Báo cáo nghiên cứu khoa học cấp trường: Hoàn thiện quy trình sản xuất rượu vang nếp trắng bằng enzyme và nấm men thuần chủng

Nội dung chính của báo cáo trình bày để cải thiện công nghệ sản xuất rượu nếp, nâng cao chất lượng sản phẩm, cũng như dễ dàng để kiểm soát dây chuyền chế biến đặc biệt là trong giai đoạn dịch hóa, đường hóa, thủy phân protein và lên men. Mời các bạn tham khảo!

KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ THỦY SẢN TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH

NGUYỄN HOÀNG ANH

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME AMYLASE, PROTEASE VÀ NẤM MEN THUẦN CHỦNG TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG NẾP

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

TRÀ VINH - 2010

LỜI CẢM TẠ

Đề tài nghiên cứu được hoàn thành tại Trung tâm Công nghệ sau thu hoạch, Khoa

Nông nghiệp và Thủy sản, Trường Đại học Trà Vinh và Bộ môn Công nghệ thực

phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến:

Ban Giám Hiệu Trường Đại học Trà Vinh, Phòng Khoa học công nghệ và đào tạo sau

đại học, Ban lãnh đạo Khoa Nông Nghiệp & Thủy Sản, Trung tâm Thí nghiệm, Trung

tâm Công nghệ sau thu hoạch đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ, hỗ trợ tôi hoàn thành

nghiên cứu

Thầy Nguyễn Công Hà đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp tôi vượt qua mọi khó

khăn để thực hiện và hoàn chỉnh nội dung nghiên cứu

Qúy Thầy, Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt khóa học và các Cán bộ

phòng thí nghiệm Trung tâm Thí nghiệm, bộ môn Công nghệ Thực phẩm đã tạo điều

kiện thuận lợi giúp tôi thực hiện đề tài

Quý Thầy, Cô trong Hội đồng báo cáo nghiệm thu đề tài, đặc biệt là Giáo viên phản

biện đã đọc và đóng góp ý kiến quí báo để nghiên cứu được hoàn chỉnh

Cảm ơn quý Thầy, Cô Trung tâm Công nghệ sau thu hoạch đã đóng góp ý kiến, thảo

luận và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện thí nghiệm

Xin chân thành cảm ơn!

Trà vinh, ngày 4 tháng 09 năm 2010

Nguyễn Hoàng Anh

TÓM TẮT

Ở Việt Nam, rượu nếp chủ yếu sản xuất theo lối thủ công với chất lượng sản phẩm

không ổn định Đến nay, phương pháp truyền thống vẫn là phương pháp chủ yếu để

sản xuất rượu mặc dù vẫn còn giới hạn do thời gian sản xuất kéo dài, khó kiểm soát

chất lượng của sản phẩm cuối Trong nghiên cứu: “Hoàn thiện quy trình sản xuất

rượu vang nếp trắng bằng enzyme và nấm men thuần chủng” được thực hiện để

cải thiện công nghệ sản xuất rượu nếp, nâng cao chất lượng sản phẩm, cũng như dễ

dàng để kiểm soát dây chuyền chế biến đặc biệt là trong giai đoạn dịch hóa, đường

hóa, thủy phân protein và lên men Vì vậy, những ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, nồng

độ enzyme, tỉ lệ cơ chất và thời gian thủy phân đến hoạt tính các loại enzyme

α-amylase, glucoamylase thủy phân tinh bột để tạo ra đường khử và papain hoặc

bromelain thủy phân protein để tăng thêm acid amin tự do cho nấm men phát triển

sinh khối và chuyển hóa thành rượu làm tăng hiệu suất lên men trong quy trình sản

xuất đã được nghiên cứu Kết quả nghiên cứu cho thấy đã xác định điều kiện tối ưu

cho 4 loại enzyme trên với nguyên liệu nếp trắng khi sử dụng α-amylase 0,3%, 31

phút tại pH 6,5, nhiệt độ 870C để thủy phân tinh bột nếp, nồng độ đường khử thu được

khoảng 6,46% và khi sử dụng tiếp glucoamylase 0,6%, 39 phút ở nhiệt độ 610C, pH

4,0 hàm lượng đường khử sinh ra lên đến 16,10% Tiếp theo sử dụng papain với nồng

độ 0,35%, thời gian thủy phân 45 phút ở pH 5,9, nhiệt độ 500C thu được hàm lượng

nitơ amin 0,081%, cùng các thông số động học Vmax= 0,1065 ± 0,0036; km= 4,7822 ±

0,7705 hoặc bromelain nồng độ là 0,5%, 55 phút tại pH 5,7, nhiệt độ 550C lượng nitơ

amin thu được 0,054 % cùng các thông số động học Vmax= 0,0622 ± 0,0013; km=

3,5652 ± 0,4280 Dịch nếp sau khi thủy phân được lọc, điều chỉnh pH 4,9 và lên men

với nấm men Saccharomyces cerevisiae 0,2%, sản phẩm rượu vang được so sánh rượu

lên men theo phương pháp truyền thống sử dụng bánh men thuốc bắc Kết quả chỉ ra

rằng việc ứng dụng các enzyme thủy phân tinh bột, protein và nấm men thuần chủng

trong quy trình sản xuất rượu vang nếp trắng có thể giảm thời gian lên men chính còn

6 ngày, tăng độ rượu tạo thành đến 12,6% và sẽ đảm bảo các chỉ tiêu hóa lí, vi sinh

theo TCVN 7045: 2009, từng bước cải thiện quy trình sản xuất truyền thống theo

phương pháp cổ truyền, có thể sản xuất công nghiệp tạo ra rượu đạt chất lượng cảm

quan cao và đảm bảo an toàn về mặt vệ sinh thực phẩm

Từ khóa: rượu vang nếp, α–amylase, glucoamylase, dịch hóa, đường hóa, papain, bromelain,

saccharomyces cerevisiae, bánh men thuốc bắc, lên men rượu

ABSTRACT

In Vietnam, glutinous rice wine has mainly manufactured by manual work and the

quality is not settled Up to now, traditional method is still the main method to

produce rice wine even though they have a limitation due to taking time for

production, difficult to control the quality of final product In this study: “The

improvement of white glutinous rice wine production using hydrolysis enzymes

and purebred yeast” was used to improving technological production line of

glutinous rice wine, make the quality of product better as well as make easy to control

processing line especially during liquefaction, saccharification, protein hydrolysis and

alcoholic fermentation stage Therefore, the effect of pH, temperature, enzyme

concentration, substrate ratio and the time of activation on the activity of four kinds of

commercial enzyme α-amylase, glucoamylase hydrolyze starch to make

transformation of glucose and papain or bromelain hydrolyze protein to increases the

content of amin acid for the yeast to develop biomass and transform into wine, to

increase the fermentation performance of glutinous rice wine were done The results

showed that optimum conditions four kinds of enzyme were studied directly to white

glutinous rice material established When using α-amylase 0.3%, 31 minutes at pH 6.5

and 870C to hydrolyze raw material glutinous rice starch, transformation of glucose

was established about 6.46%, and when using glucoamylase 0.6%, 39 minutes at pH

4.0 and 610C directly to glutinous rice material, transformation of glucose was

produced upto 16.10 % Next, using papain to hydrolyze protein of glutinous rice raw

material with 0.35% concentration, hydrolysis time 45 minutes at pH 5.9, temperature

500C, nitrogen amin produced content 0.081%, kinetic parameters of papain on

glutinous rice starch was Vmax= 0.1065 ± 0.0036; km= 4.7822 ± 0.7705 or using

bromelain with 0.5%, 55 minutes at pH 5.7 and 550C, nitrogen amin produced

0.054%, kinetic parameters of bromelain with substrate as protein of glutinous rice

was calculated as Vmax= 0.0622 ± 0.0013; km= 3.5652 ± 0.4280 Finally, glutinous rice

solution after hydrolysis, filter, adjustment of pH 4.9 are fermented with yeast

Saccharomyces cerevisiae 0.2%, wine product fermented compared to product is wine

fermented in a traditional method using alcoholic starter Results indicated that the

application of α-amylase, glucoamylase, bromelain and purebred yeast of glutinous

rice wine making can reduce the time for alcohol fermentation shorter 6 days, higher

alcohol level up to 12.6% and will ensure physical-chemical and microorganism

standard criteria TCVN7045: 2009, step by step improving traditional glutinous rice

wine production for industrial production and high-quality sensory produce, hygienic

and safe

Keyword: glutinous rice wine, α-amylase, glucoamylase, liquefaction, saccharification,

papain, bromelain, alcoholic starter, Saccharomyces cerevisiae, alcoholic fermentation.

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ i

TÓM TẮT ii

ABSTRACT iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH BẢNG xi

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 1

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Nguồn nguyên liệu sản xuất rượu 3

2.2 Enzyme amylase 4

2.2.1 Enzyme α-amylase (EC 3.2.1.1) 4

2.2.2 Enzyme glucoamylase (EC 3.2.1.3) 7

2.2.3 Hoạt lực của enzyme amylase 8

2.3 Enzyme papain (EC 3.4.22.2) 13

2.3.1 Cấu tạo của enzyme papain 13

2.3.2 Hoạt tính của enzyme papain 13

2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme papain 14

2.4 Enzyme bromelain (EC 3.4.22.32) 16

2.4.1 Cấu tạo của enzyme bromelain 16

2.4.2 Hoạt tính enzyme bromelain 17

2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme bromelain 17

2.5 Nấm men 18

2.5.1 Cấu tạo và thành phần của nấm men 18

2.5.2 Sự sinh trưởng và phát triển của nấm men 19

2.5.3 Nấm men sử dụng trong sản xuất rượu vang 19

2.6 Bánh men thuốc bắc 21

2.7 Các quá trình chính trong sản xuất rượu vang nếp 22

2.7.1 Quá trình hồ hóa tinh bột 22

2.7.2 Quá trình đường hóa trong sản xuất rượu vang nếp 23

2.7.3 Quá trình lên men trong sản xuất rượu vang nếp 23

2.7.4 Cơ chế của quá trình lên men rượu 24

2.7.5 Các giai đoạn của quá trình lên men rượu 25

2.7.6 Cơ chế chuyển hóa đường thành rượu 25

2.7.7 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men rượu 26

2.8 Sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu 27 2.8.1 Sự tạo thành methalnol 28

2.8.2 Sự tạo thành aldehyde 28

2.8.3 Sự tạo thành các rượu bậc cao 28

2.8.4 Sự tạo thành các acid hữu cơ 29

2.8.5 Sự tạo thành các ester 29

2.8.6 Sự tạo thành furfurol 29

2.9 Quy trình sản xuất rượu vang nếp 30

2.9.1 Sơ đồ quy trình 30

2.9.2 Thuyết minh quy trình 31

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 3.1 Phương tiện nghiên cứu 32

