Phân tích cấu trúc một số hợp chất Flavonoid tách chiết từ lá cây Sen hồng (Nelumbo nuciferaGaertn.) bằng các phương pháp hóa lí hiện đại (LV thạc sĩ)

Phân tích cấu trúc một số hợp chất Flavonoid tách chiết từ lá cây Sen hồng (Nelumbo nuciferaGaertn.) bằng các phương pháp hóa lí hiện đại (LV thạc sĩ)Phân tích cấu trúc một số hợp chất Flavonoid tách chiết từ lá cây Sen hồng (Nelumbo nuciferaGaertn.) bằng các phương pháp hóa lí hiện đại (LV thạc sĩ)Phân tích cấu trúc một số hợp chất Flavonoid tách chiết từ lá cây Sen hồng (Nelumbo nuciferaGaertn.) bằng các phương pháp hóa lí hiện đại (LV thạc sĩ)Phân tích cấu trúc một số hợp chất Flavonoid tách chiết từ lá cây Sen hồng (Nelumbo nuciferaGaertn.) bằng các phương pháp hóa lí hiện đại (LV thạc sĩ)Phân tích cấu trúc một số hợp chất Flavonoid tách chiết từ lá cây Sen hồng (Nelumbo nuciferaGaertn.) bằng các phương pháp hóa lí hiện đại (LV thạc sĩ)Phân tích cấu trúc một số hợp chất Flavonoid tách chiết từ lá cây Sen hồng (Nelumbo nuciferaGaertn.) bằng các phương pháp hóa lí hiện đại (LV thạc sĩ)Phân tích cấu trúc một số hợp chất Flavonoid tách chiết từ lá cây Sen hồng (Nelumbo nuciferaGaertn.) bằng các phương pháp hóa lí hiện đại (LV thạc sĩ)Phân tích cấu trúc một số hợp chất Flavonoid tách chiết từ lá cây Sen hồng (Nelumbo nuciferaGaertn.) bằng các phương pháp hóa lí hiện đại (LV thạc sĩ)Phân tích cấu trúc một số hợp chất Flavonoid tách chiết từ lá cây Sen hồng (Nelumbo nuciferaGaertn.) bằng các phương pháp hóa lí hiện đại (LV thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHẠM THỊ HUYỀN

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT FLAVONOID TÁCH CHIẾT TỪ LÁ CÂY SEN HỒNG

(NELUMBO NUCIFERA GAERTN.) BẰNG CÁC

PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THÁI NGUYÊN - 2017

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHẠM THỊ HUYỀN

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT FLAVONOID TÁCH CHIẾT TỪ LÁ CÂY SEN HỒNG

(NELUMBO NUCIFERA GAERTN.) BẰNG CÁC

PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60.44.01.18

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THỊ THU HÀ

THÁI NGUYÊN - 2017

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn GS.TS Nguyễn Văn Tuyến và TS Nguyễn Thị Thu Hà đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng Hóa sinh ứng dụng - Viện Hóa học đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực nghiệm và hoàn thành luận văn

Tôi xin cảm ơn các thầy cô khoa Hóa Học - Trường Đại Học Khoa Học Thái Nguyên đã trang bị cho em kiến thức để tiếp cận với các vấn đề nghiên cứu khoa học, và các anh chị, các bạn học viên lớp K9B- lớp Cao học Hóa đã trao đổi và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình tôi, bạn bè và đồng nghiệp của tôi - những người đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này

Ngày 28 tháng 5 năm 2017

Học viên

Phạm Thị Huyền

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN a MỤC LỤC b DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT d DANH MỤC CÁC HÌNH e DANH MỤC CÁC BẢNG f DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ g

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về họ Sen (Nelumbonaceae), chi sen (Nelumbo), và loài Sen hồng (Nelumbo nucifera gaertn.) 3

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Sen hồng (Nelumbo Nucifera gaertn.) 4

1.2.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu ngoài nước 4

1.2.2 Tổng quan tính hình nghiên cứu trong nước 7

1.3 Hợp chất Flavonoid 8

1.3.1 Phân loại 8

1.3.2 Các phương pháp định tính và định lượng flavonoid 11

1.3.3 Các phương pháp chiết xuất flavonoid 13

1.3.4 Hoạt tính sinh học của lớp chất flavonoid 14

1.4 Một số phương pháp hóa lí dùng để phân tích cấu trúc hóa học các hợp chất tự nhiên 19

1.4.1 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR 19

1.4.2 Phương pháp phổ khối lượng (MS) 20

1.4.3 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) 21

Chương 2:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Vật liệu nghiên cứu 23

2.1.1 Đối tượng 23

2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Phương pháp xử lý và ngâm chiết mẫu thực vật 23

2.2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất tự nhiên 24

2.3 Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các chất phân lập được 26

