ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ HÓA

Do vậy, để khắc phục các nhược điểm của liposome ta cần thay đổi phospholipid tự nhiên trong liposome trắng thành các phospholipid tổng hợp để tạo ra liposome nhạy cảm với pH.. Liposome

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong trường ĐH Công nghiệp Thực phẩm Tp Hồ Chí Minh nói chung, các thầy cô trong Khoa Công nghệ Hóa học nói riêng đã dạy dỗ cho em kiến thức về các môn đại cương cũng như các môn chuyên ngành, giúp em có được cơ sở lý thuyết vững vàng và tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập

Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè, đã luôn tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ, động viên em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đồ án môn học

Tp HCM, ngày tháng năm 2018

Sinh viên thực hiện Phạm Quỳnh Trang

Họ và tên sinh viên: Phạm Quỳnh Trang MSSV: 2004160198

Lớp: 07DHHH3 Ngành: Công Nghệ Kỹ Thuật Hóa Học _ DH

I Đầu đề (Tên đồ án): Tìm hiểu quy trình tổng hợp liposome nhạy pH và ứng dụng

làm chất mang thuốc

II Nhiệm vụ (nội dung yêu cầu và số liệu ban đầu):

- Tìm hiểu liposome

- Tìm hiểu liposome nhạy pH

- Tìm hiểu quy trình tổng hợp liposome nhạy pH và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp

- Tìm hiểu ứng dụng liposome nhạy pH làm chất mang thuốc

III Nội dung các phần thuyết minh báo cáo:

Bài báo cáo được trình bày bao gồm 3 phần chính:

Chương 1: Tổng quan Chương 2: Nội dung chính Chương 3: Kết luận và kiến nghị

IV Ngày giao: 06/09/2018

V Ngày hoàn thành: 25/11/2018

VI Ngày nộp: 25/11/2018

Tp.HCM, ngày 06 tháng 09 năm 2018

TRƯỞNG BỘ MÔN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

(Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)

Nguyễn Thị Hồng Anh Lê Thúy Nhung

TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM

Khoa: CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

Bộ Môn: CÔNG NGHỆ HỮU CƠ

CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc

PHIẾU GIAO NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH

ĐƠN VỊ : KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

BỘ MÔN: CÔNG NGHỆ HỮU CƠ

PHIẾU THEO DÕI TIẾN ĐỘ THỰC HIỆN ĐỒ ÁN

Sinh viên thực hiện đồ án: Phạm Quỳnh Trang Ký tên:………

Cán Bộ hướng dẫn: ThS Lê Thúy Nhung

Tên đề tài: Tìm hiểu quy trình tổng hợp liposome nhạy pH và ứng dụng làm chất

04 9/11/2018 Chỉnh sửa nội dung đồ án

04 10/11/2018 Chỉnh sửa nội dung đồ án

06 14/11/2018 Chỉnh sửa nội dung đồ án

07 19/11/2018 Chỉnh sửa nội dung đồ án

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Sinh viên thực hiện: Phạm Quỳnh Trang MSSV: 2004160198

Nhận xét:

Điểm đánh giá:

Ngày tháng năm 2018

(Ký và ghi rõ họ tên)

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN

Sinh viên thực hiện: Phạm Quỳnh Trang MSSV: 2004160198

Nhận xét:

Điểm đánh giá:

Ngày tháng năm 2018

(Ký và ghi rõ họ tên)

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

PHIẾU GIAO NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN ii

PHIẾU THEO DÕI TIẾN ĐỘ THỰC HIỆN ĐỒ ÁN iii

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN iv

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN v

DANH MỤC BẢNG BIỂU vii

DANH MỤC HÌNH ẢNH viii

DANH MỤC SƠ ĐỒ ix

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT x

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Giới thiệu liposome 2

1.1.1 Khái niệm 2

1.1.2 Đặc điểm cấu tạo 2

1.1.3 Phân loại 9

1.1.4 Phương pháp tổng hợp 11

1.1.5 Phương pháp giảm kích thước tiểu phân 15

1.1.6 Lĩnh vực ứng dụng 17

1.2 Giới thiệu liposome nhạy pH 20

1.2.1 Khái niệm 20

1.2.2 Phân loại 20

1.2.3 Lĩnh vực ứng dụng 23

1.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 30

1.3.1 Trên thế giới 30

1.3.2 Ở Việt Nam 31

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG CHÍNH 32

2.1 Quy trình tổng hợp liposome nhạy pH bằng phương pháp hydrat hóa film 32

2.1.1 Nguyên liệu chính 32

2.1.2 Phụ gia, hóa chất 32

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 32

2.1.4 Sơ đồ công nghệ 37

2.1.5 Thuyết minh quy trình 37

2.1.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp liposome nhạy pH 39

2.1.7 Đánh giá liposome nhạy pH đã tạo thành 40

2.2 Ứng dụng liposome nhạy ph làm chất mang thuốc 41

CHƯƠNG 3 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

3.1 Kết luận 47

3.2 Kiến nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 Các phụ gia, hóa chất sử dụng 32

Bảng 2.2 Thiết bị nghiên cứu 33

Bảng 2.3 Dụng cụ nghiên cứu 35

Bảng 2.4 Đổi pH môi trường bên ngoài liposome 39

Bảng 2.5 Hệ thống phân phối thuốc liposome nhạy cảm với pH 43

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cấu trúc liposome 2

Hình 1.2 Phân tử phospholipid 3

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử của phospholipid 3

Hình 1.4 Cholesterol trong thực tế 6

Hình 1.5 Cấu trúc phân tử của cholesterol 6

Hình 1.6 Phân loại liposome dựa trên kích thước và cấu trúc số lớp phospholipid 10