3.1.1 Thời gian và địa điểm 32

3.1.2 Nguyên vật liệu 32

3.1.3 Hóa chất 32

3.1.4 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 32

3.2 Phương pháp nghiên cứu 34

3.2.1 Phương pháp lấy mẫu 34

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu 34

3.2.3 Phương pháp phân tích 34

3.3 Nội dung và bố trí thí nghiệm 35

3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ứng dụng enzyme α-amylase trong quá

trình dịch hóa và đường hóa một phần bột nếp trắng 35

3.3.1.1 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme

α-amylase trong quá trình thủy phân bột nếp 35

3.3.1.2 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme α-amylase

và thời gian thủy phân bột nếp 36

3.3.1.3 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ bột nếp đến hoạt

tính của enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân 37

3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ứng dụng enzyme glucoamylase trong

quá trình đường hóa dịch nếp trắng 37

3.3.2.1 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme

glucoamylase trong thủy phân dịch nếp 37

3.3.2.2 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme

glucoamylase và thời gian thủy phân dịch nếp trắng 38

3.3.2.3 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ bột nếp đến hoạt

tính của enzyme glucoamylase trong quá trình thủy phân 39

3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát động học và ứng dụng enzyme papain

thủy phân protein dịch nếp sau khi dịch hóa và đường hóa bằng α- amylase

và glucoamylase 39

3.3.3.1 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme

papain trong quá trình thủy phân protein nếp 40

3.3.3.2 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme papain và

thời gian thủy phân protein nếp 40

3.3.3.3 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ bột nếp đến hoạt

tính enzyme papain trong quá trình thủy phân protein nếp 41

3.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát động học và ứng dụng enzyme bromelain

thủy phân protein dịch nếp sau khi dịch hóa và đường hóa bằng α- amylase

và glucoamylase 42

3.3.4.1 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme

bromelain trong quá trình thủy phân protein nếp 42

3.3.4.2 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme bromelain

và thời gian thủy phân protein nếp 42

3.3.4.3 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ bột nếp đến hoạt

tính enzyme bromelain trong quá trình thủy phân protein nếp 43

3.3.5 Thí nghiệm 5: Theo dõi, so sánh, đánh giá chất lượng sản phẩm

rượu lên men truyền thống sử dụng men thuốc bắc và rượu sử dụng enzyme

với nấm men thuần chủng trong giai đoạn lên men chính và ổn định 44

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46

4.1 Thành phần chính nguyên liệu nếp trắng 46

4.2 Kết quả khảo sát ứng dụng enzyme α-amylase trong quá trình

dịch hóa và đường hóa một phần bột nếp trắng 46

4.2.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme α-amylase trong

quá trình thủy phân bột nếp trắng 46

4.2.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme α-amylase và thời gian thủy

phân bột nếp 49

4.2.3 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ bột nếp đến hoạt tính của

enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân 51

4.3 Kết quả khảo sát ứng dụng enzyme glucoamylase trong quá trình

đường hóa dịch nếp trắng 52

4.3.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme glucoamylase

trong thủy phân dịch nếp trắng 53

4.3.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian

thủy phân dịch nếp trắng 55

4.3.3 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ bột nếp đến hoạt tính của

enzyme glucoamylase trong quá trình thủy phân 57

4.4 Kết quả khảo sát động học và ứng dụng enzyme papain thủy

phân protein dịch nếp sau khi dịch hóa và đường hóa bằng α-amylase

và glucoamylase 58

4.4.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme papain trong quá

trình thủy phân protein nếp 59

4.4.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme papain và thời gian thủy

phân protein nếp 60

4.4.3 Kết quả ảnh hưởng nồng độ bột nếp đến hoạt tính enzyme papain

trong quá trình thủy phân protein nếp 62

4.5 Kết quả khảo sát động học và ứng dụng enzyme bromelain thủy

phân protein dịch nếp sau khi dịch hóa và đường hóa bằng α- amylase

và glucoamylase 64

4.5.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme bromelain trong

quá trình thủy phân protein nếp 64

4.5.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme bromelain và thời gian thủy

phân protein dịch nếp 66

4.5.3 Kết quả ảnh hưởng nồng độ bột nếp đến hoạt tính enzyme

bromelain trong quá trình thủy phân protein nếp 68

4.6 Kết quả theo dõi, so sánh, đánh giá chất lượng sản phẩm rượu

lên men truyền thống sử dụng men thuốc bắc và rượu sử dụng enzyme

với nấm men thuần chủng trong giai đoạn lên men chính và ổn định 70

4.6.1 Kết quả thay đổi độ Brix trong quá trình lên men chính các loại

rượu nếp 71

4.6.2 Kết quả thay đổi hàm lượng đường khử trong quá trình lên men

chính các loại rượu nếp 72

4.6.3 Kết quả thay đổi độ rượu tạo thành trong quá trình lên men

chính của các loại rượu nếp 74

4.6.4 Kết quả thay đổi pH trong quá trình lên men chính của các loại

rượu nếp 75

4.6.5 Kết quả thay đổi hàm lượng acid tổng trong quá trình lên men

chính của các loại rượu nếp 77

4.6.6 Kết quả thay đổi hàm lượng ester trong quá trình lên men chính

của các loại rượu nếp 79

4.6.7 Kết quả định tính fufurol trong quá trình lên men chính của các

4.6.10 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hóa lí sản phẩm rượu sử dụng

bánh men thuốc bắc và rượu sử dụng enzyme amylase, bromelain, nấm men

so với TCVN 7045:2009 83

4.6.11 Kết quả phân tích các chỉ tiêu vi sinh sản phẩm rượu sử dụng bánh men thuốc bắc và rượu sử dụng enzyme amylase, bromelain, nấm men so với TCVN 7045:2009 84

CHƯƠNG 5 KẾT QUẢ THỰC TẾ NGHIÊN CỨU, KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG VÀ ĐỊA CHỈ ÁP DỤNG, GIÁ THÀNH SẢN PHẨM 85

5 1 Thực tế nghiên cứu so với bố trí thí nghiệm theo thuyết minh phê duyệt 85

5 2 Khả năng ứng dụng và địa chỉ áp dụng 86

5.3 Hạch toán giá thành 1 lít rượu vang nếp sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm 86

6.1 Kết luận 87

6.2 Đề nghị 89

TÀI LIỆU THAM KHẢO 90

PHỤ LỤC I

KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU Ở TRUNG TÂM PHÂN

TÍCH THÍ NGHIỆM, SỞ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ, TP.HCM.

DANH SÁCH KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam

HTX: Hợp tác xã

DNTN SXTM: Doanh nghiệp tư nhân sản xuất thương mại

TP.HCM: Thành phố Hồ Chí Minh

Sở KH&CN: Sở Khoa Học và Công Nghệ

w/w (weight/weight): tỉ lệ khối lượng trên khối lượng

w/v (weight/volume): tỉ lệ khối lượng trên thể tích

v/v (volume/volume): tỉ lệ thể tích trên thể tích

KPH: Không phát hiện

TB: Rượu nếp sử dụng bánh men thuốc bắc để lên men

ĐC: Rượu nếp sử dụng enzyme α-amylase, glucoamylase và bổ sung nấm men thuần

chủng để lên men

PA: Rượu nếp sử dụng enzyme α-amylase, glucoamylase, papain và bổ sung nấm men

thuần chủng để lên men

BR: Rượu nếp sử dụng enzyme α-amylase, glucoamylase, bromelain và bổ sung nấm

men thuần chủng để lên men

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần hóa học của nếp trắng 3

Bảng 2.2 Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau 5

Bảng 2.3 Khả năng chịu nhiệt của α-amylase từ các nguồn sản xuất khác nhau 5

Bảng 2.4 Thành phần hóa học của tế bào nấm men 19

Bảng 2.5 Tiêu chuẩn chất lượng bánh men giống 22

Bảng 4.1 Thành phần chính của nguyên liệu nếp trắng 46

Bảng 4.2 Kết quả ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng đường khử tạo thành khi thủy phân tinh bột nếp bằng enzyme α-amylase 47

Bảng 4.3 Kết quả ảnh hưởng nồng độ α-amylase và thời gian thủy phân tinh bột nếp đến lượng đường khử tạo thành 49

Bảng 4.4 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ bột nếp đến lượng đường khử tạo thành khi thủy phân bằng enzyme α-amylase 51

Bảng 4.5 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ đến lượng đường khử sinh ra khi thủy phân dịch nếp bằng enzyme glucoamylase 53

Bảng 4.6 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy phân dịch nếp đến lượng đường khử sinh ra 55

Bảng 4.7 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ bột nếp đến lượng đường khử sinh ra khi thủy phân bằng enzyme glucoamylase 57

Bảng 4.8 Kết quả ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân protein trong dịch nếp bằng enzyme papain 59

Bảng 4.9 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme papain và thời gian đến lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân protein trong dịch nếp trắng 61

Bảng 4.10 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các tỉ lệ bột nếp trắng đến hoạt tính enzyme papain 63

Bảng 4.11 Hàm lượng acid amin tự do trong dịch nếp trắng thu được sau khi thủy phân protein bằng enzyme papain 64

Bảng 4.12 Kết quả ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng nitơ amin sinh ra khi thủy phân dịch nếp bằng enzyme bromelain 65

Bảng 4.13 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ enzyme bromelain và thời gian đến lượng nitơ amin sinh ra khi thủy phân protein trong dịch nếp trắng 67

Bảng 4.14 Kết quả ảnh hưởng của các tỉ lệ bột nếp trắng đến hoạt tính của

enzyme bromelain 69

Bảng 4.15 Hàm lượng acid amin tự do trong dịch nếp trắng thu được sau khi thủy phân protein bằng enzyme bromelain 70

Bảng 4.16 Kết quả thay đổi độ Brix trong quá trình lên men chính của các loại rượu 71

Bảng 4.17 Kết quả thay đổi hàm lượng đường khử trong quá trình lên men chính của các loại rượu 73

