bacteriocin trong tp http duongduongth blogspot com pdf

Tuy nhiên do lạm dụng quá mức antibiotic đã dẫn đến khả năng kháng thuốc ở vi sinh vật nên việc nghiên cứu chất kháng khuẩn để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm phải đi theo một hướng mớ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO  TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM  KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM 

Bacteriocin và  ứng dụng trong bảo quản thực phẩm 

Mục lục 

I Giới thiệu chung về bacteriocin       3 

1 Mở đầu      3 

2 Định nghĩa       5 

3 Phân loại       5 

4 Sinh tổng hợp       11 

II Cơ chế hoạt động của bacteriocin       15 

1 Cơ chế hoạt động       15 

2 Các nhân tố ảnh hưởng khả năng hoạt động      16 

III Thu nhận và phương pháp chiết tách bacteriocin      18 

1 Thu nhận bacteriocin bằng pp cố định tế bào lên men        18 

2 Chiết tách bacteriocin      22 

IV Ứng dụng bacteriocin trong thực phẩm      23 

V Đánh giá khả năng ứng dụng của bacteriocin      29 

1 Tình hình hiện nay      29 

2 Tương lai      32 

I Giới thiệu chung

1 Mở đầu

Ngày nay, người tiêu dùng đã nhận thức rõ hơn về tác động của phụ gia thực phẩm đối với các vấn đề về sức khỏe và chuộng các loại thực phẩm chế biến không bổ sung chất bảo quản hóa học tổng hợp vì tính an toàn cho thực phẩm Những thập niên gần đây, xuất phát từ yêu cầu cao về chất lượng, tính an toàn của thực phẩm từ phía người tiêu dùng cũng như những yêu cầu nghiêm ngặt của chính phủ về vấn đề an toàn thực phẩm trong sản xuất, chế biến, bảo quản đã thúc đẩy nghiên cứu rộng rãi các chất có khả năng bảo quản thực phẩm có nguồn gốc tự nhiên Quay trở lại lịch sử, thời kì khai sinh ra vi sinh học hiện đại ngày nay, vào năm 1929 khi Alexander Fleming tìm ra thuốc kháng sinh

penicillin từ nấm Penicillum notanum, và trước đó nữa, những năm của thế kỉ 18, các nhà

khoa học đã bắt đầu phân lập được các chủng vi sinh vật gây bệnh và hư hỏng trên người cũng như thực phẩm, mà mở đầu bằng các phát hiện nghiên cứu của Louis Pasteur Việc tìm ra thuốc kháng sinh vào năm 1929 đã mở bước ngoặc mới cho y học loài người Chỉ với một lượng rất nhỏ nhưng hiệu quả tiêu diệt vi sinh vật của Penicillin rất cao Antibiotic không chỉ được ứng dụng trong điều trị bệnh cho người, mà còn dùng cho điều trị bệnh cho thú, tăng trọng thú và cả trong bảo quản thực phẩm (như chlotetraciclin dùng

để bảo quản thịt) Tuy nhiên do lạm dụng quá mức antibiotic đã dẫn đến khả năng kháng thuốc ở vi sinh vật nên việc nghiên cứu chất kháng khuẩn để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm phải đi theo một hướng mới, hiệu quả hơn, đó là ứng dụng bacteriocin, một nhóm các hợp chất có bản chất là peptide, nguồn gốc từ vi khuẩn và có khả năng kháng khuẩn mà không gây ra tác động kháng thuốc ở vi sinh vật Bacteriocin đầu tiên được tìm thấy là colicin bởi Gratia vào năm 1925, đây là một loại peptide có khả năng tiêu diệt E.coli

Hiện nay có nhiều tài liệu ghi bacteriocin chính là antibiotic (modern food sixth edition James M Jay) hoặc xếp nó vào peptide antibiotic vì nó có bản chất là polypeptide, có khả năng kháng khuẩn và do vi sinh vật tạo ra để chống lại các vi sinh vật cạnh tranh khác, tương tự như với antibiotic (cuốn peptide antibiotics: discovery, modes

microbiology-of action, and applications của Christopher J Dutton) Trong khi một số khác, để phân biệt rõ sự khác nhau giữa bacteriocin và antibiotic dùng trong điều trị và để tránh sự

nhầm lẫn giữa hai loại chất kháng khuẩn này, họ mới đặt tên cho các polypeptide mà có khả năng kháng khuẩn và do vi khuẩn sinh ra là bacteriocin, và xếp nó vào nhóm

antimicrobial peptide (peptide kháng khuẩn)