Hình 1.7 Quá trình bào chế liposome bằng phương pháp hydrat hóa màng film 12

Hình 1.8 Cơ chế hình thành liposome bằng phương pháp bốc hơi pha đảo 14

Hình 1.9 Hệ thống phương pháp bốc hơi pha đảo siêu tới hạn 15

Hình 1.10 Thiết bị đùn bằng tay mini extruder và thiết bị nén/ đẩy dưới áp suất cao 16 Hình 1.11 Khả năng tập trung tại mô đích của liposome dựa trên hiệu ứng EPR 18

Hình 1.12 Sự khác biệt giữa mạch máu ở mô bình thường và mô ung thư 19

Hình 1.13 Cấu trúc phân tử của PE 21

Hình 1.14 Cấu trúc phân tử của CHEMS 22

Hình 1.15 Cấu trúc Phân tử của DSPC 23

Hình 1.16 Cấu trúc phân tử của DOPE 23

Hình 1.17 Hóa trị liệu trong ung thư 25

Hình 1.18 Khối u 27

Hình 1.19 DNA 29

Hình 2.1 Phương pháp thẩm tích sử dụng túi Spectra/ Por 4 39

Hình 2.2 Hiệu ứng EPR 42

Hình 2.3 Phân phối thuốc được nhắm mục tiêu từ liposome nhạy pH 42

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1 Quy trình sản xuất phospholipid 5

Sơ đồ 1.2 Giai đoạn tổng hợp mevalonate 7

Sơ đồ 1.3 Giai đoạn tổng hợp squalene 8

Sơ đồ 1.4 Giai đoạn tổng hợp cholesterol 9

Sơ đồ 2.1 Quy trình tổng hợp liposome nhạy pH 37

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT

3 EE Encapsulation Efficient - Hiệu suất liposome hóa

4 GUV Giant Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp khổng

9 LUV Large Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp lớn

10 MLV Multi Lamellar Vesicle – Liposome đa lớp

11 MUV Medium Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp

trung bình

12 MVVs Multi Vesicular Vesicle – Liposome kép – liposome

trong liposome

13 OLV Oligo Lamellar Vesicle – Liposome đa lớp nhỏ

14 PBS Đệm photphat pH 7,4 trong môi trường NaCl 0,9%

15 PDI Polydispersity Index – Chỉ số đa phân tán

31 mOsm/ kg milliosmoles/ kilogram

32 scCO2 CO2 siêu tới hạn

37 SucPG Polyme-succinyl hóa glycidol

38 MGluPG 3-methylglutarylate polyglycidol

LỜI MỞ ĐẦU



Liposome là những hạt có cấu trúc hình cầu, bao gồm một nhân nước ở giữa, bao bọc bởi vỏ phospholipid gồm một hay nhiều lớp được mô tả lần đầu vào giữa những năm 60 bởi Bangham Trải qua hơn 40 năm tiếp tục nghiên cứu, phát triển và cải biến dạng ban đầu, liposome ngày càng được khẳng định là một hệ mang thuốc, phân phối thuốc hàng đầu, đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành các dạng thuốc nhằm cải thiện hiệu quả điều trị

Đầu tiên, thuốc có thể bao gói bên trong lớp lipid kép tạo môi trường tối ưu cho

sự ổn định của dược chất, được phân tán trong một môi trường có điều kiện tương tự điều kiện sinh lý của cơ thể Với cấu trúc đặc biệt của mình, liposome phù hợp làm chất mang cho cả dược chất thân nước và thân dầu Ngoài ra, khi nạp dược chất vào liposome, sự giải phóng thuốc có thể kéo dài và có kiểm soát hơn, kích thước nano có thể đưa thuốc tới đích một cách hiệu quả Hơn nữa, với cấu thành từ phospholipid và cholesterol, đây là những thành phần không độc, tương hợp sinh học, có ái lực tốt với

tế bào, không gây ra kháng nguyên, các phản ứng dị ứng và có khả năng phân hủy sinh học Vì thế, có thể coi liposome là một hệ mang thuốc lý tưởng tăng khả năng ổn định của dược chất được bao gói, tăng thời gian tuần hoàn, tăng hiệu quả điều trị, Bên cạnh đó, hệ mạng thuốc liposome trắng cũng tồn tại những khó khăn như phospholipid không bền về mặt hóa học nên ảnh hưởng tới độ ổn định của liposome Liposome dễ bị thanh thải bởi hệ thực bào, thời gian tuần hoàn khó kéo dài

Hiện nay, khối u ung thư hình thành trong cơ thể con người ngày càng nhiều và khó kiểm soát Các khối u trong cơ thể thường có pH rất thấp khoảng 5,5 Do vậy, để khắc phục các nhược điểm của liposome ta cần thay đổi phospholipid tự nhiên trong liposome trắng thành các phospholipid tổng hợp để tạo ra liposome nhạy cảm với pH Liposome nhạy với pH khi vào trong tế bào sẽ bị phá vỡ cấu trúc và dung hợp trong môi trường pH acid của thể endosome thứ cấp bên trong tế bào đích và làm tăng độ ổn định trong huyết tương của liposome Do vậy, đề tài “Tìm hiểu quy trình tổng hợp liposome nhạy pH và ứng dụng làm chất mang thuốc” được tiến hành nhằm mục đích nghiên cứu quy trình giảm và đồng nhất kích thước tiểu phân, khi kích thước tiểu phân giảm xuống có các tác dụng sau: tăng độ hoà tan và tăng sinh khả dụng của các phân

tử thuốc (các dược chất dưới dạng tinh thể nano làm tăng khả dụng đường uống); kích thước nano giúp liposome dễ dàng di chuyển vào bên trong hệ tuần hoàn của cơ thể người và tiếp cận những mục tiêu cần thiết Bên cạnh đó, ta nghiên cứu các ảnh hưởng của môi trường xung quanh đến đặc tính của liposome nhạy pH