Bảng 4.18 Kết quả thay đổi độ rượu trong quá trình lên men chính của các loại rượu 74

Bảng 4.19 Kết quả thay đổi pH trong quá trình lên men chính của các loại rượu 76

Bảng 4.20 Kết quả thay đổi hàm lượng acid trong quá trình lên men chính của các loại rượu 78

Bảng 4.21 Kết quả thay đổi hàm lượng ester trong quá trình lên men chính của các loại rượu 79

Bảng 4.22 Chỉ tiêu chất lượng hóa lí các sản phẩm rượu vang nếp sau 1 tháng 81

Bảng 4.23 Chỉ tiêu chất lượng hóa lí các sản phẩm rượu vang nếp sau 2 tháng 81

Bảng 4.24 Chỉ tiêu chất lượng hóa lí các sản phẩm rượu vang nếp sau 3 tháng 82

Bảng 4.25 Kết quả đánh giá chất lượng cảm quan của các sản phẩm rượu vang nếp (TCVN 3217-79) 82

Bảng 4.26 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hóa lí trong sản phẩm rượu TB và BR so với TCVN7045: 2009 83

Bảng 4.27 Kết quả phân tích các chỉ tiêu vi sinh trong sản phẩm rượu TB và BR so với TCVN7045: 2009 84

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Hạt nếp trắng 3

Hình 2.2 Cơ chế tác dụng của enzyme amylase lên phân tử tinh bột 4

Hình 2.3 Cấu trúc không gian của enzyme α-amylase 6

Hình 2.4 Tác dụng của α-amylase lên phân tử amylose và amylpectin 6

Hình 2.5 Cấu trúc không gian của enzyme glucoamylase 7

Hình 2.6 Tác dụng của glucoamylase lên phân tử tinh bột 7

Hình 2.7 Đồ thị Michaelis-Menten 10

Hình 2.8 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến thời gian phản ứng của amylase 10

Hình 2.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng của enzyme amylase 11

Hình 2.10 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme amylase 11

Hình 2.11 Cấu trúc không gian của enzyme papain 13

Hình 2.12 Cấu trúc không gian của enzyme bromelain 16

Hình 2.13 Quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào nấm men 19

Hình 2.14 Nấm men Saccharomyces cerevisae 20

Hình 2.15 Men thuốc bắc Hải Anh Quang 22

Hình 2.16 Quá trình trao đổi chất tế bào nấm men phụ thuộc hiện diện Oxy có thể hô hấp hiếu khí hoặc lên men yếm khí 24

Hình 2.17 Sơ đồ đường phân trong tế bào nấm men 26

Hình 2.18 Sơ đồ tổng quát của quá trình hình thành sản phẩm phụ 28

Hình 2.19 Sơ đồ quy trình sản xuất dự kiến 4 loại rượu vang nếp 30

Hình 3.1 Máy nghiền nguyên liệu 33

Hình 3.2 Máy đo pH 33

Hình 3.3 Cân phân tích 33

Hình 3.4 Chiết quang kế 33

Hình 3.5 Chuẩn độ đường 33

Hình 3.6 Nấm men 33

Hình 3.7 Nếp trắng 33

Hình 3.8 Water bath 33

Hình 3.9 Máy chuẩn độ điện thế 33

Hình 4.1 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng đường khử

tạo thành khi thủy phân bột nếp bằng enzyme α-amylase 47

Hình 4.2 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến

lượng đường khử tạo thành 49

Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ α-amylase và thời gian thủy

phân bột nếp đến lượng đường khử tạo thành 50

Hình 4.4 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme

α-amylase và thời gian thủy phân đến lượng đường khử tạo thành 51

Hình 4.5 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng tỉ lệ bột nếp đến lượng đường khử tạo

thành khi thủy phân bằng enzyme α-amylase 52

Hình 4.6 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hàm lượng

đường khử sinh ra khi thủy phân dịch nếp với enzyme glucoamylase 54

Hình 4.7 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến

hàm lượng đường khử sinh ra khi thủy phân dịch nếp với enzyme

glucoamylase 55

Hình 4.8 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ glucoamylase và thời gian

thuỷ phân dịch nếp đến lượng đường khử sinh ra 56

Hình 4.9 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme

glucoamylase và thời gian thủy phân dịch nếp đến lượng đường khử tạo thành 57

Hình 4.10 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng tỉ lệ bột nếp đến lượng đường khử sinh

ra khi thủy phân với enzyme glucoamylase 58

Hình 4.11 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hàm lượng nitơ

amin tạo thành khi thủy phân protein dịch nếp bằng enzyme papain 59

Hình 4.12 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến

lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân protein dịch nếp với enzyme papain 60

Hình 4.13 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme papain và thời

gian đến hàm lượng nitơ amin tạo khi thủy phân protein dịch nếp trắng 61

Hình 4.14 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme

papain và thời gian thủy phân protein dịch nếp đến lượng nitơ amin tạo thành 62

Hình 4.15 Đồ thị Michaelis- Menten biểu diễn ảnh hưởng tỉ lệ cơ chất nếp sử

dụng đến hoạt tính enzyme papain 63

Hình 4.16 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng nitơ amin

sinh ra khi thủy phân dịch nếp bằng enzyme bromelain 65

Hình 4.17 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến

hàm lượng nitơ amin sinh ra khi thủy phân protein dịch nếp với bromelain 66

Hình 4.18 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme bromelain và thời

gian đến hàm lượng nitơ amin sinh ra khi thủy phân protein dịch nếp trắng 67

Hình 4.19 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme

bromelain và thời gian thủy phân đến lượng nitơ amin sinh ra 68

Hình 4.20 Đồ thị Michaelis- Menten biểu diễn ảnh hưởng tỉ lệ cơ chất nếp đến

hoạt tính bromelain 69

Hình 4.21 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ Brix theo thời gian lên men chính

của các loại ruợu 72

Hình 4.22 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng đường khử theo thời gian

lên men chính của các loại ruợu 73

Hình 4.23 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ rượu theo thời gian lên men chính

của các loại rượu 75

Hình 4.24 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi pH theo thời gian lên men chính của

các loại rượu 77

Hình 4.25 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi acid tổng theo thời gian lên men chính

của các loại rượu 78

Hình 4.26 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi ester theo thời gian lên men chính của

các loại rượu 80

Hình 4.27 Các sản phẩm rượu vang nếp trắng 84

Hình 5.1 Quy trình sản xuất 4 loại rượu vang nếp trắng 86

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Rượu vang là loại thức uống được lên men từ nhiều nguồn liệu: nho, khóm, chuối,

nếp… mang đậm đà bản sắc văn hóa dân tộc của từng địa phương Từ xưa đến nay,

rượu thường xuất hiện trong các lễ hội, đình đám, các cuộc gặp gỡ của người thân,

bạn bè Rượu được sử dụng với nhiều mục đích ý nghĩa khác nhau như để chúc mừng,

nâng cao sức khỏe hay để giải bày tâm sự… Rượu trở thành một trong những thức

uống không thể thiếu trong văn hóa ẩm thực cũng như trong đời sống hằng ngày

Ngày nay với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, nhiều sản phẩm lên

men truyền thống đã được nghiên cứu sâu về mặt quy trình sản xuất, hiện nay ở các

nước trong khu vực đã nghiên cứu, cải tiến thành công chất lượng rượu cổ truyền và

được áp dụng sản xuất với qui mô công nghiệp, phân phối rộng rãi trên thế giới như

rượu Sakê của Nhật, rượu Mao Đài của Trung Quốc, rượu Shochu ở Hàn Quốc Ở

Việt Nam thức uống lên men truyền thống cũng rất đa dạng từ: rượu nho, rượu Cần ở

các dân tộc miền núi Tây Nguyên đến rượu nếp của người Kinh, nhiều địa phương đã

sản xuất các loại rượu nổi tiếng như rượu Làng Vân ở miền Bắc và rượu Gò Đen, Phú

Lễ, Xuân Thạnh ở miền Nam được nhiều người ưa chuộng Trong các loại rượu cổ

truyền kể trên thì rượu nếp là một loại khá đặc biệt, sản phẩm là kết quả của quá trình

lên men từ những hạt nếp mà thành

Tuy nhiên, phương pháp sản xuất rượu ở một số địa phương vẫn còn theo phương

pháp cổ truyền, tức là quá trình đường hóa và lên men được thực hiện bởi nấm mốc và

nấm men trong bánh men thuốc bắc và thiết bị sản xuất thô sơ, nên năng suất chưa cao

và chất lượng chưa an toàn vì chứa nhiều độc tố, tạp chất ảnh hưởng đến sức khỏe

người tiêu dùng Do đó, để nâng cao hơn nữa chất lượng sản phẩm truyền thống này

chúng tôi đề ra quy trình sản xuất rượu theo phương pháp mới, thông qua kết hợp hài

hòa giữa công nghệ cổ truyền và kỹ thuật hiện đại Với việc ứng dụng phương pháp

enzyme và nấm men thuần chủng ở giai đoạn đường hóa, thủy phân protein và lên

men để rút ngắn thời gian sản xuất cũng như ổn định được chi phí sản xuất, đảm bảo

chất lượng và an toàn vệ sinh thực phẩm của sản phẩm rượu vang nếp

Từ những lý do trên việc nghiên cứu “Hoàn thiện quy trình sản xuất rượu vang

nếp trắng bằng enzyme và nấm men thuần chủng” có ý nghĩa rất quan trọng

1.2 Mục tiêu của đề tài

Xây dựng qui trình sản xuất rượu nếp sạch theo tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm

TCVN 7045: 2009

Cải thiện quy trình sản xuất rượu nếp truyền thống theo phương pháp cổ truyền có thể

sản xuất công nghiệp và cho ra sản phẩm chất lượng cao và an toàn về mặt vệ sinh

thực phẩm

1.3 Nội dung nghiên cứu

Từ những mục tiêu trên, đề tài tiến hành các khảo sát sau:

- Khảo sát ứng dụng enzyme α-amylase trong quá trình dịch hóa và đường hóa một

phần hồ tinh bột nếp trắng

- Khảo sát ứng dụng enzyme glucoamylase trong quá trình đường hóa dịch nếp trắng

- Khảo sát động học và ứng dụng enzyme papain trong quá trình thủy phân protein của

dịch nếp trắng

- Khảo sát động học và ứng dụng enzyme bromelain trong quá trình thủy phân protein

của dịch nếp trắng

- Theo dõi, so sánh, đánh giá chất lượng sản phẩm rượu lên men truyền thống sử dụng

men thuốc bắc và rượu sử dụng enzyme với nấm men thuần chủng trong giai đoạn lên

men chính và ổn định

- Đánh giá chất lượng sản phẩm (cảm quan, hóa lí và vi sinh vật)