2.3.1 Hợp chất catechin (NN1) 26

2.3.2 Hợp chất hyperoside (NN2) 27

2.3.3 Hợp chất quercetin (NN3) 27

2.3.4 Hợp chất kaempferol (NN4) 28

2.3.5 Hợp chất isorhamnetin-3-O-β-D-glucuronide (NN5) 28

2.3.6 Hợp chất quercetin-3-O-β-D-glucuronide (NN6) 29

Chương 3:KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Phân tích cấu trúc hóa học hợp chất catechin (NN1) 30

3.2 Hợp chất hyperoside (NN2) 34

3.3 Hợp chất quercetin (NN3) 38

3.4 Hợp chất kaempferol (NN4) 40

3.5 Hợp chất isorhamnetin-3-O-β-D-glucuronide (NN5) 43

3.6 Hợp chất quercetin-3-O-β-D-glucuronide (NN6) 47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

PHỤ LỤC 56

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu/

NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt

Polarization Transfer Phổ DEPT COSY Homonuclear Correlated

IR Infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại

TLC Thin LayerChromatography Sắc ký bản lớp mỏng DMSO Dimethyl sulfoxide

δH, δC

Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon

s: singlet d: doublet t: triplet

q: quartet

dd: doublet of doublets dt: doublet of triplets

dq: doublet of quartets

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Cây Sen hồng (Nelumbo nucifera Gaertn.) 3

Hình 1.2: Một số hợp chất flavonoid phân lập từ cây Sen hồng 5

Hình 3.1 Phổ ESI-MS của hợp chất NN1 30

Hình 3.2 Phổ 1 H-NMR giãn rộng của hợp chất NN1 31

Hình 3.3 Phổ DEPT của hợp chất NN1 32

Hình 3.4 Phổ HMBC của hợp chất NN1 33

Hình 3.5 Phổ HSQC của hợp chất NN1 34

Hình 3.6 Công thức cấu tạo và một số tương tác chính trên phổ HMBC của hợp chất catechin 34

Hình 3.7 Phổ ESI-MS của hợp chất NN2 35

Hình 3.8 Phổ 1 H-NMRcủa hợp chất NN2 36

Hình 3.9 Phổ 13 C-NMR của hợp chất NN2 36

Hình 3.10 Phổ DEPT của hợp chất NN2 37

Hình 3.11 Cấu trúc hóa học của hợp chất hyperoside 38

Hình 3.12 Phổ ESI-MS của hợp chất NN3 39

Hình 3.13 Phổ 1 H-NMR giãn rộng của hợp chất NN3 39

Hình 3.14 Cấu trúc hóa học của hợp chất quercetin 40

Hình 3.15 Phổ ESI-MS của hợp chất NN4 40

Hình 3.16 Phổ 1 H-NMR giãn rộng của hợp chất NN4 41

Hình 3.17 Phổ 13 C-NMR của hợp chất NN4 42

Hình 3.18 Cấu trúc hóa học của hợp chất kaemferol 43

Hình 3.19 Phổ ESI-MS của hợp chất NN5 44

Hình 3.20 Phổ 1 H-NMR giãn rộng của hợp chất NN5 45

Hình 3.21 Phổ 13 C-NMR của hợp chất NN5 45

Hình 3.22 Phổ DEPT của hợp chất NN5 46

Hình 3.23 Cấu trúc hóa học của hợp chất isorhamnetin-3-O-β-D-glucuronide 46

Hình 3.24 Phổ ESI-MS của hợp chất NN6 47

Hình 3.25 Phổ 1 H-NMR giãn rộng của hợp chất NN6 48

Hình 3.26 Phổ 13 C-NMR của hợp chất NN6 48

Hình 3.27 Cấu trúc hóa học của hợp chất quercetin-3-O-β-D-glucuronide 50

Hình 3.28 Các hợp chất phân lập được từ dịch chiết EtOAc lá sen hồngNelumbo

nucifera 50

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất NN1 32

Bảng 3.2 Dữ liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của hợp chất NN2 37

Bảng 3.3 Dữ liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của hợp chất NN4 42

Bảng 3.4 Dữ liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của hợp chất NN6 49

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ ngâm chiết lá cây Sen hồng Nelumbo nucifera 24

Sơ đồ 2.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn EtOAc của lá Sen hồng 26