1.1.2.1 Phospholipid

a) Khái niệm

Phospholipid là một loại lipid chứa phospho và là thành phần chính của tất cả các màng tế bào Chúng có thể tạo thành lớp màng kép lipid trong môi trường nước vì đặc tính lưỡng phần - một đầu ưa nước (phân cực) và một đầu kị nước (không phân cực)

b) Cấu trúc phân tử

Cấu trúc của phân tử phospholipid thường bao gồm hai axit béo, còn gọi là “đuôi

kị nước”, và một “đầu ưa nước” cấu tạo từ một nhóm phosphate Hai thành phần được nối với nhau bởi một phân tử glycerol Các nhóm phosphate có thể được sửa đổi với các phân tử hữu cơ đơn giản như choline, ethanolamin hoặc serine

Đầu

ưa nước

Đuôi kị nước

Phân tử phospholipid

Hình 1.2 Phân tử phospholipid

Phospholipid có 2 loại cấu trúc: cấu trúc mixel hình cầu và cấu trúc lớp kép

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử của phospholipid

c) Vai trò

Phospholipid cấu trúc tương đồng sinh học với tế bào sống, do đó an toàn, tăng khả năng vận chuyển thuốc, dễ xâm nhập vào các tổ chức đích Phospholipid là thành phần chính của liposome Mục tiêu trong bào chế là sử dụng phospholipid làm hệ mang thuốc có đặc tính tương hợp cao với mô và tế bào Vì vậy, sự hình thành các dạng chất mang từ phospholipid có ý nghĩa quan trọng để có thể mang thuốc và ổn định trong quá trình vận chuyển thuốc Tính lưỡng thân mang lại cho phospholipid sự

tự hình thành, khả năng nhũ hoá và thấm ướt Khi tiếp xúc với dung dịch nước, phần

Đuôi kị nước

Đuôi

kị

nước

Acid béo

Cấu trúc micel Cấu trúc lớp kép

thân nước được hydrat hoá, phần “đuôi” có xu hướng thu nhỏ lại, tạo thành kết tụ kiểu micel

Quy trình tổng hợp phospholipid được thực hiện như sau:

Giai đoạn 1: đun nóng dầu đến 45 ÷ 50 oC, vừa đun nóng vừa khuấy trộn với tốc

độ 3 vòng/ phút, cho từ từ nước nóng có cùng nhiệt độ hoặc dd NaCl 0,3 %, khuấy đều, thời gian từ 15 đến 20 phút để phản ứng chậm Lượng nước cho vào tùy từng loại dầu thực vật nhưng thường chiếm 0,5 ÷ 2 (so với khối lượng dầu) Giai đoạn 2: cho nước vào (0,5 ÷ 2 khối lượng dầu) tiếp tục khuấy trộn thêm

10 phút, để yên trong vòng 1 giờ Cặn lắng xuống dưới đáy, tháo cặn ra trước và tháo dầu ra sau Cặn thường lẫn nhiều dầu, xử lý thu hồi dầu và phospholipit

Giai đoạn 3: tách phospholipit ra khỏi dầu bằng máy sấy chân không: dầu được đun trong nồi hydat hóa đến 85 ÷ 92 o

C, cho hơi nước (khoảng 6 lượng dầu), sau đó hydrat hóa từ 30 đến 40 phút Đem dầu từ nồi hydrat hóa đi trích ly ở 60 oC cùng với lượng nước đã được đun nóng đến nhiệt độ đó (lượng nước khoảng 2 ÷ 4 % trọng lượng dầu) Kết tủa hydrat hóa và để lắng trong 8 giờ sau đó hút vào máy sấy chân không, sấy trong 12 giờ Ta có được thành phẩm phospholipid

Sơ đồ dưới đây tóm tắt quy trình tổng hợp phospholipid:

Sơ đồ 1.1 Quy trình sản xuất phospholipid

Lắng

Sấy chân không

Phospholipid tinh khiết

0,5÷2 % khối

lƣợng dầu

Kết tủa hydrat hóa

85 ÷ 92 oC Phospholipid lẫn trong dầu

H2O

1.1.2.2 Cholesterol

a) Khái niệm

Cholesterol là một chất béo steroid, mềm, màu vàng nhạt, có ở màng tế bào của tất cả các mô trong cơ thể, và được vận chuyển trong huyết tương của mọi động vật Cholesterol hiện diện với nồng độ cao ở các mô tổng hợp nó hoặc có mật độ màng dày đặc như ở gan, tủy sống, não

H+ và OH-, dẫn đến làm giảm trực tiếp phản ứng thủy phân phospholipid

b) Phân loại

Nguồn gốc nội sinh: cholesterol được sản xuất hàng ngày trong gan, mỗi ngày từ 1,5 g đến 2 g

Cholesterol

Nguồn gốc ngoại sinh: cholesterol được tạo ra từ việc ăn uống các chất mỡ động vật như lợn, bò, gà, vịt,

c) Phương pháp sản xuất

Cholesterol được tổng hợp chủ yếu từ acetyl Coenzim A (acetyl CoA) theo đường 3-hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzim A (HMG-CoA) ở nhiều tế

ở gan, các vị trí khác có tỉ lệ tổng hợp cao gồm ruột, thận và cơ quan sinh sản Với một người khoảng 68 kg, tổng lượng cholesterol trung bình trong cơ thể khoảng 35 g (35000 mg) Trong một ngày lượng nội sinh trung bình khoảng 1000 mg và từ thức ăn trung bình khoảng 200 đến 300 mg Cholesterol có thể được tổng hợp từ mỡ động vật