- Phân tích kết quả và tìm ra qui trình sản xuất tối ưu cho sản phẩm rượu vang nếp

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Nguồn nguyên liệu sản xuất rượu

Tên khoa học của nếp là Oryza Sativa thuộc nhóm ngũ cốc, là loại nguyên liệu chứa

tinh bột rất cao phù hợp với công nghệ lên men, trong đó nếp trắng với hàm lượng

tinh bột lên đến hơn 70%, vì vậy nếp trắng được sử dụng rộng rãi trong công nghệ sản

xuất rượu

Hình 2.1 Hạt nếp trắng

Trong tinh bột bao gồm hai thành phần: amylose và amylopectin, 2 cấu tử này khác

hẳn về tính chất hoá học và tính chất vật lý Phân tử amylose tạo màu xanh với iod

còn amylopectin cho m àu tím đỏ, amylose và amylopectin cũng khác nhau về tính

hoà tan, amylose dễ hoà tan trong nước ấm và tạo nên dung dịch có độ nhớt không

cao, còn amylopectin chỉ hoà tan khi đun nóng và tạo nên dung dịch có độ nhớt

cao Trong phân tử tinh bột tỉ lệ giữa amylose và amylopectin thay đổi tuỳ thuộc

vào nguồn nguyên liệu, trong hạt gạo chủ yếu là amylose, còn trong hạt nếp là

+ Amylose có trọng lượng phân tử từ 50.000 ÷ 160.000, được cấu tạo từ 200 ÷

1.000 phân tử D-glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,4 glycoside tạo thành mạch

xoắn dài không phân nhánh

+ Amylopectin có trọng lượng phân tử khoảng 400.000, được cấu tạo từ 600 ÷

6.000 phân tử D-glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,4 glycoside và α-1,6

glycoside tạo thành mạch phân nhánh

2.2 Enzyme amylase

Enzyme amylase là một trong số các hệ enzyme được sử dụng rộng rãi trong công

nghiệp, y học, thực phẩm và nhiều lĩnh vực khác, amylase thuộc nhóm enzyme thủy

phân, xúc tác sự phân giải các liên kết glycoside nội phân tử trong các

polysaccharides Enzyme amylase sẽ thủy phân tinh bột, glycogen và các dextrin

mạch dài thành glucose, maltose và dextrin mạch ngắn

Dựa vào đặc tính và cơ chế tác dụng lên phân tử tinh bột của enzyme amylase, người

ta phân biệt chia enzyme amylase thành hai nhóm:

- Endoamylase (enzyme nội phân): gồm α-amylase và nhóm enzyme khử mạch nhánh

- Exoamylase (enzyme ngoại phân): gồm có β-amylase, γ-amylase (glucoamylase)

Hình 2.2 Cơ chế tác dụng của enzyme amylase lên phân tử tinh bột

2.2.1 Enzyme α-amylase (EC 3.2.1.1)

Đặc tính: Enzyme α-amylase dễ tan trong nước, các dung dịch muối và rượu loãng

Protein của các α-amylase có tính acid yếu Protein của α-amylase từ các nguồn sản

xuất có thành phần amino acid khác nhau Điều kiện hoạt động và độ bền của các

enzyme α-amylase tùy thuộc vào nguồn chiết suất

Bảng 2.2 Điều kiện hoạt động của enzyme α-amylase từ các nguồn khác nhau

Nguồn gốc pH tối thích Nhiệt độ tối thích ( 0 C)

(Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2004)

Ion Ca2+ là một trong những thành phần quan trọng tham gia vào việc hình thành và

ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme α-amylase, đồng thời nó còn có vai trò duy trì sự

tồn tại của enzyme α-amylase khi bị tác động của các tác nhân gây biến tính và tác

động của các enzyme thủy phân protein, nếu α-amylase bị mất ion Ca2+ thì nó hoàn

toàn bị mất khả năng thủy phân cơ chất Enzyme α-amylase được hoạt hóa bởi các ion

đơn hóa trị như: Cl- > Br- > I- Đồng thời chúng bị kìm hãm bởi ion kim loại nặng

như: Cu2+, Hg2+ (Shahina Naz, 2002).

Enzyme α-amylase kém bền trong môi trường acid nhưng khá bền ở môi trường nhiệt

Bảng 2.3 Khả năng chịu nhiệt của α-amylase từ các nguồn sản xuất khác nhau

Enzyme α-amylase có khả năng phân cắt liên kết 1,4 α-glycoside ở bất kỳ vị trí

nào trên mạch tinh bột đã được hồ hóa Do đó, enzyme này được gọi là enzyme nội

Giai đoạn đường hóa: Các oligosaccharides lại tiếp tục bị phân cắt tạo thành

maltotriose, maltose Sau thời gian tác dụng dài, sản phẩm của quá trình thủy phân

α-amylase là 13% glucose và 87% maltose Tác dụng của enzyme α-α-amylase trên

amylopectin cũng xảy ra tương tự và sản phẩm được tạo thành là 72% maltose và 19%

glucose, ngoài ra còn có các dextrin phân tử thấp và isomaltose (8%) do α-amylase

không cắt được liên kết 1, 6-glycoside ở mạch nhánh của phân tử amylopectin

Đề tài nghiên cứu sẽ đề cập đến việc sử dụng Chế phẩm enzyme Termamyl 120L:

ở dạng lỏng, chứa enzyme có khả năng chịu nhiệt ổn định α-amylase, được sản xuất từ

một chủng loại vi sinh vật chọn lọc tên là Bacillus licheniformis Enzyme α-amylase

nội bào phân cắt các liên kết α-1, 4-glucoside nằm ở bên trong phân tử cho ra dextrin

và các oligosaccharides

Hình 2.4 Tác dụng của α-amylase lên phân tử amylose và amylopectin

Trong dịch tinh bột hòa tan Termamyl 120L có hoạt tính 120 KNU/g (Kilo Novo

α-amylase unit) Hoạt tính có thể bị hủy bằng xử lý nhiệt dung dịch ở pH thấp Sản

phẩm này không dễ bắt lửa, tan hoàn toàn trong nước và an toàn khi sử dụng theo như

chỉ dẫn, sản phẩm Termamyl 120L có thể gây dị ứng đối với người nhạy cảm (Novo

Nordisk, 2007)

2.2.2 Enzyme glucoamylase (EC 3.2.1.3)

Đặc tính: Glucoamylase là một exoamylase, còn được gọi là γ-amylase

amyloglucosidae, có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột (Shahina Naz, 2002)

So với β-amylase, γ-amylase bền với acid hơn nhưng lại kém bền dưới tác dụng của

ethylic, acetone, không bền với ion Cu2+, Hg2+… Glucoamylase có trong nấm mốc và

một vài loại vi khuẩn, hoạt động tốt ở 500C, hoạt lực tối đa trong vùng pH: 4,5 ÷ 5,5

Cơ chế tác dụng lên mạch amylose và amylopectin

Enzyme γ-amylase có khả năng xúc tác thủy phân cả liên kết α-1,4 và 1,6 glycoside

trong tinh bột, glycogen, polysaccharides, là enzyme ngoại phân (exo enzyme)

Enzyme glucoamylase thủy phân polysaccharides từ đầu không khử tuần tự từng gốc

glucose một nhưng không thủy phân được các dextrin vòng (Lý Nguyễn Bình, 1997)

Hình 2.5 Cấu trúc không gian của enzyme glucoamylase

Khi phân cắt phân tử tinh bột, cùng với việc tạo thành phân tử glucose còn có thể tạo

thành oligosaccharides, ngoài ra γ-amylase có thể phân cắt cả liên kết α-1,2 và 1,3

glycoside(Nguyễn Đức Lượng, 2004).

Đề tài nghiên cứu sử dụng chế phẩm AMG 300L: AMG–Amyloglucosidase Novo

là một exo–D–glucosidase–1,4–alpha được sản xuất từ một chủng vi sinh vật tên là

Aspergillus niger bằng sự lên men chìm Tên theo hệ thống là 1,4 alpha–D–glucan

glucohydrolase (EC 3.2.1.3) Enzyme này thủy phân các cầu nối α-1,4 và α-1,6 trong

tinh bột

Trong khi thủy phân, các đơn vị glucose bị tách rời theo thứ tự từ đầu không khử của

phân tử cơ chất nền Mức độ thủy phân phụ thuộc vào mối nối cũng như chiều dài

chuỗi các mối nối 1,4 alpha dễ dàng bị thủy phân hơn các mối nối 1,6 alpha, trong khi

maltotriose và đặc biệt maltose bị thủy phân ở mức độ thấp hơn các phân tử lớn của

oligosaccharides Sản phẩm AMG đều không nhiễm hoạt tính transglucosidase bằng

cách chuyển các phân tử của glucose từ vị trí 1,4 alpha qua 1,6 alpha

Chế phẩm lỏng là những chế phẩm màu nâu, có độ đặc chung 1,2g/ml Khi AMG tồn

trữ ở nhiệt độ 250C hoạt tính phổ biến được duy trì trong 6 tháng, khi bảo quản ở 50C,

sản phẩm sẽ giữ lại hoạt tính phổ biến ít nhất 1 năm Hoạt tính có thể bị hủy bằng cách

đun dung dịch chứa enzyme đến 800C trong 5 phút hoặc đến 750C trong khoảng 40

phút (Novo Nordisk, 2007)

2.2.3 Hoạt lực của enzyme amylase

Đơn vị của hoạt lực hay còn gọi là hoạt độ của enzyme là lượng enzyme có khả năng

xúc tác được một micromol cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn Các chế

phẩm có hoạt tính phân giải tinh bột thường chứa nhiều loại enzyme amylase, để xác

định hoạt độ của các amylase có thể dùng một trong các phương pháp sau:

- Đo sự biến thiên độ nhớt của dịch bằng nhớt kế khi cho amylase tác dụng lên hồ tinh

bột, khi đó các mạch phân tử cơ chất bị cắt ngắn, độ nhớt của dung dịch giảm dần

- Đo mật độ quang của dung dịch khi thực hiện phản ứng màu với iod Khi có amylase

thì các sản phẩm phân giải của tinh bột sẽ cho màu khác nhau với iod

- Đo lượng maltose hoặc glucose tạo thành sau khi cho enzyme tác dụng lên cơ chất