DANH MỤC PHỤ LỤC

PL1.Phổ ESI-MS của hợp chất catechin (NN1): C 15 H 14 O 6 1

PL2.Phổ IR của hợp chất catechin (NN1) : C 15 H 14 O 6 2

PL3 Phổ 1 H-NMR của hợp chất catechin (NN1) : C 15 H 14 O 6 3

PL4.Phổ13C-NMR của hợp chất catechin (NN1) : C 15 H 14 O 6 4

PL5.Phổ DEPT của hợp chất catechin (NN1): C 15 H 14 O 6 5

PL6.Phổ HSQC của hợp chất catechin (NN1) : C 15 H 14 O 6 6

PL7 Phổ HMBC của hợp chất catechin (NN1) : C 15 H 14 O 6 7

PL8.PhổESI-MS của hợp chất hyperoside (NN2) : C 21 H 20 O 2 8

PL9.Phổ IR của hợp chất hyperoside (NN2) : C 21 H 20 O 2 9

PL10 Phổ 1 H-NMR của hợp chất hyperoside (NN2) : C 21 H 20 O 2 10

PL11 Phổ 13 C-NMR của hợp chất hyperoside (NN2) : C 21 H 20 O 2 11

PL12 Phổ DEPT của hợp chất hyperoside (NN2) : C 21 H 20 O 2 12

PL13.Phổ ESI-MS của hợp chất quercetin (NN3) : C 15 H 10 O 7 13

PL14 Phổ IR của hợp chất quercetin (NN3) : C 15 H 10 O 7 14

PL15 Phổ 1 H-NMR của hợp chất quercetin (NN3) : C 15 H 10 O 7 15

PL16.Phổ ESI-MS của hợp chất (NN4) : C 15 H 10 O 6 16

PL17.Phổ IR của hợp chất (NN4) : C 15 H 10 O 6 17

PL18 Phổ 1 H-NMR của hợp chất (NN4) : C 15 H 10 O 6 18

PL19 Phổ13C-NMR của hợp chất (NN4) : C 15 H 10 O 6 19

PL20.Phổ ESI-MS của hợp chất (NN5) : C 22 H 20 O 13 20

PL21.Phổ IR của hợp chất (NN5) : C 22 H 20 O 13 21

PL22.Phổ 1 H-NMR của hợp chất (NN5) : C 22 H 20 O 13 22

PL23 Phổ 13 C-NMR của hợp chất (NN5) : C 22 H 20 O 13 23

PL24 Phổ DEPTcủa hợp chất (NN5) : C 22 H 20 O 13 24

PL25.Phổ ESI-MS của hợp chất NN6 25

PL26.Phổ IR của hợp chất NN6 26

PL27.Phổ 1 H-NMR của hợp chất (NN6) :C 21 H 18 O 13 27

PL28 Phổ 13 C-NMR của hợp chất (NN6) :C 21 H 18 O 13 28

MỞ ĐẦU

Việt Nam nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng và ẩm, được thiên nhiên ưu đãi nên có thảm thực vật phong phú và đa dạng, với khoảng hơn 14.000 loài thực vật bậc cao Trong đó, có khoảng 4000 loài được sử dụng làm thuốc trong y học cổ truyền.Nước ta có nền Y học cổ truyền hết sức đa dạng và đặc sắc, với bề dày hàng nghìn năm lịch sử, nền y học dân tộc cũng không ngừng phát triển qua các thời kì đó Nhiều bài thuốc, vị thuốc có tác dụng tốt trên lâm sàng nhưng chưa được nghiên cứu sâu về thành phần hóa học, tác dụng dược lí và độc tính Nghiên cứu để khai thác, kế thừa, ứng dụng và phát triển nguồn thực vật làm thuốc đã, đang và sẽ là vấn đề có ý nghĩa khoa học, kinh tế và xã hội rất lớn ở nước ta

Thực vật là kho tàng vô cùng phong phú các hợp chất thiên nhiên, và rất nhiều các hợp chất thiên nhiên đã được tìm ra, được nghiên cứu để phục vụ trong y học.Các hợp chất thiên nhiên giữ vai trò chính trong việc phát hiện và phát triển các dược phẩm mới Ngoài ra hàng trăm cây thuốc đã được khoa học

y - dược chứng minh về giá trị chữa bệnh của chúng Nhiều loại thuốc được chiết xuất từ dược liệu Việt Nam được sử dụng rộng rãi trong nước và xuất khẩu.Xu hướng đi sâu nghiên cứu các dược liệu trong Y học cổ truyền và tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao để làm thuốc ngày càng được thế giới quan tâm

Việc sử dụng các hợp chất thiên nhiên và các sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên làm dược phẩm chữa bệnh đang ngày càng thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học cũng như cộng đồng bởi ưu điểm của chúng là độc tính thấp, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể hơn so với các dược phẩm tổng hợp

Sự lựa chọn cây Sen hồng (Nelumbo nuciferaGaertn.) làm đối tượng

nghiên cứu của đề tài dựa vào kinh nghiệm sử dụng của nền Y học cổ truyền dân tộc cũng như các nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới, với mục

tiêu tiếp tục nghiên cứu sâu hơn và tạo ra chế phẩm ứng dụng trong cuộc sống

Luận văn: “Phân tích cấu trúc một số hợp chất Flavonoid tách chiết từ lá cây Sen hồng (Nelumbo nuciferaGaertn.) bằng các phương pháp hóa lí hiện đại” được đặt ra với mục tiêu và nội dung nghiên cứu như sau:

Mục đích của đề tài:

1 Phân lập được một số hợp flavonoid từ lá cây Sen hồng

2 Phân tích cấu trúc các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp hóa lí hiện đại như: phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D; phổ hồng ngoại IR; phổ khối lượng Ms và đo điểm nóng chảy Mp

Nội dung nghiên cứu:

1 Thu thập mẫu lớn lá cây Sen hồng(Nelumbo nuciferaGaertn.)để tiến

hành nghiên cứu

2 Phân lập được một số hợp flavonoid từ lá cây Sen hồng

3 Phân tích cấu trúc các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp hóa lí hiện đại như: phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D; phổ hồng ngoại IR; phổ khối lượng Ms và đo điểm nóng chảy Mp

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về họ Sen (Nelumbonaceae), chi sen (Nelumbo), và loài Sen

hồng (Nelumbo nucifera gaertn.)