Theo Cleveland and Tchikindas - 2001, có sự khác nhau rõ ràng giữa bacteriocin và

antibiotic dùng trong điều trị:

+ Trước khi nisin được dùng như tác nhân bảo quản thực phẩm, đã có nhiều nỗ lực nghiên cứu để sử dụng nisin trong chữa trị cho người nhưng không thành công Vì nisin không có khả năng tiêu diệt vi khuẩn gram âm, bị tiêu hóa nhanh chóng và bị phá vỡ cấu trúc khi đi vào cơ thể

+ Nhìn chung, antibiotic là sản phẩm của sự trao đổi chất thứ cấp Bacteriocin là sản phẩm của sự đổi chất bậc một (sơ cấp), được tạo ra bằng cơ chế sinh tổng hợp protein nhờ ribosome, có gene mã hóa bacteriocin trong tế bào vi khuẩn

+ Nisin không được sử dụng trong điều trị bệnh ở người và động vật, không được sử dụng làm phụ gia trong thức ăn chăn nuôi và chất làm tăng cường sự sinh trưởng cho động vật

+ Có nhiều nghiên cứu khác nhau đã chỉ ra rằng nisin không gây ra sự kháng thuốc kháng sinh Ví dụ, chuyển vi khuẩn vào trong môi trường chứa nồng độ gần gây chết của nisin không làm thay đổi sự nhạy cảm của các VSV đối với các thuốc kháng sinh điều trị và các loại thuốc hóa học điều trị khác

Vì những điều nêu trên nên bacteriocin nên được xem là antimicrobial peptide, không phải là antibiotic

Ngoài ra còn một sự khác nhau rõ ràng giữa bacteriocin và antibiotic, bacteriocin chỉ do

vi khuẩn tạo ra và có khả năng kháng lại các vi khuẩn cùng loài – gram dương chỉ có thể kháng gram dương (phổ kháng khuẩn hẹp) hoặc khác loại – gram dương có thể kháng lại gram âm Trong khi antibiotic có thể do các loại vi sinh vật tạo ra như vi khuẩn, nấm mốc

và phổ kháng khuẩn của nó rộng, hoạt tính tiêu diệt vi sinh vật cạnh tranh rất cao vì chỉ cần với một lượng rất nhỏ nhưng đã tỏ ra hiệu quả

Hiện nay đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng bacteriocin không những chỉ trong lĩnh vực bảo quản thực phẩm, mà còn có tiềm năng ứng dụng trong cải thiện sức khỏe người, y học thú, kiểm soát vụ thu hoạch, nông nghiệp, điều trị sinh học (bioremediation) (Theo

giới thiệu chung trong cuốn research and applications in bacteriocins của Margaret A Riley, Osnat Gillor)

2 Định nghĩa

Bacteriocin là protein hoặc polypeptid có khả năng kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại vi khuẩn khác

Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính

bacteriocin đó Ngoài ra không gây ra phản ứng dị ứng trong cơ thể con người gây ra các vấn đề về sức khỏe, nhưng bacteriocin bị ảnh hưởng bởi tác động của các enzyme như trypsin, pepsin, α-chymotrypsin…

Những sản phẩm do vi khuẩn sinh ra có khả năng gây ức chế những vi khuẩn khác có rất nhiều như enzyme, antibiotic, bacteriocin Hiện nay người ta đã phát hiện ra nhiều loại

bacteriocin do vi khuẩn tổng hợp nên như nisin (Lactococcus lactis), subtilin (Bacillus

subtilis), pediocin (Pediococcus acidilactici)…

Người ta đã đưa ra nhiều tiêu chí để định nghĩa bacteriocin, những tiêu chí này được dùng trong nhiều trường hợp, áp dụng với nhiều mức độ khác nhau để định nghĩa những loại bacteriocin khác nhau Những tiêu chí như sau:

- Phạm vi ức chế đối với những loại khác

- Sự có mặt của loại protein hoạt động

- Cách thức hoạt động có tính kháng khuẩn

- Loại tế bào mà nó tác dụng

- Những yếu tố di truyền

- Do quá trình tổng hợp sinh học có tính ức chế

3 Phân loại bacteriocin

Dựa trên hệ thống phân loại bacteriocin của Klaenhammer và Cotter, người ta đã thống nhất đưa ra bảng phân loại chung theo như sơ đồ sau:

Theo hệ thống phân loại bacteriocin rộng rãi (Universal bacteriocin classification scheme), bacteriocin được phân làm 4 nhóm:

a Nhóm I (Lantibiotic) được phân thành 3 nhóm phụ Ia, Ib, Ic

Chuỗi peptide ngắn (<6 kDa), thẳng, gồm các amino acid hiếm (lanthionine và/hoặc methyllanthionine)

Bền nhiệt, lưỡng cực (đầu kị nước và đầu không kị nước), mang điện tích dương, do đó hoạt động tiêu diệt vi khuẩn khác bằng cách kết hợp với các lipid mang điện tích âm trên màng hình thành lỗ

6 

Bảng 1: các bacteriocin thuộc nhóm Ia, Ib, Ic và tên các chủng tạo ra chúng

‐ Mang điện tích dương, kị nước và bền nhiệt

Leucocin A/B –Talla

+ Nhóm IIc: cấu trúc vòng Đầu tận cùng N và C nối với nhau bằng liên kết cộng hóa trị

+ Nhóm IId: bacteriocin gồm nhiều nhóm nối lại với nhau

10 

c Nhóm 3: chia làm 2 nhóm phụ IIIa và IIIb

Chuỗi peptide dài (>15 kDa)

Protein có khả năng kháng khuẩn và kém bền nhiệt

Có chứa cấu trúc domain

+ Nhóm IIIa: làm thủng màng tế bào vi khuẩn

+ Nhóm IIIb: không làm thủng màng tế bào

divergicin A, sakacin A; trên transposon như nisin, lacticin 481

Tổng hợp các chất kháng khuẩn bacteriocin được quy định bởi 4 gene khác nhau:

+ Gene tạo ra chất tiền thân của bacteriocin: pre-bacteriocin

+ Gene tạo miễn dịch cho chủng sản xuất (immunity gene)

+ Gene mã hóa kênh vận chuyển cho pre-bacteriocin ra khỏi tế bào kích hoạt cơ chế vận chuyển đặc biệt (kênh vận chuyển ABC – ABC transporter)

+ Gene kích hoạt cơ chế tạo ra protein tiếp nhận thông tin (accessing protein), giữ vai trò quan trọng vận chuyển và kích hoạt hoạt động kháng khuẩn của bacteriocin khi

bacteriocin được xuất ra khỏi tế bào (từ pre-bacteriocin thành bacteriocin)

Ngoài ra còn có những gene khác trong sinh tổng hợp bacteriocin được tìm thấy ở nhóm

II

Khi gặp vi khuẩn đối nghịch, để tổng hợp ra Bacteriocin tiêu diệt/ức chế vi khuẩn đối nghịch cần phải có cơ chế điều hòa tổng hợp bacteriocin, đó chính là operon

Cấu trúc của một operon gồm

Gene điều hòa (Promoter) – trình tự nucleotide để 1 gene được phiên mã Promoter

được nhận diện bởi RNA polymerase, bắt đầu quá trình phiên mã mRNA Trong tổng hợp RNA, promoter chỉ thị gene nào cần được sử dụng để tạo mRNA, do đó kiểm soát tế bào tạo ra protein nào, protein ức chế để gắn vào gene chỉ huy hay protein cần cho tế bào hoạt động

Gene chỉ huy (Operator) – một đoạn DNA để protein kiềm hãm gắn vào, do đó ngăn

cản RNA polymerase phiên mã gene

Gene cấu trúc (Structural gene) – các gene được điều hòa tổng hợp bởi operon

Quay trở lại cơ chế sinh tổng hợp bacteriocin, trên gene cấu trúc có mang thông tin để phiên mã tạo mRNA chứa thông tin tạo ra pre-bacteriocin (tiền bacteriocin) cũng như các gene khác như gene miễn dịch (giúp bảo vệ vi khuẩn khỏi tác động tiêu diệt/ức chế của bacteriocin do chính nó tạo ra) mRNA sau đó cùng với ribosome, tRNA đi vào quá trình dịch mã tạo ra pre-bacteriocin, protein miễn dịch