Có 3 giai đoạn tiến hành:

Giai đoạn 1: tổng hợp mevalonate từ 2 acetyl CoA, mỗi acetyl CoA có 2 carbon Carbon thứ 2 và thứ 3 của 2 phân tử này sẽ liên kết với nhau để tạo thành acetoacetyl CoA (4 carbon) với sự xúc tác của enzim thiolase Từ acetoactyl CoA và 1 phân tử acetyl CoA với sự xúc tác của enzim HMG-CoA synthase sẽ tạo ra HMG-CoA Sau

đó, khử HMG-CoA tạo ra acid mevalonic

Sơ đồ 1.2 Giai đoạn tổng hợp mevalonate

Giai đoạn 2: tổng hợp squalene từ acid mevalonic,với sự xúc tác của enzim mevalonate kinase tạo ra mevalonate-5-phosphate và giải phóng ATP Sau đó, enzim phosphomevalonate kinase xúc tác cho mevalonate-5-phosphate để tạo ra mevalonate-

isopentenyl-5-pyrophosphate (PP) với sự hỗ trợ của enzim pyrophosphate decarboxylase Sau đó, hợp chất dimethyllallyl-PP được tổng hợp từ isopentenyl-5-PP nhờ isopenteny-PP isomerase và đồng thời isopentenyl-5-PP kết hợp

mevalonate-5-Acetyl CoA

synthase

HMG-CoAHMG-CoA

reductase

Acetoactyl CoA

Khử

Acid mevalonic Khuấy trộn

với dimethyllallyl-PP để tạo ra geranyl PP với sự tác động của famesy-PP synthase và bisphosphonate Sau đó, dimethyllallyl-PP phản ứng với geranyl PP và tạo ra farnesy-

PP với sự xúc tác của famesy-PP synthase và bisphosphonates Squalene đƣợc hình thành do farnesy-PP nhờ xúc tác enzim squalene synthase

Sơ đồ 1.3 Giai đoạn tổng hợp squalene

Mevalonate- 5-pyrophosphate

Acid mevalonic

Phosphomevalonate

kinase

Mevalonate- 5-phosphate

Geranyl PP

Farnesy-PP

Famesy-PP synthase và Bisphosphonates

Giai đoạn 3: tổng hợp cholesterol: squalene sau khí được tổng hợp, dưới sự hỗ trợ của enzim squalene monoxygenase sinh ra 2,3 oxidosqualene Sau đó, 2,3 oxidosqualene tạo ra lanosterol và đồng thời giải phóng NADPH nhờ enzim squalene epoxydase Cuối cùng, từ lanosterol ta tiến hành tương tự 19 lần để tổng hợp được cholesterol

Sơ đồ 1.4 Giai đoạn tổng hợp cholesterol

1.1.3 Phân loại

Dựa vào kích thước và cấu trúc số lớp; thành phần cấu trúc lớp vỏ ta có thể phân loại liposome theo 2 cách sau:

1.1.3.1 Phân loại theo kích thước và cấu trúc số lớp

a) Liposome đơn lớp (ULV: Unilamellar vesicle)

Vỏ liposome đơn lớp chỉ có một lớp phospholipid Tùy theo kích thước mà có 4 loại: Loại nhỏ SUV (Small Unilamellar Vesicle) SUV có đường kính từ khoảng 20 ÷

50 nm, loại to LUV (Large Unilamellar Vesicle) có đường kính trên 50 nm, loại khổng

lồ GLV (Giant Unilamellar Vesicle) có đường kính trên 1000 nm

b) Liposome đa lớp (MLV: multilamellar vesicle)

Liposome đa lớp cấu tạo gồm nhiều lớp lipid và nhiều ngăn nước đồng tâm, kích thước 400 ÷ 3500 nm Gồm 3 loại: OLV (Oligo Lamellar Vesicle) có ít hơn 5 lớp lipid kích thước 100 ÷ 1000 nm, MLV có 5 ÷ 25 lớp lipid kích thước trên 500 nm, MVV (Multi Vesicular Vesicle) cấu trúc liposome kép (liposome trong liposome)

Khuấy trộn

Hình 1.6 Phân loại liposome dựa trên kích thước và cấu trúc số lớp phospholipid

1.1.3.2 Phân loại theo thành phần, chức năng hoặc tác dụng

Dựa vào thành phần, chức năng hoặc tác dụng, ta chia liposome thành những loại sau:

a) Liposome thông thường

Liposome mang điện âm hoặc trung hòa, thành phần gồm phospholipid tự nhiên

và cholesterol

b) Liposome nhạy cảm với pH (pH sensitive liposome)

Liposome nhạy cảm với pH có lớp vỏ bao gồm cholesterol và phospholipid tổng

hợp như: phosphatidylethanolamin (PE), dioleoylphosphatidyl ethanolamin (DOPE),

Liposome này có khả năng hoạt động trong môi trường pH thấp như ở mô khối u khoảng 5,5

c) Liposome nhạy cảm nhiệt độ (temperature sensitive liposome)

Liposome nhạy cảm nhiệt độ có thành phần gồm cholesterol và phospholipid

tổng hợp như phosphatidyl ethanolamine, dioleoyl phosphatidyl ethanolamine

liposome nhạy cảm với nhiệt độ nhanh chóng giải phóng dược chất khi nung nóng đến 41,3 oC và do đó có khả năng nhắm mục tiêu phân phối hóa trị liệu toàn thể cho mô tế bào khi kết hợp với chứng tăng thân nhiệt

d) Liposome từ tính (magnetic liposome)