Đặc điểm của các chi và loài trong họ Sen là cỏ thủy sinh Lá hình khiên.Hoa lưỡng tính, xếp xoắn vòng; lá dài 2; cánh hoa nhiều, xếp xoắn, ít phân biệt với lá đài, nhị nhiều, xếp xoắn.Rất đặc trưng bởi bộ nhụy gồm nhiều

lá noãn rời, xếp vòng, vùi sâu trong đế hoa hình nón ngược nằm vượt lên trên

bộ nhị [1]

Cây Sen hồng có tên khoa học Nelumbo nucifera, thuộc chi Sen (Nelumbo), họ Sen (Nelumbonaceae) Sen hồng được coi là loài hoa thần thánh

và đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động tín ngưỡng

Cây mọc ở nước, có thân rễ hình trụ (ngó sen), từ đó mọc lên những lá

có cướng dài.Hoa to, màu trắng hay đỏ hồng, có nhiều nhị (tua sen) và những

lá noãn rời; các lá noãn này về sau thành quả gắn trên một đế hoa hình nón ngược (gương sen).Mỗi quả chứa một hạt, trong hạt có chồi mầm (tâm sen) gồm 4 lá non gập vào trong [2]

Hình 1.1: Cây Sen hồng(Nelumbo nuciferaGaertn.)

Trong thế giới thảo dược, ít có loài thực vật nào mà các bộ phận đều là những vị thuốc quý như cây Sen hồng Trong Y học cổ truyền nhiều nước trên

thế giới, N nucifera được dùng để chữa trị bệnh mất ngủ, hôi miệng, rong kinh,

bệnh ngoài ra, nhiễm trùng, béo phì, rối loạn thần kinh, các bệnh tim mạch, và

có công dụng như một loại thuốc bổ, giải độc và lợi tiểu Theo Đông y, nước sắc từ lá Sen được sử dụng để chữa nhiều loại bệnh như tiêu chảy, say nắng, làm mát máu, lợi tiểu, hạ sốt, nôn ra máu, chảy máu cam, băng huyết, điều trị bệnh phong, bệnh ngoài da, mệt mỏi thần kinh và béo phì [3]

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về thành phần hóa học và

hoạt tính sinh học của cây Sen hồng (Nelumbo Nucifera gaertn.)

Do có lịch sử sử dụng lâu đời, nên cây Sen hồng được rất nhiều các nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như

hoạt tính sinh học, đặc biệt là lá sen

1.2.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu ngoài nước

Phân tích thành phần hóa học, các nhà khoa học đã phát hiện ra nhiều lớp chất có trong các bộ phận khác nhau của cây Sen như alkaloids, flavonoid, glycosides Chúng bao gồm nuciferine, roemerine, anonaine, pronuciferine, N-nornuciferine, (+) - 1 (R) -coclaurine , (-) - 1 (S) -norcoclaurine, liriodenine , N-methyl-coclaurine , Dehydroemerine, dehydronuciferine, dehydroanonaine, N-methylisococlaurine, O-nornuciferine, remerine, asimilobine, lirinidine, nelumboside, quercetin, leucocyanidin, leucodelphinidin, quercetin-3- O-β-d-glucuronide, rutin, (+) - catechin, hyperoside, isoquercitrin và astragalin …[4] (Hình 1.2)

Trên mô hình thực nghiệm, dịch chiết lá Sen thể hiện nhiều hoạt tính sinh học thú vị Theo tác giả Kashiwada Y, dịch chiết cồn 95% từ lá Sen có hoạt tính kháng virus HIV với giá trị EC50< 20 µg/ml Các chất phân lập từ dịch chiết này như coclaurine, nuciferine, liensinine, negferine và isoliensinine cũng thể hiện hoạt tính rất mạnh trên chủng virus HIV với giá trị EC50< 0,8 µg/ml [5]

Hình 1.2: Một số hợp chất flavonoid phân lập từ cây Sen hồng

Một nghiên cứu của Ono Yuka và cộng sự đã báo cáo tác dụng của dịch chiết cồn nước của lá Sen lên các enzyme tiêu hóa, chuyển hóa lipid, cùng với hiệu quả chống béo phì trên chuột, gây ra bởi một chế độ ăn giàu chất béo Kết quả cho thấy dịch chiết này có hoạt tính ức chế enzym α-amylase và lipase với giá trị IC50 lần lượt là 0,48 và 0,82 mg/ml Nó cũng

ngăn ngừa sự gia tăng trọng lượng cơ thể, trọng lượng mô mỡ và mức triacylglycerol ở gan [6]