Sau khi quá trình phiên mã, dịch mã tạo ra pre-bacteriocin, dưới tác động của các enzyme trong tế bào chất, pre-bacteriocin khi được giải phóng ra khỏi màng tế bào được cắt bỏ leader peptide để tạo thành bacteriocin hoàn chỉnh có khả năng kháng khuẩn và được vận chuyển ra khỏi màng thông qua hệ thống vận chuyển ABC Vai trò của leader peptide trong pre-bacteriocin là để bảo vệ vi khuẩn chính nó khỏi tác động tiêu diệt của

bacteriocin trong khi tạo ra nó

Sơ đồ 1: sinh tổng hợp bacteriocin nhóm I (lantibiotic)

12 

Mỗi nhóm phân loại bacteriocin sẽ có cơ chế sinh tổng hợp bacteriocin khác nhau, nhưng nhìn chung sau khi phiên mã, dịch mã tạo ra pre-bacteriocin, sau khi được giải phóng ra khỏi màng tế bào cùng với việc cắt bỏ leader peptide tạo khả năng kháng khuẩn hoàn chỉnh cho bacteriocin, bacteriocin hoặc IF (một peptide có cấu trúc giống bacteriocin nhưng không có hoạt tính kháng khuẩn) sẽ tác động vào HPK (histidine protein kinase) truyền tín hiệu xuống RR (response regulator) để kích hoạt tiếp quá trình phiên mã của các gene như gene cấu trúc, gene miễn dịch… Tùy vào bacteriocin thuộc nhóm I hay nhóm II mà HPK sẽ nhận biết sự hiện diện của bacteriocin (nhóm I) hay IF (nhóm II) (xem sơ đồ 1 và 2)

cùng hoạt động để bảo vệ tế bào sản xuất khỏi tác động bacteriocin của chính nó Lan I, gắn với màng tế bào phía bên ngoài, ngăn cản hình thành lỗ trên màng tế bào dưới tác động của bacteriocin do chính vi khuẩn tạo ra LanFEG có vai trò vận chuyển các phân tử bacteriocin vào ra màng tế bào và do đó duy trì nồng độ bacteriocin trong màng dưới điểm tới hạn

Ở nhóm II, protein miễn dịch gắn trên màng tế bào, mang điện tích dương, từ 51-254 amino acid, tạo ra sự miễn dịch hoàn toàn bacteriocin do nó sản xuất ra

Vậy, nhìn chung vi khuẩn tự nó hình thành hệ thống miễn dịch bảo vệ chính nó khỏi tác động kháng khuẩn của bacteriocin sau khi bacteriocin được giải phóng ra khỏi màng, bằng cách hình thành protein miễn dịch đính trên màng tế bào

II Cơ chế hoạt động

1 Cơ chế hoạt động

Cơ chế hoạt động của bacteriocin

Sự phân loại bacteriocin ngoài dựa vào cấu trúc còn dựa vào cơ chế hoạt động của

bacteriocin

Quá trình tác động của bacteriocin có thể được phân làm hai giai đoạn:

‐ Giai đoạn I: bacteriocin hấp thụ lên bề mặt tế bào vi khuẩn nhờ vào các thụ thể trên bề

mặt Giai đoạn này chưa có tác động tích cực trong việc tiêu diệt vi khuẩn

14 

‐ Giai đoạn II : bacteriocin tạo ra các kênh để thâm nhập vào bên trong màng nguyên

sinh hoặc cũng có thể chúng tác động trực tiếp lên thành peptidoglycan

Nhóm I - điển hình là nisin: các bacteriocin khác nhau thì cơ chế tác động có thể là lên

thành peptidoglycan hoặc màng nguyên sinh, hoặc kết hợp cả hai cơ chế Ví dụ: nisin có

cả hai cơ chế trong khi đó thì lacticin thì chỉ có khả năng tác động lên thành

peptidoglycan

‐ Đối với thành peptidoglycan: lipid II giữ vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển các đơn vị tổng hợp nên thành peptidoglycan từ trong tế bào chất Bacteriocin thuộc nhóm này có khả năng liên kết với lipid nằm trên màng nguyên sinh, sự liên kết này được giải thích rằng do phần lớn bacteriocin mang điện tích (+) và lipid màng mang điện tích (-) vì thế sự liên kết được dễ dàng tạo ra trên màng nguyên chất Sau khi tạo liên kết, bacteriocin sẽ khóa lipid làm chúng mất khả năng vận chuyển các tiểu đơn vị cấu tạo nên thành peptidoglycan