Bề mặt liposome được bao bởi một lớp vỏ polymer có gắn các hạt nano từ tính

như oxit sắt Fe3O4 hay sắt dạng oxi hóa như γFe2O3 Trong một từ trường thay đổi, thay đổi hướng ngẫu nhiên từ hướng song song sang hướng đối cực, cho phép chuyển năng lượng từ thành dạng nhiệt, do đó làm tăng nhiệt độ tại các mô khối u Các mô tại khối u thường nhạy cảm với sự gia tăng nhiệt độ hơn các mô lành, vì thế đây là một hướng điều trị ung thư mới

e) Liposome mang điện dương

Liposome mang điện dương cấu tạo từ lipid mang điện dương như

1,2-dioleoyl-glycero-3-succinat (DOGS),

N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-Lipid kép

ULV

trimethylammonium (DOTAP), Liposome này có khả năng liên hợp với tế bào, màng tế bào, thích hợp dùng làm hệ phân phối thụ động các đại phân tử tích điện như DNA, RNA

f) Liposome tồn tại lâu trong hệ tuần hoàn (khó bị phát hiện)

Liposome có áo polyetylen glycol (PEG) bảo vệ ở ngoài và các chất hướng 5 đích sẽ được gắn vào đuôi các phân tử polyme bảo vệ hoặc gắn lên vỏ liposome Điều này giúp cho nó không bị phát hiện bởi các đại thực bào Qua đó, giúp tăng thời gian tồn tại trong máu, giảm tỷ lệ bị đào thải khỏi hệ tuần hoàn và bị lưu giữ ở gan và lá lách

g) Liposome miễn dịch

Liposome thông thường hoặc liposome tồn tại lâu trong hệ tuần hoàn có gắn một đoạn kháng thể đặc hiệu để giúp nó tương tác với các thụ thể mục tiêu và giải phóng thuốc tại mô đích

h) Liposome tuần hoàn lâu trong máu (tuần hoàn dài)

Liposome loại này có bề mặt bao phủ một lớp polyme thân nước, tương hợp sinh học nhằm tạo ra một lớp áo bảo vệ cho liposome tránh khỏi sự nhận diện của quá trình opsonin hóa và do đó làm giảm khả năng thải trừ liposome khỏi hệ tuần hoàn PEG là polyme hay được sử dụng để tạo ra liposome tuần hoàn dài trong máu

i) Liposome linh động (flexible liposome)

Liposome linh động là liposome đơn lớp nhỏ, được bào chế từ

phosphatidylcholin với sự có mặt của chất diện hoạt (Tween 80, muối mật, natri cholat, ) và ethanol, có tác dụng tăng thấm thuốc qua da, được ứng dụng nhiều trong

mỹ phẩm Liposome linh động có khả năng thấm qua lớp sừng còn được gọi là transferosome

1.1.4.1 Phương pháp Bangham (hydrat hóa màng film)

Phương pháp hydrat hóa màng film do Bangham đưa ra từ năm 1964, với các bước tiến hành:

Giai đoạn 1: tạo film: Hoà tan hỗn hợp lipid trong dung môi thích hợp Thường

sử dụng tỷ lệ 10 ÷ 20 mg lipid/ 1mL dung môi, bốc hơi dung môi bằng thiết bị phù hợp để tạo thành màng mỏng lipid Thường dùng thiết bị cất quay chân không để loại dung môi (có thể thu hồi dung môi) hoặc đông khô lipid vào từng lọ nhỏ Thời gian cất

quay để bốc hơi dung môi không chỉ nhằm mục đích làm khô lipid mà với dược chất thân dầu (nằm ở lớp lipid kép của liposome) thì dược chất thường được phối hợp và hoà tan vào dung môi hữu cơ cùng với các lipid Như vậy, quá trình bốc hơi dung môi cũng tạo điều kiện cho dược chất liên kết với lipid

Giai đoạn 2: hydrat hoá: hydrat hoá lipid với nước hoặc dung dịch đệm ở nhiệt

độ và thời gian thích hợp kết hợp quay tốc độ cao tăng hòa tan để tạo thành hỗn dịch liposome Quá trình hydrat hóa nên được tiến hành ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ chuyển pha của lipid Tc khoảng 10 oC nhằm đảm bảo tính linh động trong quá trình sắp xếp hệ mang thuốc, thông thường từ 50 ÷ 60 oC Thời gian hydrat hoá phụ thuộc vào loại phospholipid Thời gian đầu (khoảng 1 giờ) phải lắc hoặc quay với tốc độ cao, sau đó lắc hoặc quay tốc độ thấp hơn trong thời gian từ vài giờ

Môi trường hydrat hoá tuỳ theo loại phospholipid và mục đích mang thuốc có thể

là nước, dung dịch natri clorid 0,9 %, dung dịch đệm (citrat, phosphat, Hepes, ), dung dịch đường (glucose,dextrose, sucrose, ) Áp suất thẩm thấu của dung dịch đệm thường lựa chọn tương đồng với máu (290 mOsm/kg) để có thể ứng dụng vào in vivo Môi trường hydrat hoá có thể chứa muối, chất ổn định, dược chất,

Ưu điểm: phương pháp được tiến hành một cách đơn giản và dễ thực hiện Nhược điểm: liposome bào chế bằng phương pháp hydrat hoá màng mỏng

thường có kích thước lớn và đa lớp Một số phospholipid không có khả năng hydrat cao như phosphatidyl ethanolamin, dễ bị kết tụ lại tạo thành các liposome đa lớp nên cần có biện pháp khuấy trộn phù hợp Với phương pháp hydrat hoá film cần công đoạn tiếp theo là giảm và đồng nhất kích thước