Theo tác giả Onishi E, dịch chiết nước của lá sen được nghiên cứu tác dụng hạ lipid huyết thanh trên chuột Chuột được cho ăn một chế độ ăn giàu chất béo có chứa 1,5% cholesterol và 1% acid cholic, sau đó được uống dịch chiết nước lá sen Kết quả cho thấy có sự giảm mạnh cholesterol tổng số, cholesterol tự do và các phospholipid so với lô đối chứng [7]

Nghiên cứu tác giả Wu và cộng sự cho thấy dịch chiết methanol từ lá sen

có hoạt tính chống oxy hóa tiềm năng [8] Trong một nghiên cứu khác của Lee

và cộng sự, dịch chiết lá sen có chứa rutin (11.331,3 ± 4.5 mg), catechin (10,853.8 ± 5,8 mg), acid sinapic (1,961,3 ± 5,6 mg), axit chlorogenic (631,9 ± 2,3 mg), axit syringic (512,3 ± 2,5 mg) và quercetin (415,0 ± 2,1 mg) được đánh giá hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ tế bào gan Kết quả thử nghiệm cho thấydich chiết này có khả năng loại bỏ gốc tự do tạo bởi hệ DPPH và ABTS với giá trị IC50từ 4,46 μg/mL đến 5,35 μg/mL Dịch chiết còn có tác dụng bảo

vệ tế bào gan và sự perox hoá lipid trong màng tế bào [9]

Một số alkaloid như asimilobine và lirinidine đóng vai trò như chất ức chế sự điều khiển co cơ,gây ra các cơn co thắt ở thỏ thực nghiệm [10]; nelumbine có hoạt tính như một chất gây độc cho tim mạch [11]

Các bộ phận khác của cây như thân, hoa và hạt sen cũng chứa hoạt chất thuộc nhiều lớp chất như alkaloids, flavonoid, glycosides, triterpenoid, các vitamin, khoáng chất với hoạt tính chống đông máu, hoạt tính bảo vệ gan, chống oxy hóa, chống xơ hóa, chống tăng sinh, chống loạn nhịp tim, chống virus, kháng khuẩn, kháng viêm [12]…

Như vậy, có thể cho rằng, tác dụng dược lý đa dạng của Sen hồng là do

sự có mặt của nhiều lớp hoạt chất trong cây và cần phải có các nghiên cứu sâu hơn để chứng minh khả năng chữa bệnh của loài thảo dược này

1.2.2 Tổng quan tính hình nghiên cứu trong nước

Ở nước ta, cây Sen hồng được trồng trong ao hồ khắp cả nước và rất quen thuộc với người dân Việt Nam Lá sen tươi là vị thuốc thông dụng trong dân gian, dùng để chữa trị các chứng bệnh như: cảm nắng, say nắng, đau bụng tiêu chảy Lá sen khô dùng để chữa các chứng xuất huyết [13]

Theo tác giả Đỗ Huy Bích, các công trình nghiên cứu dược lý của cây Sen Việt nam cho kết quả như sau: Alcaloid toàn phần của lá sen có tác dụng

ức chế loạn nhịp tim thực nghiệm LD50 của lá sen tiêm phúc mạc chuốt nhắt trắng là 17g/kg thể trọng Cao cồn có tác dụng hơn cao nước Lá sen có tác dụng chống choáng phản vệ Tác dụng an thần của tâm sen yếu hơn của lá sen Hoạt chất quercetin từ gương sen có tác dụng chống chảy máu Dịch chiết và alcaloid toàn phần của tâm sen và lá sen có tác dụng an thần, tăng trương lực

và co bóp cơ tử cung thỏ, chống co thắt cơ trơn ruột gây nên bởi histamin và acetylcholin Tâm sen có tác dụng ức chế trạng thái rối loạn thần kinh, có thể phối hợp với hoạt chất aminazin trong điều trị tâm thần phân liệt.Trên mô hình

invivo, flavonoid toàn phần lá sen có khả năng ức chế quá trình peroxy hóa lipid

màng tế bào gan chuột một cách rõ rệt [14]

Hiện nay có nhiều sản phẩm từ lá Sen hồng được bán trên thị trường Trung tâm nghiên cứu ứng dụng sản xuất Thực phẩm chức năng - Học Viện Quân Y đã bào chế trà giảm béo SLIMUTEA giúp giảm mỡ máu và hỗ trợ điều trị béo phì với thành phần chính gồm lá Sen kết hợp với một số thảo dược khác như Thảo quyết minh, Hoàng cầm, Đinh hương Công ty Cổ phần Công nghệ xanh Nhật Minh đã sản xuất viên nang CHOLESSEN có thành phần lá sen và Táo mèo với các thành phần polyphenol và flavonoid có tác dụng hạ mỡ máu, gan nhiễm mỡ, hỗ trợ kiểm soát đường huyết trên bệnh nhân tiểu đường Tinh lá sen OB thành phần chính là flavonoid có tác dụng để giảm béo, mỡ máu cao, tăng huyết áp, mất ngủ Viện Công nghệ thực phẩm kết hợp với Công ty thực phẩm Hisamitsu Nhật Bản sản xuất tinh lá sen tươi FIRI