- Hoạt độ của α-amylase dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi enzyme có trong chế

phẩm tới các dextrin có phân tử lượng khác nhau Đo cường độ màu tạo thành giữa

tinh bột và các sản phẩm thủy phân của nó với iod bằng máy so màu quang phổ sẽ tính

được hoạt độ của enzyme Đơn vị hoạt độ của α-amylase là lượng enzyme chuyển hóa

được 1g tinh bột tan thành dextrin có phân tử lượng khác nhau ở 300C trong một giờ

- Hoạt độ của glucoamylase đặc trưng cho khả năng chế phẩm thủy phân tinh bột đến

glucose Đơn vị hoạt độ của glucoamylase là lượng chế phẩm enzyme khi tác dụng lên

tinh bột ở 300C và pH tối thích trong 1 giờ tạo ra 1mg glucose (xác định bằng phương

pháp Zikhetar- Bleyer) hay cũng trong những điều kiện nhiệt độ và pH tương tự làm

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme amylase

- Ảnh hưởng của nồng độ enzyme sử dụng: khi có lượng cơ chất đầy đủ thì vận tốc

phản ứng của enzyme tỷ lệ thuận với nồng độ enzyme, có thể biểu diễn sự liên hệ giữa

vận tốc phản ứng và nồng độ enzyme bằng biểu thức: v = k[E]

Trong đó v: vận tốc phản ứng

k: hằng số tốc độ phản ứng

[E]: nồng độ enzyme sử dụng

Nồng độ của enzyme càng lớn thì lượng cơ chất bị biến đổi càng nhiều, tuy nhiên khi

nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng bị chậm lại

- Ảnh hưởng của cơ chất: cơ chất của enzyme amylase là tinh bột, thuộc nhóm

carbohydrate thực vật có chủ yếu trong các loại ngũ cốc như: gạo tẻ, gạo nếp, ngô,

trong các loại củ: khoai lang, khoai mì (sắn)… Công thức tổng quát của tinh bột là

(C6H11O5)n Tinh bột được cấu tạo từ hai phân tử amylose và amylopectin

Tinh bột không tan trong nước lạnh nhưng sẽ bị hồ hóa khi đun nóng lên 60 ÷ 850C

Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân do liên kết glycoside bị

phân cắt Sự thủy phân tinh bột bởi amylase xảy ra ở hai mức độ: dịch hóa và đường

hóa Kết quả của quá trình dịch hóa là tạo thành các sản phẩm trung gian dextrin, sau

đó dextrin tiếp tục bị phân cắt tạo thành sản phẩm cuối là maltose và glucose

Tốc độ thủy phân của tinh bột phụ thuộc rất nhiều vào loại enzyme thủy phân, thành

phần amylose và amylopectin trong tinh bột và mức độ hồ hóa của hồ tinh bột

- Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất: Phản ứng khi có enzyme xảy ra theo ba giai đoạn:

Giai đoạn 1: enzyme sẽ tương tác với cơ chất tạo thành phức hợp ES, nếu nồng độ cơ

chất thấp thì tốc độ phản ứng V phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất

Giai đoạn 2: phức hợp ES sẽ được tách ra, tốc độ phản ứng cực đại và nó hoàn toàn

không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất

Giai đoạn 3: enzyme sẽ được giải phóng và hoạt động tự do, hiện tượng này được

xem xét trên cơ sở phản ứng chỉ có một cơ chất duy nhất

ứng càng lớn Sự phụ thuộc tuyến tính của thời gian phản ứng vào nồng độ cơ chất

theo chiều hướng tăng nồng độ cơ chất sẽ kéo dài thời gian thuỷ phân của amylase

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến tốc độ phản ứng được biểu diễn theo phương

trình Michaelis-Menten như sau:

V =

][

]max[

S km

S V

+Trong đó V: vận tốc phản ứng (hoạt tính enzyme)

km: hằng số Michaelis-Menten (hằng số nhạy cảm enzyme với cơ chất)

Vmax: vận tốc phản ứng cực đại (hoạt tính cực đại của enzyme)

-Ảnh hưởng của nhiệt độ: cũng như các phản ứng hóa học, vận tốc phản ứng enzyme

tăng khi nhiệt độ tăng, tốc độ phản ứng tăng khi đến nhiệt độ nhất định, vượt qua nhiệt

độ đó, tốc độ phản ứng bị giảm và enzyme có thể bị vô hoạt Nhiệt độ vô hoạt tùy

thuộc vào loại và nguồn chiết xuất do enzyme amylase có bản chất là protein nên nó

kém bền với nhiệt

Hình 2.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng của enzyme amylase

Nhiệt độ ứng với tốc độ phản ứng enzyme cực đại gọi là nhiệt độ tối thích, mỗi loại

enzyme có một nhiệt độ tối thích khác nhau tùy thuộc vào nguồn gốc của chúng, nhiệt

độ tối thích của enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt các ion kim loại, pH và

chất bảo vệ Thông thường sử dụng nhiệt độ để điều khiển hoạt động của enzyme và

tốc độ phản ứng theo yêu cầu của chế biến

- Ảnh hưởng của pH: enzyme rất nhạy cảm đối với sự thay đổi pH môi trường, do

pH ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme, phức hợp enzyme–cơ chất và đặc

biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme

Mỗi loại enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH nhất định gọi là pH tối

thích, đa số pH của enzyme nằm trong vùng acid yếu, kiềm yếu hay trung tính, chỉ

một ít enzyme có pH tối thích nằm trong vùng acid hay kiềm mạnh

Hình 2.10 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme amylase

Thay đổi pH tối ưu sẽ làm giảm hoạt tính enzyme vì thay đổi sự ion hóa các nhóm tại

trung tâm hoạt động, các biến đổi lớn của pH làm biến tính protein của enzyme, do sự

can thiệp vào liên kết phi cộng hóa trị yếu giữ vai trò ổn định cấu trúc không gian Tốc

độ phản ứng enzyme sẽ tăng dần đến giá trị cực đại và sau đó giảm dần Đa số các

enzyme bền trong giới hạn pH từ 5,0 ÷ 9,0 và độ bền của enzyme có thể tăng lên khi

có các yếu tố làm bền như Ca2+,… (Lê Ngọc Tú et al…, 2005)

- Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa: Các chất hoạt hóa là chất làm cho enzyme từ

trạng thái không hoạt động trở thành hoạt động, từ hoạt động yếu thành hoạt động

mạnh, chất hoạt hóa có thể làm tăng hoạt độ enzyme một cách trực tiếp hay gián tiếp

Chất hoạt hóa thực: ion kim loại có thể tham gia tạo thành trung tâm hoạt động, làm

cầu nối giữa enzyme và cơ chất hoặc ổn định cấu hình cần cho hoạt động xúc tác của

enzyme Nhiều enzyme được hoạt hóa bởi các ion Na+, K+, Mg2+, Zn2+, Mn2+…

Chất chống kìm hãm: là chất có khả năng làm mất tác dụng kìm hãm của các chất

khác, như CN- có thể làm mất tác dụng kìm hãm của muối đồng đến enzyme urease

Chất tác nhân bảo vệ: là các chất có tác dụng bảo vệ các nhóm chức hoạt động của các

trung tâm hoạt động enzyme Ví dụ như cystein có tác dụng bảo vệ các nhóm thiol của

các tâm hoạt động của nhiều enzyme

Chất hoạt hóa tiền enzyme: như enterokinase của dịch ruột có khả năng chuyển

trypsinogen không hoạt động thành trypsin hoạt động (Đặng Thị Thu et al…, 2003)

Khả năng làm tăng hoạt tính của các chất này có một giới hạn nhất định, vượt quá giới

hạn này rất có thể lại làm giảm hoạt tính của enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

- Ảnh hưởng của chất kìm hãm: Chất kìm hãm là chất có khả năng làm yếu hoặc

làm chấm dứt hoàn toàn tác dụng của enzyme, các chất kìm hãm có thể là ion kim

loại, các anion, các hợp chất hữu cơ có phân tử nhỏ hoặc protein các chất kìm hãm

có khả năng kìm hãm thuận nghịch và không thuận nghịch Trong chất kìm hãm thuận

nghịch, ta có thể phân biệt hai dạng kìm hãm cạnh tranh và không cạnh tranh

Kìm hãm cạnh tranh: xảy ra khi enzyme thiếu tính đặc hiệu tuyệt đối, trong trường

hợp này chất kìm hãm có cấu tạo tương tự cơ chất thật, nó kết hợp vào trung tâm hoạt

động của enzyme làm giảm hiệu lực xúc tác của enzyme

Kìm hãm không cạnh tranh: chất kìm hãm không cạnh tranh kết hợp với enzyme ở vị

trí khác với trung tâm hoạt động, làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử

enzyme làm giảm hoạt động xúc tác của nó dẫn đến giảm tốc độ phản ứng

Kìm hãm bởi sản phẩm phản ứng: các sản phẩm được tạo thành do các phản ứng

enzyme tham gia có thể tạo thành chất kìm hãm tốc độ của chính phản ứng đó Thí dụ:

nếu có một phản ứng kiểu:

S1 + S2 P1 + P2

Do tính thuận nghịch của phản ứng trên, các enzyme có áp lực với P1 và P2 tương

đương với S1 và S2 Trong trường hợp như thế P1 + P2 được coi như chất kìm hãm với

S1 và S2 (Lê Ngọc Tú et al…, 2005)

Kìm hãm do thừa cơ chất: Trong một số trường hợp cơ chất bị thừa lại trở thành chất

kìm hãm phản ứng Giả sử ta có phản ứng:

E + S ES E + P

Nếu có cơ chất thứ hai tham gia vào và nó có khả năng đính vào một vị trí nào đó trên

phức hệ ES (ngoài vùng xúc tác) làm cho chúng không hoạt động, khi đó phức hệ này

coi như chất kìm hãm

ES + S ESS

Tất cả các enzyme amylase đều bị kìm hãm bởi các ion kim loại như: Cu2+, Ag+

2.3 Enzyme papain (EC 3.4.22.2)

2.3.1 Cấu tạo của enzyme papain

Enzyme papain dạng bột màu vàng nâu nhạt tùy thuộc vào phương pháp sấy, không

tan trong hầu hết các chất hữu cơ nhưng tan trong H2O hay glycerine

Tâm hoạt động của papain gồm có nhóm -SH của cystein 25 và nitrogen bậc 3 của

histidine 159 Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi

liên kết hydrogen Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các

acid amin là: Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Hình 2.11 Cấu trúc không gian của enzyme papain