Hình 1.7 Quá trình bào chế liposome bằng phương pháp hydrat hóa màng film

1.1.4.2 Phương pháp tiêm ethanol

Phương pháp tiêm ethanol được Batzri và Korn mô tả năm 1973, còn được gọi là phương pháp pha loãng ethanol hay tiêm ethanol

Quy trình bào chế gồm các bước: hòa tan phospholipid và các thành phần tạo màng vào ethanol, bơm nhanh dung dịch này vào môi trường nước cất hoặc hệ đệm TRIS - HCl, kết hợp khuấy trộn Do thay đổi dung môi nên tạo thành các SUV có kích thước khoảng 25 nm Sau đó, hỗn hợp được lọc để loại ethanol và tinh chế liposome Liposome thu được có kích thước nhỏ (30 ÷ 110 nm) khá đồng nhất mà không phải

Dung môi

Dung dịch đệm

Giảm kích thước

Dung dịch đệm Dung môi

Hydrat hóa Film lipid

Lipid + dung môi

Ưu điểm: dung môi không quá độc như etanol và dễ dàng mở rộng quy mô

Phương pháp này đơn giản, chỉ cần một bước tiến hành, có thể thực hiện liên tục và có khả năng kiểm soát kích thước dựa vào tỉ lệ EtOH/H20 và nhiệt độ

Nhược điểm: etanol có thể còn lẫn trong liposome nếu không có bước loại bỏ và

không phải tất cả các lipid đều tan trong etanol

1.1.4.3 Phương pháp tiêm ete

Phương pháp tiêm ete do Deamer và Bangham thực hiện

Hòa tan dược chất trong nước, đun cách thủy để duy trì nhiệt độ khoảng 55 ÷ 65

oC Hòa tan các thành phần tạo màng liposome vào ete hoặc dietyl ete/ metanol Bơm

từ từ dung dịch ete vào dung dịch nước từ phía đáy, khi tiếp xúc với pha nước, ether sẽ bốc hơi dưới áp suất giảm tạo thành liposome không đồng nhất có kích thước 200 -

1000 nm

Ưu điểm: phương pháp tiến hành nhanh chóng và dễ dàng

Nhược điểm: hiệu suất tạo liposome thấp, dược chất phải tiếp xúc với nhiệt độ

và dung môi, có thể ảnh hưởng tới độ ổn định của chế phẩm

1.1.4.4 Phương pháp bốc hơi pha đảo (Reverse – phase evaporation method)

Phương pháp bốc hơi pha đảo sử dụng các dung môi hữu cơ như diethyl ete/ isopropyl ete hoặc hỗn hợp của diethyl ete: chloroform (1:1 v/ v) và hỗn hợp của chloroform: methanol (2:1 v/ v) hòa tan phospholipid Tiến hành bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm Hòa tan trở lại hỗn hợp các thành phần bằng một dung môi không trộn lẫn được với nước Để tạo mixel đảo, thêm pha nước và siêu âm trong khoảng thời gian thích hợp cho đến khi tạo thành hệ phân tán dạng nhũ tương nước trong dầu Các mixel đảo có cấu trúc gồm phospholipid đơn lớp bao quanh nhân nước Sau đó, bốc hơi từ từ dưới áp suất giảm để loại dung môi hữu cơ, khi đó các mixel sát nhập vào nhau, hệ chuyển sang trạng thái gel Tiếp tục quá trình bốc hơi dung môi, khi đạt tới điểm giới hạn, trạng thái gel bị bẻ gẫy, các mixel bị phá vỡ phospholipid tái sắp xếp tạo cấu trúc lipid kép và hình thành liposome

Ưu điểm: tỷ lệ đóng gói dược chất cao, phù hợp để bào chế liposome mang các

chất có cấu trúc phân tử cồng kềnh, kích thước lớn như albumin

Nhược điểm: tạo ra các liposome có kích thước lớn, không đồng nhất, trong quá

trình bào chế sử dụng nhiều dung môi hữu cơ, cần có biện pháp loại và kiểm soát dung môi tồn dư và những khó khăn để mở rộng quy mô

Hình 1.8 Cơ chế hình thành liposome bằng phương pháp bốc hơi pha đảo

1.1.4.5 Phương pháp bốc hơi pha đảo siêu tới hạn

Phương pháp bốc hơi pha đảo siêu tới hạn do Otake và các công sự tìm ra vào năm 2001

Chất lỏng siêu tới hạn là chất lỏng không ngưng tụ, rất dày đặc ở nhiệt độ và áp suất nhất định bằng hoặc vượt quá điểm tới hạn Khi đó sự khác biệt giữa pha lỏng và pha khí không tồn tại, pha lỏng và pha khí nằm cân bằng tạo thành một pha duy nhất - chất lỏng siêu tới hạn Chất lỏng siêu tới hạn có nhiều đặc tính khác biệt so với các chất lỏng truyền thống Đáng chú ý là carbon dioxide siêu tới hạn (scCO2) là một chất thay thế dung môi hữu cơ với những ưu điểm như chi phí thấp, không độc và không dễ cháy, nhiệt độ và áp suất tương đối thấp (31 oC và 73,8 bar) với các tính chất hòa tan tương tự như các dung môi không phân cực

Năm 2001, Otake và các cộng sự lần đầu tiên đưa phương pháp bào chế bằng phương pháp bốc hơi pha đảo siêu tới hạn sử dụng scCO2 làm dung môi để hòa tan lipid Nhiệt độ tăng lên (lớn hơn 37 oC) để đạt được nhiệt độ chuyển pha của phospholipid và nhiệt độ siêu tới hạn của CO2 Áp suất cũng được giữ trên giá trị siêu tới hạn Sau vài giây để đạt được cân bằng, một dung dịch nước của dược chất được đưa vào trong bình chịu áp suất lớn qua bơm cao áp (bơm HPLC), cho đến khi đạt được đủ dung dịch Cuối cùng, áp suất giảm xuống 73,8 bar (áp suất tới hạn của CO2)

