Báo cáo đồ án hóa sinh

Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, nguyên vật liệu Một số thiết bị thường dùng trong phòng thí nghiệm khác Dung dịch glucose 1% Dung dịch Maltose 1% Dung dịch Sucrose 1% Thuốc thử Barfoed Dun

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ CẦN THƠ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM – CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC TẬP HỌC PHẦN: HÓA SINH

Lớp: CNTP0116

ThS.Đỗ Dương Phương Nam Trần Kim Anh

CẦN THƠ 03/2019

MỤC LỤC

Bài 1 CARBOHYDRATE 3

I Mục tiêu 3

II Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, nguyên vật liệu 3

III Nội dung 3

1 Phân biệt giữa monosaccharide và disaccharide (phản ứng Barfoed) 3

2 Định lượng Monosaccharide bằng phương pháp so màu với thuốc thử DNS 5

3 Định lượng amylose và amylopectin 6

Bài 2 PROTEIN 8

I Mục tiêu 8

II Thiết bị, dụng cụ, nguyên vật liệu, hóa chất 8

III Kết tủa protein 8

1 Kết tủa thuận nghịch 8

2 Kết tủa bất thuận nghịch: 8

3 Tiến hành thí nghiệm: 8

4 Định lượng protein theo phương pháp Biuret 10

Bài 3 LIPID 12

I Mục đích 12

II Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, nguyên vật liệu 12

III Nội dung 12

1 Xác định chỉ số peroxyde 12

2 Chỉ số acid 13

3 Khảo sát đặc tính của Lecithin 14

Bài 4 VITAMIN 16

I Mục tiêu: 16

II Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, nguyên vật liệu: 16

III Nội dung: 16

1 Định lượng vitamin B 1 bằng phản ứng với thuốc thử diazo: 16

2 Định lượng vitamin C 17

Bài 5 ENZYME 20

I Mục tiêu 20

II Thiết bị, dụng cụ, nguyên vật liệu, hóa chất 20

III Xác định hoạt tính của enzyme amylase 20

3.1 Đo hoạt tính enzyme amylase 20 3.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ cơ chất lên tốc độ thủy phân của enzyme 22 3.3 Khảo sát enzyme urease trong bột đậu nành 23

Bài 1 CARBOHYDRATE

I Mục tiêu

- Phân biệt giữa monosaccharide và disaccharide (phản ứng Barfoed)

- Định lượng monosaccharide bằng phương pháp so màu với thuốc thử DNS

- Định lượng amylose và amylopectin

II Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, nguyên vật liệu

Một số thiết bị thường dùng trong phòng thí nghiệm khác

Dung dịch glucose 1%

Dung dịch Maltose 1%

Dung dịch Sucrose 1%

Thuốc thử Barfoed Dung dịch Fehling Thuốc thử DNS Amylose tinh khiết Glucose tinh khiết Dung dịch trichloro acetic acid (TCA) 0.6%

Dung dịch NaOH 1N Ethanol

Dung dịch iod 0,01N Cồn 90o

Bột gạo Dưa hấu

III Nội dung

1 Phân biệt giữa monosaccharide và disaccharide (phản ứng Barfoed)

a) Nguyên tắc:

Khả năng khử của những monosaccharide có thể lớn hơn nhiều khả năng khử của disaccharide nên thay đổi môi trường base bằng môi trường acid yếu để phân biệt monosaccharide và disaccharide

Đun cách thủy các ống nghiệm trong 5 phút, 75oC Làm lạnh, quan sát ống có trầm hiện

đỏ Đun tiếp 8 phút, quan sát ống có trầm hiện đỏ

c) Kết quả thí nghiệm

a Thuốc thử barfoed b Thuốc thử fehling

Hình 1 Kết quả thí nghiệm sau khi đun ở 75 o C

 Theo kết quả ta thấy: ở thuốc thử Barfoed chỉ có ống nghiệm chứa glucose (1A) là xuất hiện trầm đỏ, còn ở thuốc thử Fehling có 2 ống nghiệm xuất hiện trầm đỏ là ống chứa glucose và ống chứa maltose (1B và 2B)