2.3.2 Hoạt tính của enzyme papain

Papain là một chất endoprotease có chứa 16,1% N và 1,2% S Papain là một protease

thiol, theo nghiên cứu của R L Hill và E L Smith, papain là một chuỗi polypeptide

gồm 185 amino acid, trọng lượng phân tử là 20.900 Dalton

Khoảng pH thích hợp để papain hoạt động là 6,0 ÷ 8,0 Nhiệt độ tối thích để hoạt động

tùy vào từng cơ chất khác nhau và có thể duy trì hoạt tính đến 600C Một điều cần lưu

ý là khoảng pH và nhiệt độ tối thích của papain sẽ không cố định mà thay đổi tùy vào

nguồn thu nhận, cơ chất phản ứng, cách thức trích ly và tinh chế papain

So với các protease có nguồn gốc từ động vật hoặc vi sinh vật, papain có khả năng

thuỷ phân sâu hơn, vì vậy nó được dùng để thủy phân tiếp các liên kết peptide còn lại

sau khi đã thủy phân bằng trypsin hay chymotrypsin Khả năng thủy phân cơ chất của

papain còn phụ thuộc vào trạng thái của cơ chất, tức là có biến tính hay không Nếu cơ

chất bị biến tính thì papain có khả năng thủy phân sâu hơn (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Papain thủy phân protein, đóng vai trò vừa là endopeptidase vừa là exopeptidase Các

endopeptidase thủy phân protein chủ yếu tạo thành peptide

(-NH-CH-CO-NH-CH-CO-)n + (HOH) (-NH-CH-COOH)i + (NH2-CH-CO-)k

Trong đó: i + k = n

Các exopeptidase thủy phân protein chủ yếu tạo thành acid amin

(-NH-CH-CO-NH-CH-CO-)n + (HOH) (H2N-CH-COOH)i’ + (H2N-CH-COOH)k’

Trong đó: i’ + k’ = n

Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng, có khả năng phân hủy hầu hết các liên kết

peptide trừ các liên kết với protein và với glutamic acid có nhóm carboxyl tự do

Thông tin về enzyme papain sử dụng trong nghiên cứu đề tài: Enzyme papain

được chiết suất từ đu đủ, là một protease cysteine thủy phân được peptide, amides và

ester, đặc biệt là liên kết các acid cơ bản, glycine hay leucine Chất ức chế bao gồm

Leupeptin và PMSF, có khoảng pH tối ưu 6,0 ÷ 7,0 và pI 8,75

Enzyme papain thương mại dạng bột màu vàng nâu có khối lượng phân tử 21.000,

hoạt tính >30.000 USP units/mg trên cơ chất casein, ở pH 6,0 và nhiệt độ 400C, ngoài

ra còn thể hiện hoạt tính ở đơn vị khác như: 1 MCU (milk clotting unit)= 9 HDU

(hemoglobin digestion units)= 6 GU (gelatin units)= 30 USP units

Độ hòa tan dung dịch nước đệm (1mg/ml H2O ở 250C), lưu trữ 20C đến 80C, dạng hòa

tan có thể ổn định cho đến 2 tháng ở nhiệt độ -200C

2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme papain

- Nhiệt độ: Papain là enzyme chịu được nhiệt độ tương đối cao Ở dạng nhựa khô

papain bị mất hoạt tính sau 30 phút ở 82,50C và nếu tăng nhiệt độ cao hơn 1000C thì

nó sẽ bị mất hoàn toàn hoạt tính kể cả khi thêm lượng lớn chất hoạt hóa vào dung

dịch Điều này là do ở dạng dung dịch khi tăng lên đến nhiệt độ lớn hơn 1000C thì cấu

trúc tâm hoạt động của enzym bị phá hủy hoàn toàn

Đáng chú ý khi đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể thì papain có độ bền nhiệt độ

thấp hơn papain ở trong mủ nhựa, bởi lẽ trong mủ nhựa còn chứa các protein khác có

tác dụng bảo vệ nó, papain trong dung dịch NaCl giữ ở 40C bền trong nhiều tháng

Trong dung dịch dẫn xuất thủy ngân, papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều

tháng, enzyme mất hoạt tính của nó mỗi ngày 1÷ 2% do sự tự phân hoặc oxy hóa

Khi thủy phân protein tùy thuộc vào cơ chất mà nhiệt độ tối ưu cho papain cũng khác

nhau, đối với cơ chất casein topt là 37oC, papain dạng ổn định ở trạng thái khô có thể

chịu nhiệt độ sấy ở 115oC trong thời gian 2h mà hoạt tính vẫn duy trì được 90%

- pH: Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4,5 ÷ 8,2 nhưng lại dễ biến

tính trong môi trường acid có pH < 4,5 hoặc trong môi trường kiềm mạnh có pH >12,

khi phản ứng với các cơ chất thì tùy thuộc vào bản chất của cơ chất mà pH tối ưu sẽ

khác nhau Chẳng hạn papain phản ứng với casein ở pH tối ưu là 7 ÷ 7,5 với albumin

ở pH tối ưu 4,5 ÷ 7,1 và với gelatin lại có pH tối ưu 5,2 ÷ 6,4, điểm đẳng điện pI = 9

Papain dạng ổn định tức là dạng mà cấu trúc không gian của enzym được ổn định, có

thể chịu được các pH=1,5 và pH= 8,5 trong 90 phút Người ta nhận thấy rằng, sự thay

đổi pH có ảnh hưởng lớn đến trạng thái ion hóa của cả enzyme và cơ chất nên sẽ tác

động đến quá trình hình thành phức hợp enzyme-cơ chất [ES], từ đó làm thay đổi vận

tốc phản ứng do enzyme xúc tác (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

- Dung môi: Papain không thay đổi độ quay quang học trong methanol 70% và cũng

không thay đổi độ nhớt trong methanol 50% Trong dung dịch dimethylsulfoxide chứa

20% dung môi hữu cơ và urea 8M không làm giảm hoạt tính cũng như thay đổi cấu

hình của papain Các chất gây biến tính mạnh: TCA 10%, guanidine hydrochloride

6M làm biến đổi bất thuận nghịch về độ quay quang học và hoạt tính của papain

- Chất hoạt hóa: Papain cần nhóm sulfhyryl tự do để thể hiện hoạt tính xúc tác Chất

hoạt hóa có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của protease thực vật nói chung hay

papain nói riêng Do trung tâm hoạt động của papain bao gồm nhóm cysteine 25 và

nitrogen bậc 3 của histidine 159 có tính khử nên các chất đóng vai trò hoạt hóa papain

là các chất có tính khử như: cysteine, glutation, acid hydrocyanic, hydrogensulfite

trong đó cysteine là chất thường được sử dụng nhất Khi có mặt các chất này thì nhóm

–SH ở trung tâm hoạt động của papain được phục hồi làm tăng hoạt tính papain

Để thu được papain hoạt tính cao nhất, thích hợp nhất là dùng hỗn hợp cysteine và

EDTA, trong đó cysteine đóng vai trò hoạt chất hóa papain còn EDTA đóng vai trò

liên kết tạo phức với ion kim loại nặng có trong nhựa đu đủ

- Chất kìm hãm: Papain bị kìm hãm (ức chế bất thuận nghịch) bởi các chất oxy hóa

như: O2, ozon, hydroperoxide, iodur acetate, iodur acetamide, thủy ngân chlobenzoate,

cystine và các hoạt chất disulfur khác Đặc biệt papain rất dễ bị mất hoạt tính khi có

mặt hydrogen peroxide, các chất này ức chế papain bằng phản ứng với nhóm –SH ở

trung tâm hoạt động của papain và do vậy mà phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó

Papain bị bất hoạt thuận nghịch bởi không khí, khi cysteine ở nồng độ thấp, các ion

kim loại nặng: Cd+, Cu2+, Zn2+, Hg2+, Pb2+, Fe2+ và các tác nhân gây ức chế papain

Nhiều chất ức chế papain chứa phenylalanine ở vị trí nhóm thế thứ hai kể từ đầu mạch

C là chất ức chế cạnh tranh mạnh của papain do chiếm một phần trung tâm hoạt động

Chế phẩm papain bảo quản vài tháng có độ hoạt động khoảng 30%, ngay cả khi hoạt

hóa, lượng sulfuhydryl tự do vẫn nhỏ hơn 1 mol SH/1 mol papain và thường không

quá 0,5 mol/mol Nguyên nhân do nhóm sulfuhydryl đã bị khóa bất thuận nghịch một

phần và bản chất hóa học của hiện tượng này hiện nay vẫn chưa được nghiên cứu hết

2.4 Enzyme bromelain (EC 3.4.22.32)

2.4.1 Cấu tạo của enzyme bromelain

Bromelain là một thuật ngữ dùng chung để chỉ các enzyme được tìm thấy trong dịch

chiết từ cây khóm, chủ yếu là các protease cysteine, enzyme bromelain là một

protease-thiol Trong trung tâm hoạt động của bromelain có chứa cysteine, đây là một

amino acid có nhóm hóa học hoạt động mạnh là –SH (sulfuhydryl), phân tử có dạng

hình cầu do có cách sắp xếp phức tạp và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối

disulfite Bromelain ở thân và quả dứa có thành phần acid amin thay đổi khác nhau,

bromelain

thân có khoảng 144÷321 acid amin, còn bromelain quả thì có khoảng 161÷283 acid

amin, Bromelain thân là một sợi polypeptide có amino acid ở đầu amin là valine và ở

đầu carbonyl là glycine, bromelain quả có amino acid ở đầu amin là alanine

Bromelain quả là một protease acid, có phân tử lượng khoảng từ 23 đến 31kDa,

bromelain quả có điểm đẳng điện pI= 4,6 khác biệt cơ bản với bromelain thân với

pI=9,6 (Yamada et al., 1976; Ota et al., 1985)