để giải phóng CO2 và sự phân tán liposome đồng nhất được hình thành

Dung dịch lipid

trong dung môi

Hệ 2 pha, lớp lipid đơn

Hệ nhũ tương

Hình 1.9 Hệ thống phương pháp bốc hơi pha đảo siêu tới hạn

Nhược điểm: thuốc tẩy có thể còn lẫn trong liposome, được tiến hành qua nhiều

bước và đòi hỏi nhiều thời gian để bào chế

Ngoài ra còn có thể bào chế liposome theo một số phương pháp khác:

Phương pháp đông khô (freeze-dryzing/ lyophylization method)

Phương pháp dùng chất diện hoạt không ion hóa (niosome)

Phương pháp loại nước và bù nước (dehydration and rehydration)

1.1.5 Phương pháp giảm kích thước tiểu phân

Do các phương pháp sản xuất liposome đều tạo ra liposome có kích thước lớn và không đồng nhất Vậy nên, yếu tố kích thước của liposome cũng là khía cạnh cần chú

ý để có thể đạt được hiệu quả chữa trị mong muốn Sau khi được tổng hợp, liposome được xử lí để làm giảm và đồng nhất về kích thước bằng các phương pháp sau:

1.1.5.1 Phương pháp siêu âm

Liposome đa lớp kích thước lớn có thể phân chia và tái tạo thành các liposome đơn lớp kích thước nhỏ nhờ năng lượng siêu âm Có 2 loại thiết bị siêu âm áp dụng giảm kích thước liposome dựa trên nguyên tắc trực tiếp và gián tiếp Thiết bị siêu âm trực tiếp là đưa đầu/ que vào hỗn dịch, còn nguyên tắc gián tiếp là cho hỗn dịch liposome vào ống hay cốc rồi đặt vào bể hoặc đổ hỗn dịch vào bể siêu âm Siêu âm trực tiếp cho hiệu quả cao nhưng chỉ tác dụng với thể tích nhỏ và dễ làm nóng hoặc đưa tạp vào mẫu, còn bể siêu âm có thể áp dụng cho lượng lớn mẫu nhưng hiệu quả giảm và đồng nhất kích thước không cao do khó kiểm soát được thông số sóng siêu

âm Phương pháp siêu âm có rất nhiều các yếu tố ảnh hưởng đến kích thước và độ ổn

định của liposome như cường độ và biên độ sóng siêu âm, nhiệt độ (trên Tc của phospholipid), thể tích mẫu, bề dày hệ phân tán so với đầu phát siêu âm

Ưu điểm: rất đơn giản và dễ dàng thực hiện

Nhược điểm: kích thước liposome không đồng nhất và khó lặp lại điều kiện thí

nghiệm

1.1.5.2 Phương pháp nén/ đẩy qua màng

Nguyên tắc của phương pháp là nén/ đẩy liposome qua màng (polycarbonat) có kích thước lỗ xốp phù hợp đó là liposome đa lớp lớn có thể biến dạng và trở thành liposome đơn lớp hoặc nanoliposome tuỳ theo kích thước của màng Thông thường cần đẩy nhiều chu kỳ và sử dụng màng có kích thước từ lớn đến nhỏ dần Ở qui mô nhỏ, sử dụng thiết bị cầm tay Với quy mô lớn, sử dụng thiết bị nén áp suất cao với khí trơ Đồng nhất hoá áp suất cao dựa trên nguyên tắc sử dụng áp suất làm nhiễu loạn dòng chảy của hệ phân tán, tăng tốc độ va chạm của các giọt dẫn tới các tiểu phân được phân chia nhỏ hơn

Ưu điểm: so sánh giữa phương pháp siêu âm và phương pháp đẩy qua màng với

thể tích nhỏ cho thấy phương pháp siêu âm có thể nhanh chóng cho kích thước nhỏ, còn phương pháp đẩy qua màng cần lặp lại nhiều chu kỳ mới giảm được kích thước nhưng độ đồng nhất cao hơn

Nhược điểm: phương pháp siêu âm sử dụng đầu dò kim loại có thể giải phóng

các hạt titanium vào các mẫu

Hình 1.10 Thiết bị đùn bằng tay mini extruder và thiết bị nén/ đẩy dưới áp suất cao

1.1.5.3 Phương pháp đông lạnh - giải đông (freeze- thawed)

Liposome kích thước lớn được làm lạnh nhanh sau đó được rã đông từ từ, quá trình này lặp đi lặp lại nhiều lần tạo thành các liposome kích thước nhỏ hơn Nguyên lí

13 của phương pháp dựa trên sự phá vỡ cấu trúc màng của liposome khi bị đông lạnh

và tan chảy liên tục

Ưu điểm: đơn giản và dễ thực hiện

Nhược điểm: phải qua nhiều bước tiến hành và tốn nhiều thời gian

1.1.5.4 Phương pháp vi hóa lỏng (microfluidization)

Phương pháp vi hóa lỏng lần đầu tiên được đưa ra bởi Mayhew và cộng sự vào

năm 1984 áp dụng quy mô sản xuất công nghiệp

Phương pháp này cho phép đồng nhất hóa hệ phân tán liposome MLV bằng cách cho chảy qua phễu lọc kích thước lỗ khoảng 5 micromet dưới áp suất cao (10000 psi) trong một buồng tương tác Sau đó các tiểu phân sẽ di chuyển qua hai ống nhỏ ở tốc độ cao trên 500 m/ s rồi đổ dồn về cùng một buồng chứa Sự va chạm tạo nên quá trình

sản sinh, chuyển đổi năng lượng cao, làm bẻ gãy các tiểu phân MLV thành SUV có

kích thước đồng nhất Sau 5 ÷ 10 chu kì sẽ thu được các SUV có kích thước khoảng

100 nm

Ưu điểm: tạo ra liposome có kích thước đồng nhất, có khả năng lặp lại và quá

trình có thể diễn ra liên tục

Nhược điểm: liposome có thể bị phá hủy, không kiểm soát được kích thước nếu

muốn tạo các liposome kích thước lớn

1.1.6 Lĩnh vực ứng dụng

Liposome như một hệ vận chuyển thuốc tới đích mang tiềm năng lớn, với những ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực dược phẩm, tiêu biểu đó là:

 Bảo vệ các phân tử thuốc nhạy cảm (DNA, RNA, oligo-nucleotide)

Tăng cường sự hấp thu nội bào (chống ung thư, kháng khuẩn)

Thay đổi dược động học và phân bố sinh học (giải phóng kéo dài với những thuốc có thời gian bán thải ngắn như insulin)

Nâng cao sự hấp thu thuốc (Amphotericin B, Minoxidil, Paclitaxels, Cyclosporins)

Trong đó một số lĩnh vực đã thu được các kết quả đáng khả quan như: Hóa trị liệu ung thư, bào chế liposome phun mù, kháng sinh trị liệu, enzyme trị liệu, vận chuyển DNA trong liệu pháp gene, ứng dụng trong miễn dịch trị liệu sản xuất vaccine

và kháng nguyên, các thuốc dùng trong nhãn khoa,

1.1.6.1 Ứng dụng của liposome trong điều trị ung thư

Ung thư đang trở thành mối nguy hại đe dọa đến sức khỏe con người Hiện nay trên thế giới có khoảng 23 triệu người đang sống chung cùng căn bệnh này và Việt Nam đang nằm trong 50 nước thuộc top 2 của bản đồ ung thư (WHO) Các điều trị lâm sàng nhằm tiêu diệt cũng như ngăn ngừa sự phát triển, lan rộng của khối u hiện nay phổ biến đó là phẫu thuật, xạ trị và hóa trị liệu Những biện pháp này có thể loại bỏ hoàn toàn tế bào ung thư nhưng cũng có nguy cơ gây tổn thương các cơ quan và các

mô lành xung quanh, gây ra các tác dụng phụ không mong muốn

Các thuốc sử dụng điều trị ung thư cũng là mối quan tâm lớn hiện nay Đáng kể đến là các hoạt chất như: doxorubicin, cerubidin, fucoidan, Tuy nhiên, một số rào cản sinh lý có thể ngăn các tác nhân tích lũy tại vị trí các khối u dẫn đến hiệu quả phân phối thấp, hiệu quả điều trị không cao Ngoài ra sự phân phối không chọn lọc của các

thuốc điều trị này đến các mô ung thư và các mô thường.Vì vậy mà các phân tử thuốc

tự do không thể đưa tập trung vào các mô khối u, đạt nồng độ hiệu quả để có tác dụng

Ví dụ chỉ có dưới 0,1 phân tử thuốc tiêm được tìm thấy trong 1 gam mô khối u càng cho thấy sự phân phối không hiệu quả của chúng Khi các phân tử này được đóng gói trong cấu trúc liposome thì sự tích tụ tại khối u tăng gấp 2 ÷ 3 lần Các thuốc được đóng gói trong liposome dễ dàng tăng khả năng tuần hoàn trong máu đồng thời tăng cường lắng đọng tại các khối u, bảo vệ thuốc tránh các quá trình chuyển hóa cũng như

là phân phối thuốc đến các mô ung thư, hạn chế đến các mô lành, tăng cường hấp thu trong các cơ quan giàu đơn bào, đại thực bào đơn nhân và hệ thống lưới nội môi (gan,

lá lách, tủy xương) và giảm hấp thu tại thận, cơ tim và não Để đạt mục tiêu là các khối

u, liposome phải tồn tại lâu trong vòng tuần hoàn máu, tiếp cận khối u theo cơ chế thụ động bằng cách đi qua các khe hở thành mạch của các mô ung thư và cuối cùng là tập trung tại các mô đích Khả năng tập trung tại mô đích của các liposome này được gọi

là hiệu ứng tăng tính thấm và tính lưu giữ (enhance permeability and retention EPR)

effect-Hình 1.11 Khả năng tập trung tại mô đích của liposome dựa trên hiệu ứng EPR

Hiệu ứng EPR dựa trên sự khác biệt giữa cấu trúc của các mô ung thư và các mô thường Các khối u thường chứa một lượng lớn các mao mạch giữa các tế bào nội mô Các mạch máu nuôi khối u thường có hình dạng bất thường và có những khe hở Các khe hở của lớp tế bào lót màng trong mạch máu thường có đường kính vượt quá 400

nm Các phân tử thuốc liposome có đường kính nhỏ hơn 400 nm sẽ vượt qua được những khe hở này đi vào khối u và phóng thích thuốc Kích thước các khe hở ở những mạch máu của các mô bình thường có đường kính nhỏ hơn 10 nm, không cho các phân

tử thuốc liposome đi qua Vì vậy, ngăn chặn thuốc đến các mô lành và gây hại Chính nhờ đặc tính này mà các hạt kích thước nano có thể dễ dàng thoát mạch và tích tụ tại khối u Ngược lại các mô bình thường các tế bào nội mô kết hợp chặt chẽ dẫn đến ngăn ngừa sự khuếch tán của các hạt nano bên ngoài các mạch máu

Mô thường Mạch máu