⟶ Giải thích hiện tượng:

 Với thuốc thử Barfoed

Trong thành phần của thuốc thử Barfoed có chứa Cu2+, các đường sẽ tác dụng với ion Cu2+ có trong thuốc thử tạo thành phức màu xanh

+ Ở ống nghiệm chứa glucose và ống nghiệm chứa maltose sẽ xuất hiện kết tủa đỏ gạch Trong phân tử glucose có chứa nhóm chức CHO sẽ phản ứng với ion Cu2+ tạo kết tủa màu đỏ gạch (Cu2O) bám trên thành ống và đáy ống nghiệm

+ Ở ống nghiệm chứa maltose sau khi thủy phân tạo thành 2 gốc glucose phản ứng với Cu2+ tạo kết tủa màu đỏ gạch (Cu2O)

+ Sucrose là một disaccharide có cấu tạo từ hai monosaccharide là glucose và fructose liên kết với nhau từ hai nhóm OH glucoside nên không có tính khử do đó không khử Cu2+ thành Cu2O nên màu của dung dịch giữ nguyên

 Thuốc thử Fehling:

+ Ở ống 1B, Glucose khử sẽ khử Cu2+ của thuốc thử Fehling thành Cu+ (màu đỏ

gạch)

+ Ở ống 2B, Vì Maltose là disaccharide có chứa hai góc 𝛼 – Glucopiranose liên

kết với nhau bởi nhóm OH ở vị trí C1 và C4 nên trong phân tử còn một nhóm OH

Glycoside vì vậy mà nó có tính khử, sẽ khử Cu2+ của thuốc thử Fehling thành Cu+

có màu đỏ gạch (trong môi trường base)

+ Ở ống 3B, do Sucrose không có tính khử nên không tạo lớp trầm (Cu+) ở đáy

ống nghiệm

2 Định lượng Monosaccharide bằng phương pháp so màu với thuốc thử DNS

a) Nguyên tắc

Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử acid

dinitrosalicylic (DNS) Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ

đường khử trong một phạm vi nhất định

So màu tiến hành ở bước sóng 540 nm Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh

khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử theo mẫu nghiên cứu

b) Tiến hành

- Cân một lượng mẫu nhất định, giã nhuyễn và cho vào cốc 100 ml Thêm vào cốc 10 ml

cồn 90o Đun sôi 1 lần, sau đó lấy phần nước trong Cho bay hơi hết phần cồn trong dung

dịch bằng cách cô cạn Rồi thêm vào 30 ml nước cất Cho toàn bộ dung dịch vào bình

định mức 100 ml, thêm 1 ml chì acetate và 2 ml natri sunfat Dùng nước cất định mức

cho đến vạch rồi lọc Ta có dịch đường phân tích

- Xây dựng đường chuẩn  Chuẩn bị dung dịch Glucose gốc 10 mg/ml  Chuẩn bị các dung dịch như bảng sau: Bước 1 Bước 2

Ống nghiệm Dung dịch Nước cất Thuốc thử DNS Nước cất Nồng độ glucose Glucose (ml) (ml) (ml) (mg/ml)

(ml)

1 0,0 1,0 1,0 3,0 0

2 0,2 0,8 1,0 3,0 2

3 0,4 0,6 1,0 3,0 4

4 0,6 0,4 1,0 3,0 6

5 0,8 0,2 1,0 3,0 8

6 1,0 0,0 1,0 3,0 10

Sau khi hoàn thành các chất ở bước 1 thì đun sôi trong 5 phút và làm nguội

Khi dung dịch trong ống nghiệm nguội thì cho tiếp 3 ml nước cất như bước 2 và đo độ

hấp thu của dãy dung dịch chuẩn ở bước sóng 540 nm để được đường chuẩn

- Đo mẫu và tính toán kết quả: cho vào ống nghiệm 1 ml dịch đường đã chuẩn bị ở trên

và 1 ml thuốc thử DNS Đun sôi hỗn hợp trong 5 phút, để nguội Thêm 3 ml nước cất,

đo độ hấp thu ở bước sóng 540 nm và so sánh với đường chuẩn để được nồng độ đường phân tích