2.4.2 Hoạt tính enzyme bromelain

Enzyme bromelain có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amydase và esterase Nhóm

sulfuhydryl trong phân tử của enzyme đóng vai trò rất quan trọng trong các phản ứng

của enzyme, là thành phần trực tiếp tham gia các phản ứng xúc tác, chúng có khả năng

gắn với cơ chất để tạo thành phức chất enzyme-cơ chất, chúng tham gia vào nhiều

biến đổi hóa học như sự ion hóa, acyl hóa, phosphoryl hóa, oxy hóa, alkyl hóa, tạo

thành các mercaptide, serine mercaptal, liên kết hydrogen và những phức hợp chuyển

điện tích

Giống như papain, bromelain đóng vai trò là một endopeptidase, có khả năng tham gia

xúc tác, đẩy mạnh phản ứng thủy phân protein thành các oligopeptide và amino acid

Thông tin về enzyme Bromelain sử dụng trong nghiên cứu đề tài: Bromelain được

sử dụng để thủy phân protein, peptide, amides và ester của các axit amin Bromelain

được chiết xuất từ thân cây dứa

Enzyme bromelain thương mại dạng bột màu nâu, hoạt tính ≥ 2,0 mAnsonU/mg trên

cơ chất là hemoglobine, ở pH 6,0 và nhiệt độ 35,5°C

Độ hòa tan dung dịch nước đệm (50g/l H2O ở 20oC), lưu trữ ở nhiệt độ dưới 15°C

2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme bromelain

Giống như các chất xúc tác sinh học, bromelain chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố như:

loại cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số

nhóm chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh chế… Các yếu tố như nhiệt độ,

pH thích hợp cho hoạt động của các phản ứng xúc tác của bromelain không ổn định

mà phụ thuộc lẫn nhau và tùy thuộc vào các yếu tố khác nhau như: bản chất cơ chất,

nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, thời gian phản ứng, sự có mặt của các chất hoạt

hóa

- Ảnh hưởng bởi cơ chất: trên những cơ chất khác nhau, bromelain có hoạt tính khác

nhau, nếu cơ chất là hemoglobin thì khả năng phân giải của bromelain mạnh hơn

papain 4 lần, nếu cơ chất là casein thì hoạt tính của bromelain tương tự như papain

- Ảnh hưởng bởi nhiệt độ:Nhiệt độ có những ảnh hưởng ở nhiều mức độ khác nhau

lên hoạt tính của enzyme, enzyme có bản chất là protein nên nó không bền dưới tác

dụng của nhiệt độ, đa số các enzyme bị mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 700C (Lê Ngọc Tú,

2004)

Enzyme bromelain có khả năng hoạt động trong khoảng nhiệt độ từ 45 ÷ 600C, nhiệt

độ quá cao sẽ làm thay đổi cấu trúc của enzyme, phá vỡ các liên kết trong phân tử

không gian của nhóm -SH bị biến đổi nên enzyme không kết hợp được với cơ chất,

Nhiệt độ quá thấp hoặc quá cao sẽ làm phân tử protein bị biến tính sẽ làm giảm hoạt

tính của enzyme (Phạm Thu Cúc, 1999)

Nhiệt độ phản ứng xúc tác còn chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, đặc biệt là thời gian

phản ứng, thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ có những tác động làm ảnh hưởng

đến hoạt tính của enzyme, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme

Ở dịch chiết quả pH= 3,5 khi tăng nhiệt độ đến 600C thì bromelain vẫn còn hoạt tính

Bromelain tinh khiết nhạy cảm với nhiệt độ hơn, ở 50C, pH 4 ÷ 10 bromelain giữ hoạt

tính tối đa trên casein trong 24 giờ; ở 550C, pH= 6,1 bromelain bị mất 50% hoạt tính

trong vòng 20 phút, quá trình đông khô, enzyme bromelain bị mất 27% hoạt tính

- Ảnh hưởng của độ pH: pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt động xúc

tác của enzyme, hoạt tính enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi pH của môi trường,

mỗi loại enzyme thường chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH xác định gọi là pH

tối thích pH tối thích của bromelain không ổn định mà tùy thuộc vào nhiệt độ, thời

gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch của enzyme, bản chất dung

dịch đệm, sự hiện diện của chất tăng hoạt Enzyme bromelain đã tinh sạch chỉ còn lại

60÷70% hoạt tính, bromelain có biên độ pH rộng (3÷10) nhưng pH tối thích của

enzyme là 5 ÷ 8 tùy thuộc vào cơ chất

pH ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme do pH làm thay đổi trạng thái ion hóa của

enzyme và của cơ chất, phức hợp enzyme-cơ chất Nếu pH quá cao hoặc quá thấp sẽ

làm ảnh hưởng đến điện tích và khả năng tích điện của enzyme và cơ chất, có thể làm

giảm hoặc mất khả năng kết hợp với cơ chất của enzyme do đó hoạt tính enzyme sẽ bị

giảm hoặc thậm chí mất hẳn (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

- Ảnh hưởng bởi các ion kim loại: các ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính của

enzyme do chúng thường gắn vào các trung tâm hoạt động của enzyme Muối thủy

ngân có ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính của enzyme bromelain và mức độ kìm

hãm thay đổi theo nồng độ của muối Ngoài ra, còn có những chất có tác động ức chế

bromelain do chúng kết hợp với nhóm SH của trung tâm phản ứng của enzyme

2.5 Nấm men

2.5.1 Cấu tạo và thành phần của nấm men

Nấm men có cấu tạo đơn bào, tế bào nấm men có nhiều hình dạng khác nhau như hình

cầu, elip, trứng… kích thước của tế bào nấm men vào khoảng 8 ÷ 15µm

Bảng 2.4 Thành phần hóa học của tế bào nấm men

Tế bào nấm men sinh sản chủ yếu bằng hình thức nẩy chồi, tế bào mẹ nảy sinh ra một

chồi nhỏ rồi lớn dần lên và sẽ tách ra, quá trình này xảy ra sau 2 giờ qua các giai đoạn:

Giai đoạn tiền phát: tế bào nấm men làm quen với môi trường, sinh khối tăng nhiều

Giai đoạn phát triển logarit: đây là giai đoạn phát triển rất nhanh của tế bào nấm

men, tốc độ sinh khối của tế bào nấm men tăng theo cấp số nhân Trong giai đoạn này

có sự thay đổi mạnh mẽ thành phần của dịch lên men

Giai đoạn phát triển chậm dần: tốc độ sinh trưởng của tế bào nấm men chậm dần,

thành phần dinh dưỡng trong môi trường dịch lên men còn lại ít, các sản phẩm lên

men được tích tụ nhiều

Giai đoạn ổn định: tế bào nấm men không tăng, tốc độ sinh sản bằng tốc độ chết

Giai đoạn chết: tế bào nấm men giảm dần do tốc độ chết tăng, tốc độ sinh sản chậm

Hình 2.13 Quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào nấm men

2.5.3 Nấm men sử dụng trong sản xuất rượu vang

Saccharomyces ellipsodues, Saccharomyces oriformis, chủng nấm men này có tốc độ

lên men nhanh, tạo ra sản phẩm chứa 18 ÷ 20% ethanol, đặc trưng của nấm men vang

là có hình elip hoặc elip kéo dài Trong điều kiện thuận lợi, nấm men sinh sản bằng

cách nẩy chồi, trong điều kiện không thuận lợi chúng sinh sản bằng cách tạo bào tử

Saccharomyces vini: trước đây người ta gọi là Saccharomyces vini Meyer hay là

Saccharomyces ellipsoideus, theo Lodder là Saccharomyces cerevisiae Hansen Trong

quá trình lên men nước quả, nấm men này sử dụng nguồn dinh dưỡng cacbon là

đường, acid hữu cơ và các tác nhân sinh trưởng là acid pantotenic, biotin, mezoinzit,

tiamin, piridoxin Ngoài ra chúng còn có các đặc tính riêng về khả năng tạo cồn, chịu

sunfit, tổng hợp các cấu tử bay hơi và các sản phẩm thứ cấp cho rượu vang có mùi đặc

trưng riêng biệt Nhiều loài nấm men này trong quá trình lên men rượu tạo được một

lượng rượu chỉ đạt 8 ÷ 10% so với thể tích, ở giai đoạn cuối của quá trình lên men

Saccharomyces vini kết lắng nhanh và làm trong rượu, sau đó chúng thường bị già,

không tiếp tục chuyển đường thành cồn và bị chết rất nhanh

Saccharomyces oviformic: Nấm men này được tách từ nước nho tự lên men, có khả

năng chịu được lượng đường và cồn cao, lên men kiệt đường và tạo ra lượng rượu tới

18 độ Giống này lên men được glucose, fructose, manose, saccharose, maltose và 1/3

rafinose và không lên men được lactose, pentose (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

Loại nấm men thường được sử dụng sản xuất rượu vang nếp là Saccharomyces

cerevisiae, loại này có khả năng lên men nhiều loại đường như glucose, fructose,

saccharose, maltose, galactose từ nhiều loại nguyên liệu như gạo, nếp, ngô, sắn Nấm

men này có thể lên men tốt với lượng đường từ 12 ÷ 14% có khi từ 16 ÷ 18%, nồng độ

rượu trong dịch lên men từ 10 ÷ 12%, nhiệt độ lên men thích hợp là 28 ÷ 320C

Hình 2.14 Nấm men Saccharomyces cerevisae

Yêu cầu đối với nấm men rượu vang: Khả năng lên men cao, chịu được nhiệt độ, bền

với ethanol và nồng độ đường cao

Đặc điểm của lên men nổi là trong giai đoạn lên men chính chúng tạo trên bề mặt một

lớp bọt tương đối dày, trạng thái này được duy trì cho đến khi lên men gần kết thúc,

theo cấu trúc thì nấm men nổi thuộc dạng hạt, chúng ít liên kết nhau thành chuỗi Đối

với lên men nổi thì nhiệt độ lên men thích hợp ở 20 ÷ 280C

Đặc điểm của lên men chìm chỉ phát triển ở lơ lửng và ở đáy môi trường, chúng không

tạo thành bọt dày trên bề mặt, lắng nhanh khi lên men kết thúc và tạo thành lớp men

xít, bám chắc ở đáy thùng, nhiệt độ thích hợp cho nấm men loại này là 5 ÷ 100C

Đặc điểm nổi bật của nấm men chìm là một số chủng có chứa enzyme α-galactosidase

lên men hoàn toàn đường rafinose, còn nấm men nổi thì chỉ có một số ít chủng có khả

năng chuyển hóa được 1/3 đường rifanose thành rượu và CO2

Ngoài tính chất chung là nấm men có khả năng chuyển hóa đường thành rượu và CO2

thì trong mỗi ngành sản xuất đều có những đòi hỏi đặc thù Ví dụ: nấm men dùng

trong sản xuất bia và rượu vang phải cho sản phẩm mùi đặc trưng thơm ngon; đồng

thời phải lắng tốt và giúp cho dịch lên men nhanh chóng

Các loài nấm men được sử dụng trong sản xuất rượu vang thường có khoảng nhiệt độ

thích hợp 18 ÷ 250C, ở 350C sinh sản của chúng bị ức chế, ở 400C sinh sản bị ngừng

hoàn toàn, ở nhiệt độ thấp hơn 160C sinh sản và lên men bị kéo dài Các điều kiện lý

hóa, thành phần và chất liệu dịch quả cũng như pH môi trường có ảnh hưởng rất lớn