‐ Đối với màng sinh chất: bacteriocin liên kết và sử dụng lipid trên màng nguyên sinh thực hiện quá trình oxi hóa khử, lúc này lipid có tác dụng như những con dao cắt tạo nên những lỗ hỏng trên màng nguyên sinh Những lỗ hỏng này làm thất thoát nhiều các ion, các chất hòa tan trong nguyên sinh chất (muối khoáng, amino acid, acid

nucleics…), làm thủy phân và thất thoát nhiều ATP dẫn đến tế bào chết nhanh chóng hơn

Nhóm II - điển hình Sakacin: do thuộc nhóm kỵ nước sau khi tạo ra kênh dẫn vào được

bên trong màng nguyên sinh bacteriocin thuộc nhóm này sẽ liên kết với lipid trong thành phần phospholipid màng, chúng sẽ gắn trực tiếp vào màng như một thành phần của màng, sau đó thực hiện các phản ứng oxi hóa khử tạo nên những lỗ hỏng và tác động như nhóm

I

Nhóm III - điển hình lysostaphin: tác động trực tiếp lên thành tế bào, làm phân hủy tan

thành tế bào và phá vỡ tính thẩm thấu

Nhóm IV: hiện nay các nhà khoa học vẫn chưa đưa ra một kết luận cụ thẻ rõ rang nào

cho cơ chế tác động của nhóm này Theo sự giả định của các nhà khoa học, họ cho rằng nhóm này tác động chủ yếu lên DNA, RNA, sự tổng hợp protein Các bacteriocin nhóm này có thể tạo phức hợp không tan với DNA ngăn cản DNA tổng hợp nên RNA và

protein, hoặc liên kết với DNA làm dịch mã ra các protein không bình thường, cũng có thể nó liên kết trực tiếp và phong bế hoạt động của protein

2 Các nhân tố ảnh hưởng khả năng hoạt động

™ Các nhân tố lý hóa liên quan đến thực phẩm:

- Trạng thái vật lí của thực phẩm: bacteriocin có tác dụng tốt trong môi trường thực phẩm lỏng hơn trong môi trường thực phẩm rắn Do trong môi trường lỏng bacteriocin

có khả năng hòa tan và phân tán tốt hơn làm tăng hiệu quả hoạt động

- Thành phần của thực phẩm, pH thực phẩm: một số thành phần của thực phẩm có thể liên kết được với bacteriocin do đó nó có thể hạn chế sự biến tính của bacteriocin trong quá trình xử lí nhiệt Nhưng nếu thực phẩm có hàm lượng lipid càng cao thì khả năng mất hoạt tính của bacteriocin càng cao do nó có khả năng liên kết tốt với bacteriocin vì thế hoạt lực của chúng giảm đi đáng kể

- Các chất phụ gia thêm vào và các ion (+) đa hóa trị : các chất phụ gia thêm vào cũng có khả năng làm mất đi đáng kể hoạt lực của bacteriocin do sự liên kết với bacteriocin hoặc sự lien kết của chúng với phospholipid của tế bào vi khuẩn lúc này chúng là những tác nhân bảo vệ tế bào vi khuẩn đặc biệt là các chất mang điện tích đa hóa trị như : Ca2+, Mg2+ …

- Chế độ xử lí nhiệt : chế độ xử lý nhiệt không phù hợp (quá cao) sẽ làm mất tác động của bacteriocin do có bản chất protein nên chúng sẽ bị biến tính trong quá trình xử lý nhiệt ví dụ UHT làm mất 40% hoạt lực của bacteriocin

- Các hợp chất hợp lực với bacteriocin: một là bản thân những chất này có khả năng kháng lại vi khẩn vì thế có thể hỗ trợ cho bacteriocin, hai là có tác dụng liên kết với các thành phần lipid hoặc các muối trong thực phẩm vì thế làm giảm sự tương tác của chúng với bacteriocin ví dụ lysozym, chất nhũ hóa, đường sucrose…

™ Các nhân tố vi sinh liên quan đến thực phẩm:

- Các nhân tố tác động của bacteriocin trong quá trình bảo quản: nhiệt độ ảnh hưởng đến tính ổn định chúng có thể làm biến tính, thất thoát protein, việc tăng pH có thể làm giảm khả năng hòa tan và phân tán của bacteriocin trong thực phẩm

- Số lượng vi sinh vật và bào tử ban đầu