- Công thức tính hàm lượng đường khử (mg%) =𝑋×100×100

𝑚 Với:

X: Hàm lượng đường khử từ kết quả đo (mg/ml)

m: Khối lượng mẫu (g)

c) Kết quả thực nghiệm

 Hàm lượng đường khử đo được ở mẫu 1 g có nồng độ là 1,645 (mg/ml)

 Hàm lượng đường khử đo được ở mẫu 2 g có nồng độ là 0,9326 (mg/ml)

Phương trình đường chuẩn: y = a + bx = 2,491x

- Xây dựng đường chuẩn với các nồng độ khác nhau của amylose

Pha dung dịch amylose gốc với nồng độ 2 mg/ml trong dung dịch NaOH 1N Từ dung dịch gốc, pha dãy dung dịch có nồng độ từ 0 – 2 mg/ml

Bố trí thí nghiệm như sau:

- Xác định ẩm độ của mẫu (bột gạo)

- Chuẩn bị mẫu: cân chính xác 15 mg mẫu bột gạo Thêm 5 ml dung môi (etanol) để trích ly chất béo Đun cách thủy 60oC trong 30 phút Ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 15 phút, lấy phần cặn lắng Lặp lại bước trích ly trích béo một lần nữa Phần cặn lắng thêm 2 ml NaOH 1N và 4 ml nước Đun cách thủy ở 95oC trong 30 phút

- Tiến hành đo: dùng micropipette hút 100 𝜇𝑙 dung dịch mẫu đã chuẩn bị ở trên cho vào ống nghiệm, thêm 5 ml dung dịch TCA 0,6 % và 150 𝜇𝑙 dung dịch Iod 0,01 N, lắc đều các ống và để yên 20 phút Đo ở bước sóng 620 nm

c) Tính toán kết quả:

- Hàm lượng amylose (%) = 𝑋×6×100

𝑚Với:

X: nồng độ amylose được suy ra từ đồ thị chuẩn (mg/ml)

m: khối lượng của gạo (theo căn bản khô)

- Kết quả thực nghiệm:

Phương trình đường chuẩn: y = 7,127x

R2 = 0,9387

Nồng độ amylose đo được là 0,6175 (mg/ml)

Vậy hàm lượng amylose = 𝑋×6×100

𝑚 = 0,6175×6×100

16,5 = 22,45 (%)

Bài 2 PROTEIN

I Mục tiêu

- Quan sát, ghi nhận, nhận xét và giải thích các hiện tượng kết tủa protein

- Định lượng protein bằng phương pháp quang phổ

II Thiết bị, dụng cụ, nguyên vật liệu, hóa chất

- Dung dịch NaCl 10% và NaCl bão hòa

- Dung dịch BSA

- Lòng trắng trứng

III Kết tủa protein

1 Kết tủa thuận nghịch

Nguyên tắc: sự hòa tan của protein phụ thuộc vào pH, dung môi và nhiệt độ Khi

thay đổi các điều kiện này, độ hòa tan của protein sẽ bị thay đổi, kết tủa thuận nghịch hoặc kết tủa bất thuận nghịch

Kết tủa thuận nghịch: một số tác nhân khi thêm vào dung dịch keo protein có khả năng kết tủa protein mà không mất đi các hoạt tính và khi loại bỏ các tác nhân này, protein lại có khả năng hòa tan vào dung dịch tạo keo Hiện tượng này được gọi là kết tủa thuận nghịch và được ứng dụng để chiết tách, thu nhận enzyme và protein

2 Kết tủa bất thuận nghịch:

Nguyên tắc: kết tủa bất thuận nghịch của protein thường liên quan đến sự biến

tính Khi cấu trúc bậc 2, 3, 4 bị phá vỡ vĩnh viễn, protein sẽ mất đi các tính chất lý hóa và các chức năng sinh học Các yếu tố gây kết tủa bất thuận nghịch protein bao gồm acid hữu cơ, acid vô cơ đậm đặc ( H2SO4, HCl, HNO3…), muối kim loại nặng, nhiệt độ…