đến quá trình sống của nấm men

2.6 Bánh men thuốc bắc

Loại bánh men Hải Anh Quang có tính năng hòa men với nước ngâm trực tiếp vào

cơm, là loại men rượu được sản xuất trên dây chuyền tiên tiến của DNTN SXTM Hải

Anh Quang phân phối và cung cấp các đại lý trên toàn quốc

Cách sử dụng: Một gói men nhỏ 100g dùng cho 10 kg (gạo, tấm, ngô) đã nấu chín để

nguội hẳn Dùng một gói men nhỏ hòa tan với 20 lít nước đựng trực tiếp trong lu,

khạp Bỏ cơm đã nguội hẳn vào lu, khạp đảo nhẹ rồi đậy kín Ủ lên men ở nhiệt độ

280C đến 350C, sau khi ngâm được 24 giờ, đảo nhẹ đều lại lần nữa rồi đậy nắp kín ủ

thêm 8 đến 10 ngày thì chưng cất Rượu sẽ đạt từ 16 lít đến 18 lít rượu 450 (trước khi

chưng cất rượu chan thêm 15 lít nước)

Thành phần men thuốc bắc: Gạo, lúa mạch, ngô, khoai mì, thuốc bắc, giống men (vi

khuẩn, nấm men và nấm mốc), chất tạo xốp Loại men này khi lên men chìm cơm, khi

nấu không bao giờ bị khê, khét

Thời gian sử dụng: 6 tháng, bảo quản nơi khô ráo thoáng mát, tránh tiếp xúc với ánh

sáng mặt trời

Bảng 2.5 Tiêu chuẩn chất lượng bánh men giống

2.7 Các quá trình chính trong sản xuất rượu vang nếp

2.7.1 Quá trình hồ hóa tinh bột

Hồ hóa tinh bột nhằm mục đích giúp quá trình thủy phân tinh bột bởi enzyme xảy ra

dễ dàng hơn, đầu tiên hạt tinh bột sẽ hút nước và trương lên, tăng khối lượng và thể

tích, khi gia nhiệt tinh bột với nước đến nhiệt độ 400C tinh bột bắt đầu trương nở Nếu

tiếp tục tăng nhiệt thì hạt tinh bột sẽ tiếp tục trương nở đến khi tạo thành một thể đồng

nhất gọi là sự trương nở vô hạn Khi nhiệt độ tăng đến giới hạn nhất định, thể tích của

hạt tinh bột tăng 50 ÷ 100 lần Lực liên kết giữa các phân tử yếu dần đến mức độ tinh

bột tan ra gọi là sự hồ hoá tinh bột Ở trạng thái này chỉ mới một phần nhỏ tinh bột bị

phá vỡ, điều này chứng tỏ rằng sự cấu tạo bền vững của tinh bột là do sự kết hợp giữa

các phân tử lớn của các chuỗi tinh bột giữa các mạch chính và nhánh thành những

mạng, giữa các mạng là amylose và amylopectin

Các mạch thẳng trong hạt tinh bột liên kết với nhau bằng lực hút tĩnh điện và liên kết

hydro, ngoài ra trong tinh bột còn có các liên kết khác chắc chắn hơn (do sự xoắn

mạch của amylose làm cho chúng siết chặt lấy nhau), chính hiện tượng này làm cho

quá trình hồ hoá muốn phá vỡ chúng cần phải tiêu tốn một nhiệt lượng cần thiết

Để quá trình nấu được tốt, khi nấu nguyên liệu, người ta thường bổ sung một lượng

nước cần thiết đảm bảo cho sự hòa tan và đạt được nồng độ chất khô theo yêu cầu

Khi làm nguội, dung dịch amylopectin đông đặc nhanh hơn, ở nhiệt độ 550C chúng

biến thành keo làm cho enzyme amylase không thể tác dụng, đối với dung dịch

amylose thì rất không bền vững, nhanh chóng liên kết với nhau tạo thành những hạt

nhỏ li ti kết tủa xuống và làm cho enzyme amylase không thể tấn công được Do đó

làm giảm khả năng đường hoá Vì vậy, trong sản xuất rượu người ta thường làm nguội

nhanh đến nhiệt độ 60 ÷ 620C và đường hoá, một biện pháp kỹ thuật thường dùng là

sử dụng enzyme amylase dịch hoá trước hay sau khi nấu nguyên liệu (Bùi Thị Quỳnh

Hoa, 2004)

2.7.2 Quá trình đường hóa trong sản xuất rượu vang nếp

Nguồn tinh bột trong nguyên liệu nếp không thể trực tiếp lên men được, mà cần phải

qua giai đoạn đường hoá, tác nhân xúc tác thường dùng là enzyme amylase, enzyme

này sẽ thủy phân tinh bột tạo thành đường để nấm men sử dụng trong quá trình lên

men Quá trình đường hóa chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố:

- Nhiệt độ: Tốc độ phản ứng thủy phân của enzyme amylase chịu ảnh hưởng rất lớn

bởi nhiệt độ Tốc độ thủy phân cao nhất ở nhiệt độ tối thích của enzyme, nếu vượt quá

nhịêt độ này thì chúng sẽ bị biến tính và sẽ trở nên trơ đối với cơ chất, nhiệt độ không

chỉ ảnh hưởng đến tốc độ đường hóa, hiệu suất đường hóa mà còn ảnh hưởng đến tỷ lệ

các thành phần của sản phẩm đường hóa, khi đường hóa ở nhiệt độ cao, dexrtin tạo ra

nhiều hơn so với đường khử Mặt khác, trong nấm men không có hoặc rất ít α-amylase

và glucoamylase nên không thể thủy phân tiếp tục dextrin thành đường nên giảm hiệu

suất quá trình phân cắt tinh bột

- pH: Bản chất của enzyme là protein do vậy tính chất của nó cũng giống như protein,

những nhóm hoá học cơ bản của enzyme có khả năng ion hoá Sự hiện diện của ion

H+ làm giảm khả năng ion hoá của các nhóm này, nếu nhóm này là trung tâm hoạt

động của enzyme thì sẽ kìm hãm hay kích thích enzyme tùy theo nồng độ

- Thời gian đường hóa: Thời gian đường hoá có ý nghĩa thực tiễn trong sản xuất, phụ

thuộc vào khả năng làm nguội dịch nấu và phương pháp đường hoá Thời gian đường

hoá quyết định năng suất của thiết bị, chất lượng dịch đường hoá và hiệu suất thu hồi

Thời gian đường hoá ảnh hưởng đến sự hoà tan tinh bột không đường hoá Khi đường

hoá khối nấu ở 55 ÷ 580C trong thời gian 15 ÷ 150 phút hầu như đường lên men

không tăng, nhưng nồng độ chất tan tăng do sự hoà tan tinh bột không đường hoá

- Nồng độ enzyme: Trong điều kiện không thay đổi về chủng loại enzyme, nồng độ

cơ chất, thời gian thủy phân, nhiệt độ, pH môi trường, nồng độ enzyme tăng thì tốc độ

đường hóa tăng Trong sản xuất tốc độ của quá trình thủy phân là một hàm số, là sự

tác dụng tổng hợp của phức hệ enzyme- cơ chất, nếu có sự khác nhau về loại, lượng,

hoạt tính khác nhau thì kết quả của sự thủy phân tinh bột cũng khác nhau

2.7.3 Quá trình lên men trong sản xuất rượu vang nếp

Lên men rượu là quá trình trao đổi chất nhờ tác dụng của các enzyme tương ứng gọi là

chất xúc tác sinh học (được sinh ra từ sự trao đổi chất để duy trì sự sống của nấm

men) tùy theo sản phẩm sau quá trình lên men người ta chia làm nhiều kiểu lên men

khác nhau là lên men yếm khí và lên men hiếu khí

Lên men hiếu khí: là sự phân hủy đường có sự hiện của O2 như quá trình lên men acid

accetic, citric…

Lên men yếm khí: là sự phân hủy đường không có sự hiện diện của O2 như quá trình

lên men lactic, lên men rượu, butylic… lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với

sự có mặt của nấm men Nấm men chuyển hóa đường thành rượu C2H5OH và CO2,

người ta còn gọi quá trình này là quá trình rượu hóa:

Hình 2.16 Quá trình trao đổi chất của tế bào nấm men phụ thuộc hiện diện Oxygen có thể hô

2.7.4 Cơ chế của quá trình lên men rượu

Để lên men rượu, người ta cho vào môi trường một lượng nấm men nhất định, tùy

theo phương pháp lên men mà lượng nấm men cho vào khác nhau, thông thường số

lượng tế bào nấm men phải lớn hơn 107 ÷ 108 cfu/ml Do diện tích bề mặt của tế bào

nấm men rất lớn nên khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng rất mạnh Đường khử và

các chất dinh dưỡng khác trong môi trường lên men trước tiên được hấp thụ trên bề

mặt của nấm men và sau đó khuyếch tán qua màng vào bên trong tế bào

Rượu ethylic tạo thành khuyếch tán ra môi trường bên ngoài qua màng tế bào nấm

men, rượu tan vô hạn trong nước nên khuyếch tán rất nhanh vào trong môi trường,

CO2 cũng hòa tan vào môi trường nhưng sự hòa tan không lớn, ở áp suất 800mmHg

nhiệt độ 25 ÷ 300C là 0,856 ÷ 0,873 lít CO2 trong 1 lít nước, vì thế CO2 sinh ra trong

quá trình lên men sẽ khuyếch tán vào trong môi trường và nhanh chóng đạt được trạng

Glucose 6-phosphate

NADH Pyruvate

Nấm men lên men rượu