1.3 Hợp chất Flavonoid [15]

1.3.1 Phân loại

Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn thường gặp trong thực vật,

có ở phần lớn các bộ phận của các loại thực vật bậc cao, đặc biệt là ở hoa.Về cấu trúc hoá học Flavonoid có khung cơ bản là C6-C3-C6 gồm 2 vòng benzen A

và B nối với nhau qua một mạch 3 cacbon, cấu trúc có thể là vòng kín hoặc mở

Trong đa số trường hợp thì mạch 3 cacbon đóng vòng với vòng A và tạo nên 1 dị vòng có oxy (vòng C) Tuỳ theo vị trí gắn của vòng bezen B vào dị vòng ở C2 hoặc C3, ta có các hợp chất Flavonoid có nhân Flavan hay Isoflavan Tại các vòng có đính một hoặc nhiều nhóm hydroxyl tự do hoặc đã thay thế một phần, vì vậy về bản chất chúng là các polyphenol có tính axit

Trong thực vật, Flavonoid tồn tại chủ yếu ở hai dạng: dạng tự do (aglycol) và dạng liên kết với glucid (glycozit) Trong đó, dạng aglycol thường tan trong các dung môi hữu cơ như ete, aceton, cồn nhưng hầu như không tan trong nước, còn dạng glycozit thì tan trong nước nhưng không tan trong các dung môi không phân cực như aceton, benzen, chloroform

Flavonoid có cấu trúc mạch C6C3C6 đều có 2 vòng thơm Tuỳ thuộc vào cấu tạo của mạch C trong bộ khung C6C3C6, flavonoid được phân thành các nhóm sau:

 Eucoflavonoid: Flavon, flavonol, flavanon, flavanol, chalcon, antocyanin, anthocyanidin

 Isoflavonoid: isolavon, isoflavanon, rotenoid

 Neoflavonoid: calophylloid

 Biflavonoid và triflavonoid

1.3.1.1 Eucoflavonoid

Eucoflavonoid bao gồm các nhóm: anthocyanidin, flavan, flavan 3-ol, flavan 4-ol, flavan 3,4-diol, flavanon, 3-hydroxy flavanon, flavon, flavonol, dihydrochalcon, chalcon, auron

1.3.1.2 Isoflavonoid

Isoflavonoid bao gồm nhiều nhóm khác nhau: isoflavan, isoflav-3-ene, isoflavan-4-ol, isoflavanon, isoflavon, rotenoid, pterocarpan, coumestan, 3-arylcoumarin, coumaronochromen, coumaronochromon, dihyroisochalcon, homo-isoflavon

Isoflavonoids tất cả không có màu sắc Nó được tạo thành từ axetat theo

cơ chế đóng vòng với phenylalamine, cinnamate dẫn xuất được sát nhập vào vòng B và C-2,3, và-4 của dị vòng

1.3.1.3 Neoflavonoid

Neoflavonoid chỉ có giới hạn trong một số loài thực vật Ví dụ chất

brasilin có trong cây tô mộc - Caesalpinia sappan hay calophyllolid trong cây

mù u - Calophyllum inophyllum

O

OHOH

OH

OHBrasilin

1.3.1.4 Biflavonoid và triflavonoid

Những flavonoid dimer và trimer đã có nói đến trong phần flavan-3-ol

và flavan 3,4 diol Những hợp chất đó được gọi là proanthocyanidin.Ở đây là

những biflavonoid tạo thành từ flavon, flavanon, dihydroflavonol, chalcon, dihydro chalcon, auron, isoflavon Biflavon cấu trúc gồm 2 đơn vị flavon được biết trước tiên Chất điển hình là amentoflavon tạo thành từ 2 phân tử apigenin nối theo dây nối carbon-carbon ở vị trí 3', 8''

1.3.2 Các phương pháp định tính và định lượng flavonoid

1.3.2.1 Định tính

Một số phản ứng định tính (chủ yếu với nhóm euflavonoid)

- Tác dụng của FeCl3: Tùy theo nhóm flavonoid và tùy theo số lượng vị

trí nhóm OH trong phân tử mà cho màu lục, xanh, nâu

- Tác dụng của kiềm Nếu hơ một tổ chức thực vật như cánh hoa, nhát

cắt của gỗ hoặc tờ giấy thấm có nhỏ dịch chiết trên miệng lọ ammoniac thì có màu vàng tăng lên tùy theo nồng độ flavonoid và tùy theo nhóm flavonoid Flavon và flavonol cho màu vàng sáng, anthocyanidin cho màu xanh dương Chalcon và auron có thể cho màu đỏ da cam.Một số nhóm khác như flavan-3-

ol, flavanon, isoflavon màu không thay đổi Tuy nhiên nếu thực hiện trong ống nghiệm với dung dịch alkali thì một số dẫn chất flavan-3-ol lại cho màu vì dễ

bị oxy hoá, còn flavanon dễ bị isomer hoá thành chalcon nên nếu để một lúc lại cho màu vàng đậm đến đỏ