3 Tiến hành thí nghiệm:

Chuẩn bị 6 ống nghiệm như sau:

 Ống 1: 1 ml albumin + 4 ml NaCl 10%

 Ống 2: 1 ml albumin + 2 ml (NH4)2SO4 bão hòa

 Ống 3: 1 ml albumin + 2 ml (NH4)2SO4 bán bão hòa

 Ống 4: 1 ml albumin + HCl 0,5 N (từng giọt một đến khi có kết tủa thì ngưng) + (NaOH đến khi tủa tan) + CuSO4 (từng giọt)

 Ống 5: 1 ml albumin và đun cách thủy

 Ống 6: 1 ml albumin + từng giọt sulfosalicylic

Quan sát hiện tượng và giải thích:

Hình 1 Phản ứng kết tủa bất thuận nghịch của protein

 Ống 1: ban đầu thấy kết tủa tạo ra sau đó tủa tan

⟶ Giải thích: Vì NaCl là chất điện ly mạnh tạo ra ion Na+ và Cl+ trung hòa

về điện với các phân tử protein tạo kết tủa Sau một thời gian kết tủa tan do trong dung dịch lòng trắng trứng lúc này có chứa cả albumin và globulin chưa tách ra được

 Ống 2 và ống 3: khi cho (NH4)2SO4 bán bão hòa và (NH4)2SO4 bão hòa vào thì thấy trong dung dịch xuất hiện kết tủa trắng

⟶ Giải thích: ở điều kiện thường, albumin tồn tại ở trạng thái lơ lững, bên ngoài được bao bởi một lớp vỏ hydrate Khi cho (NH4)2SO4 vào dung dịch, (NH4)2SO4 phân ly tạo ion NH4+ và SO42-, các ion này trung hòa các tiểu phân tích điện trong phân tử albumin làm mất lớp vỏ hydrate cũng như trung hòa về điện tích vì vậy các phân tử protein có thể liên kết được với nhau, tạo

ra kết tủa

 Ống 4: ban đầu khi cho HCl vào thì thấy xuất hiện kết tủa trắng, sau đó thêm NaOH thì kết tủa tan dần tạo dung dịch màu vàng nhạt, tiếp tục cho thêm CuSO4 thì thấy xuất hiện phức màu tím

⟶ Giải thích: khi cho các acid vô cơ mạnh vào, các acid này có tính háo nước chúng sẽ lấy nước của dung dịch protein trứng làm cho protein bị biến tính, protein bị khử nước và trung hòa điện tích gây kết tủa NaOH khi cho vào môi trường sẽ trung hòa lượng acid, đồng thời tạo môi trường kiềm, kết tủa tan dần trở lại nên khi cho CuSO4 thì protein có liên kết –CO-NH- sẽ tác dụng với Cu+ trong môi trường kiềm tạo phức màu tím (phản ứng biuret)

 Ống 5: dung dịch sau khi đun có màu trắng đục (đông tụ)

⟶ Giải thích: dưới tác dụng của nhiệt độ, protein bị dãn mạch do đó cấu trúc

bị thay đổi, dẫn đến hiện tượng đông tụ

 Ống 6: khi cho từng giọt acid sulfosalicylic vào thấy kết tủa trắng đục xuất hiện trong ống nghiệm

⟶ Giải thích: dưới tác dụng của Sulfosalicylic cấu trúc hóa học của protein

bị phá vỡ khiến protein mất đi các tính chất hóa lý và chức năng sinh học nên tạo kết tủa

4 Định lượng protein theo phương pháp Biuret

* Nguyên tắc:

Trong môi trường kiềm, các hợp chất có chứa nhóm –CONH, CSNH, C(NH)NH2 sẽ có phản ứng với Cu2+ tạo phức màu tím Cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong dung dịch Từ đó dùng phương pháp so màu ở bước sóng 550 nm

-* Tiến hành:

- Chuẩn bị dãy dung dịch protein chuẩn có nồng độ tăng dần từ 0 – 20 mg/ml

pha trong dung dịch protein gốc (BSA 20mg/ml) với 6 ống nghiệm như sau:

Bảng 1 Bố trí thí nghiệm định lượng protein theo phương pháp Biuret

Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 Nồng độ dung dịch (mg/ml) 0 4 8 12 16 20

Thể tích dung dịch protein chuẩn 0 100 200 300 400 500

Thể tích dung dịch NaCl 0,9% 500 400 300 200 100 0 Thể tích nước cất (ml) 1 1 1 1 1 1 Thuốc thử Biuret (ml) 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5

- Chuẩn bị mẫu phẫn tích (ống nghiệm mẫu):

Cho vào ống nghiệm: 500 𝜇𝑙 dung dich protein trứng + 1 ml nước cất + 3,5 ml thuốc thử Biuret

Lắc đều các ống nghiệm, để yên 20 phút Quan sát màu dung dịch trong các ống nghiệm

Đo độ hấp thu các ống nghiệm dung dịch chuẩn ở bước sóng 550 nm và vẽ đường chuẩn Sau đó đo độ hấp thu dung dịch trong ống nghiệm mẫu và dựa vào đường chuẩn để suy ra nồng độ protein trong mẫu

- Tính kết quả

Hàm lượng protein trong lòng trắng trứng được tính theo công thức:

X = (50 x C x 100)/m

Với:

X: hàm lượng protein trong lòng trắng trứng (mg/100g)

C: nồng độ protein hiển thị trên máy (mg/ml)

m: khối lượng lòng trắng trứng đem phân tích (g) – 500 𝜇𝑙

 Kết quả sau khi đo: C = 6,238 (mg/ml)

Khối lượng mẫu đem đi phân tích: 3,0647 g

Bài 3 LIPID

I Mục đích

Giúp sinh viên nắm được cách xác định các chỉ số đánh giá chất lipid (chỉ số peroxide và chỉ số acid) và khảo sát đặc tính của lecithin

II Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, nguyên vật liệu

a) Nguyên tắc:

- Trong không khí hoặc trong các điều kiện có oxi, các acid béo đặc biệt là các acid béo không no dễ dàng bị oxy hóa tạo thành các peroxyde, gây ra hiện tượng ôi hóa của chất béo Để khảo sát mức độ ôi hóa của chất béo, cho iodua kali tác dụng với peroxyde giải phóng ra iod, sau đó chuẩn iod bằng dung dịch thiosulfate natri

- Phản ứng này xảy ra trong môi trường acid vì trong môi trường kiềm iod tạo thành sẽ tác dụng với kiềm

b) Tiến hành:

- Cân 3g mẫu chất béo vào bình tam giác, thêm vào 20 ml acid acetic và 10 ml cloroform, lắc cho tan hoàn toàn Sau đó thêm 5ml dung dịch KI bão hòa rồi để yên 30 phút trong tối, tiếp tục thêm 3 ml nước cất và chuẩn lượng iod thoát ra bằng Na2S2O3 0,01

N cho đến khi dung dịch có màu vàng, thêm vào 1 ml dung dịch hồ tinh bột 1% và chuẩn tiếp đến màu xanh (khi chuẩn cần lắc mạnh)

- Tiến hành mẫu trắng với điều kiện giống như trên

c) Tính kết quả: Chỉ số peroxyde (Px) biểu thị bằng số gam iod thoát ra từ 100 g chất béo

𝑃𝑥 =(𝑉1− 𝑉2) × 𝑁 × 0,1269 × 100

𝐺Trong đó:

V1: Lượng dung dịch Na2S2O3 0,01 N dùng chuẩn độ mẫu chất béo (ml)

V2: Lượng dung dịch Na2S2O3 0,01 N dùng để chuẩn độ mẫu trắng (ml)

N : Nồng độ đương lượng của dung dịch Na2S2O3

G : Trọng lượng mẫu phân tích (g) (=3,0055 g)

Bảng 1 Kết quả chuẩn độ bằng dung dịch Na 2 S 2 O 3 0,01 N

Mẫu Lượng dung dịch Na2S2O3 0,01 N dùng chuẩn độ (ml)