm máu đã loại tơ huyết vào môi trường cơ bản tan chảy đã khử trùng (5.2.8.1)

5.2.8.3 Môi trường hoàn chỉnh

Phân phối môi trường cơ bản (5.2.8.1) vào các đĩa Petri vô trùng với các lượng khoảng 10 mi và để cho đông lại Rót vào mỗi đĩa một lớp rất mỏng môi trường máu (5.2.8.2), không quá 3 mi

16

Để yên cho đông lại Nếu như máu rót vào dia có chứa môi trường cơ bản đã chuẩn bị từ trước, thì có

thể phải làm ấm 20 phút trong tủ ấm, để ở 37 °C trước khi rót sang lớp máu

Làm khô các đĩa trước khi sử dụng

5.2.8.4 Chat cay phan ung CAMP

Ching Staphylococcus aureus lam tan mau 6 yéu (thi du nhu NCTC 1803) va chung Rhodococcus equi (thí dụ như NCTC1621) cần phải thử CAMP Không phải tất cả các chủng Staphylococcus aureus đều

a1 Dung dich hidro peroxit, 3% (V/V)

6 Thiét bi va dung cu thuy tinh

Chú ý - Khử trùng tất cả các thiết bị, dụng cụ tiếp xúc với môi trường nuôi cấy, dịch pha loãng

hoặc mẫu thử, trừ khi các thiết bị, dụng cụ đã vô trùng sẵn (các dụng cụ bằng chất dẻo)

6.1 Thiết bị

Sứ dụng các thiết bị thí nghiệm vi sinh thông thường và các dụng cụ đặc biệt sau:

6.1.1 Thiết bị để khử trùng khô (tủ sấy) hoặc thiết bị để khử trùng ướt (nỗi hấp áp lực) (xem

TCVN 6263 : 1997)

6.1.1.1 Tủ sấy, có thể duy trì nhiệt độ 6 173°C + 3°C

`, 1.2 N6i hap ap luc, c6 thé duy trì nhiệt độ ở 121°C + 190

Có thể sử dụng một trong các thiết bị sau đây:

a)_ máy trộn quay, vận hành với tốc độ từ 8 000 vòng / phút đến 45 000 vòng / phút, có cốc đựng

bằng thuỷ tỉnh hoặc bằng kim loại có nắp chịu được các điều kiện khử trùng; hoặc

b`_ mé+' trồn kiểu nhu động (stomacher, „ = i có cac túi bằng chế: dec vo vung «

Chú thích 4 - Cốc hoặc túi bàng chất dẻo phải có đủ dung tích để trộn mẫu với lượng chất pha loãng thích hợp Nói chung thể tích của vật chứa phải gấp đôi thể tích của mẫu thử cộng với chất pha loãng 6.1.7 Que cấy bằng hợp chất platin/iridin, niken/crom, hoặc nhựa, có đường kính vòng cấy khoảng 3mm 6.1.E Kim cấy bằng hợp chất platin / iridin, niken/crom, hoặc nhựa

tới + 0.1 đơn vị pH ở nhiệt độ 25°C

dén + 5°C

6.1.11 Nguồn tia sáng trắng

6.1.12_ Gương phẳng hoặc gương hình lòng chảo

6.1.13 Gia ba chan, để chiếu sang dia Petri

6.1.14 Kinh hién vi déi pha, cé vat kinh soi dau

6.2 Dụng cụ thuỷ tỉnh

Tất cả các dụng cụ thuỷ tỉnh phải bền khi khử trùng nhiều lần

6.2.1 Bình thuỷ tinh, để khử trùng và bảo quản môi trường nuôi cấy và nuôi ấm môi trường lỏng

6.2.3 Ống đong, để chuẩn bị môi trường hoàn chỉnh

6.2.4 Pipet chia độ, có dung tích 25 mi, 10 ml và 1 mi, được chia vạch 0,5 ml và 0,1 mI

6.2.5 Đĩa Petri vô trùng

6.2.6 Phiên kính soi tiêu bản

6.2.7 Bi thuỷ tinh

7 Lấy mẫu

Điều quan trọng là phòng thí nghiệm nhận được mẫu đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc bị

biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này Nên tiến hành lấy mẫu theo TCVN 6400 : 1998 (ISO 707)

Cần phải tuân theo các hướng dẫn về lấy mẫu để kiểm tra vi sinh vật

_ Gủ the gùng ông nghiệm cé nắp đẹy làm, bằng tnuỷ tỉnh

thử không lâu quá 3 phút

8.2 Sữa bột, bột của dịch tách ra khi sản xuất phomát và bơ, lactoza, casein và caseinat

Trộn kỹ lượng chứa trong lọ kín bằng cách lắc và đảo chiều liên tục Nếu mẫu thử đựng trong lọ kín còn

nguyên, quá đầy nên khó lắc trộn, thì chuyển sang lọ chứa to hơn và trộn đều

83 Bo

ram tan chảy mẫu thử trong một lọ vô trùng, đặt vào nồi cách thuy (6.1.5) 6 45°C Lac lo mẫu trong khi

làm tan chảy và lấy ngay lọ đựng mẫu ra khỏi nồi cách thuỷ khi mẫu vừa tan hết

8.4 Phomat

Thông thường mẫu thí nghiệm bao gồm phần thịt và phần cùi Các bên liên quan thoả thuận với nhau về

các phần được coi là mẫu thử

Tiên hành theo qui định trong 9.1.5

8.5 Kem lạnh thực phẩm

Tiến hành như trong trường hợp đối với bơ (8.3) nhưng sử dụng nồi cách thuỷ (6.1.5) ở nhiệt độ dưới

37C, vì mẫu thử không được phép để quá nhiệt độ này

8.6 Sữa lên men, sữa chua, custard và các món tráng miệng

rộn kỹ lượng chứa trong lọ kín bằng cách lắc và đảo chiều liên tục, hoặc mở lọ và trộn lượng chứa bên

trong bảng thìa hoặc dao trộn vô trùng

9 Cách tiến hành

Đối với các điểm chú ý về an toàn, xem phụ lục A và hình 1

9.1 Cấy vào môi trường tăng sinh

Chú thích 5 - Để giảm bớt khối lượng công việc khi có nhiều phần mẫu thử 25 g lấy để kiểm tra từ 1 lô

sữa hoặc các sản phẩm sữa nhất định, và khi có cơ bản cho thấy là việc hợp nhất (gộp chung các phần

mẫu thử) sẽ không làm ảnh hưởng đến kết quả của mẫu sữa kiểm tra thì có thể gộp chung các phần mẫu thử trên lại Thí dụ: nếu có 10 phần x 25 g được lấy kiểm tra, thì gộp 10 đơn vị này lại thành "1 phần mẫu

thử" hợp nhất 250 g và hoà tan hoặc khuếch tán vào 2.25 | môi trường tăng sinh

Cho phần mẫu thử vàc mô: trường tăng sinh (5.2.1) thee aui định trong 6.:.: đến ©.1.7