- Tác dụng của H2SO4 đậm đặc: Axit H2SO4 khi nhỏ lên các dẫn chất flavon, flavonol thì cho màu vàng đậm Đối với chalcon và auron cho màu đỏ,

đỏ thắm, đỏ tươi.Flavanon cho màu đỏ cam rồi đỏ thắm, có thể do chuyển flavanon thành chalcon

- Phản ứng cyanidin (Phản ứng Shinoda hay Willstater)

Đây là phản ứng khử hay được sử dụng nhất để tìm sự có mặt của các dẫn chất nhóm flavonoid Dung dịch flavonoid trong ethanol, thêm bột Mg rồi nhỏ từ từ HCl đậm đặc.Sau 1 đến 2 phút sẽ có màu đỏ cam, đỏ thẩm hoặc đỏ tươi với các dẫn chất flavon, flavonol, flavanonol, flavanon Màu sắc đôi khi

có thể bị thay đổi tùy theo loại, số lượng, vị trí nhóm thế ví dụ các dẫn chất

methoxy flavon (Tangeretin, Nobiletin) thì âm tính Để phân biệt giữa flavonoid glycosid và aglycon của chúng, Bryant đem lắc dung dịch có màu với octanol, nếu màu ở lớp dưới lên hết ở lớp octanol, chất thử là aglycon, nếu lớp octanol không màu, chất thử là glycosid

- Tác dụng của chì acetat trung tính hoặc kiềm

Phản ứng thực hiện trên giấy thấm Nhiều dẫn chất flavonoid tạo thành muối hoặc phức có màu khi nhỏ thêm dung dịch chì acetat trung tính hoặc kiềm Màu phụ thuộc vào các dẫn chất flavonoid.Nếu tiến hành trong ống nghiệm, chì acetat kièm cho tủa màu với hầu hết các flavonoid phenol còn chì acetat trung tính tạo tủa với những dẫn chất có nhóm dihydroxyphenol

- Phản ứng ghép đôi với muối diazoni

Các dẫn chất flavonoid có nhóm OH ở vị trí 7 có thể phản ứng với muối diazoni để tạo thành chất màu azoic vàng cam đến đỏ

1.3.2.2 Định lượng

Tuỳ vào từng loại Flavonoid mà ta có phương pháp định lượng cụ thể khác nhau

 Flavon hoặc flavonol

+Phương pháp cân: ứng dụng khi nguyên liệu giàu có flavon hoặc flavonol và dịch chất ít tạp chất

+ Đo màu: bằng phản ứng cyanidin, phản ứng kết hợp với muối diazoni, tạo phức màu với AlCl3, Muối titan, chrom…

+ Phương pháp đo phổ tử ngoại

 Chalcon

 Phương pháp phân tích HPLC (sắc kí lỏng cao áp) Với pha động là dung dịch acetonitrile và acid H3PO4 1% (phương pháp chuản trong phân tích)

 Phương pháp so màu: có nhiều phương pháp so màu khác

 ciocalteu: (hỗn hợp muối phứcPhương pháp Folin polyphosphotungstate - molydate)

+ Rất nhạy đối với chất khử, trong môi trường kiềm nhẹ thì sẽ bị khử thành sản phẩm phức molydenium tungsten có màu xanh

+ Sau đó đem đo độ hấp thu A (chalcon chỉ hấp thu mạnh ở 400 nm) Phương pháp Prussian Blue:

+ Hỗn hợp thuốc thử là FeCl3 và K3Fe(CN) 6 bị khử bởi các hợp chất phenol và tạo thành phức ferric (III) hexacyanoferrate (II) có màu xanh

+ Để yên dung dịch trong 15 phút, sau đó đem đo đọ hấp thu A

 Phương pháp Diazotized

+ Dựa vào khả năng phản ứng ghép đôi với hợp chất diazo trong môi trường acid tạo thành hợp chất có màu vàng đặc trưng

+ Lắc đều, để yên dung dịch trong 1 giờ, sau đó đem đo độ hấp thu

 HCl: Tạo thành hợp chất có màu đỏ: Phương pháp Vanillin

1.3.3 Các phương pháp chiết xuất flavonoid

Không có phương pháp chung nào để chiết xuất các flavonoid vì chúng rất khác nhau về độ tan trong nước và các dung môi hữu cơ Các flavonoid glycosid thường dễ tan trong các dung môi phân cực, các flavonoid aglycon

dễ tan trong dung môi kém phân cực Các dẫn chất flavon, flavonol có OH

tự do ở vị trí 7 hòa tan được trong dung dịch kiềm loãng, dựa vào đó để chiết Thông thường để chiết các flavonoid glycosid, người ta phải loại các chất thân dầu bằng ether dầu hỏa sau đó chiết bằng nước nóng hoặc methanol hay etanol Cồn ở các nồng độ khác nhau và nước thường chiết được phần lớn các flavonoid

Đôi khi để tinh chế hoặc tách flavonoid, người ta dùng muối chì để kết tủa.sau khi thu tủa người ta tách chì bằng cách sục dihydrosulfid thì flavonoid được giải phóng Để phân lập từng chất flavonoid người ta áp dụng phương pháp sắc ký cột.chất hấp phụ thông dụng nhất là polyamid Có thể dùng celluose, silicagel Silicagel dùng để tách các chất flavanon, isoflavon, flavonol Muốn có đơn chất tinh khiết thì cần phải sắc ký cột lại vài lần

1.3.4 Hoạt tính sinh học của lớp chất flavonoid

1.3.4.1 Hoạt tính chống oxy hóa [16-18]

Quá trình oxi hóa khử là quá trình quan trọng và phổ biến trong mọi cơ thể sống Bình thường, các gốc tự do được tạo ra trong cơ thể để chống lại một

số các loại virut và vi khuẩn gây bệnh, tuy nhiên khi ở hàm lượng cao, các gốc

tự do này phản ứng với protein, lipit, ADN là nguyên nhân làm tăng tốc độ quá trình lão hóa cơ thể con người và là một trong các nguyên nhân của hơn 60 bệnh thường gặp: ung thư, các bệnh tim mạch như cao huyết áp, xơ vữa động mạch, nhồi máu cơ tim, mất trí nhớ tuổi già và nhất là quá trình lão hóa cơ thể Vì vậy, việc đưa các chất chống oxy hoá như flavonoid vào cơ thể để bảo vệ tế bào thì

có thể ngăn ngừa hoặc hỗ trợ điều trị các loại bệnh này

Flavonoid có hai tính chất quan trọng là bẫy gốc tự do và khả năng tạo phức với kim loại Cả hai chức năng kể trên đều có tính chất chống oxy hóa bằng cách cho electron và bẻ gãy chuỗi phản ứng tạo gốc tự do Cơ sở sinh hóa quan trọng nhất để flavonoid thể hiện được hoạt tính chống oxy hóa của chúng

là khả năng kìm hãm các quá trình oxy hóa dây chuyền sinh ra bởi các gốc tự

do hoạt động Bên cạnh đó flavonoid có khả năng tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp như Fe+2, Cu+2… để chúng không thể xúc tác cho phản ứng Fenton sinh ra các gốc hoạt động nên có tác dụng như những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hóa Các flavonoid có các nhóm hydroxyl ở vị trí 3, 5, 3', 4' có khả năng liên kết tốt với các ion kim loại tạo phức oxycromon, oxycacbonyl hoặc 3', 4' orthodioxyphenol

Khả năng ngăn chặn quá trình oxy hóa do các gốc tự do của một số flavonoid theo thứ tự: myricetin > quercetin > rhammetin > morin > diosmetin

> naringenin > apigenin > catechin > 5,7 dihydroxy-3', 4', 5' trimethoxy flavon

> robinin > kaempferol > flavon

1.3.4.2 Tác dụng đối với các bệnh về tim mạch [19-20]

Các flavonoid như catechin và leucoanthocyan rồi đến flavonol, flavanon

và một số chalcon… có thể có tác dụng làm bền thành mạch, làm tăng sức bền

và tính đàn hồi của thành mao mạch, chủ yếu là do khả năng điều hòa, làm giảm sức thấm vào mao mạch, có tác dụng dự phòng vỡ mao mạch, gây xuất huyết, gây phù thũng máu

Flavonoid được dùng trong các trường hợp rối loạn chức năng tĩnh mạch, tĩnh mạch bị suy yếu, giãn tĩnh mạch, trĩ, các bệnh trong nhãn khoa như sung huyết kết mạc, rối loạn tuần hoàn võng mạc Các dẫn chất anthocyanoside có tác dụng tái tạo tế bào võng mạc và có tác dụng tăng thị lực

Trên hệ tim mạch, nhiều Flavonoid như quercetin, rutin, myciretin, hỗn hợp các catechin của trà có tác dụng làm tăng biên độ co bóp tim, tăng thể tích phút của tim Các flavonoid có tác dụng củng cố, nâng cao sức chống đỡ và

hạ thấp tính thẩm thấu các hồng huyết cầu qua thành mạch thông qua tác dụng lên các cấu trúc màng tế bào của nó, ứng dụng vào điều trị các rối loạn chức năng tĩnh mạch, giãn hay suy yếu tĩnh mạch

Các chất kaempferol, quercetin, isorhammetin có tác dụng tăng tuần hoàn máu trong động mạch, tĩnh mạch và mao mạch, dùng cho những người có biểu hiện rối loạn trí nhớ, khả năng làm việc đầu óc sút kém, mất tập trung, hay cáu gắt…

1.3.4.3 Tác dụng đối với enzym

Các flavonoid có khả năng tác động đến hoạt động của nhiều hệ enzym trong cơ thể Khả năng tương tác với protein là một trong những tính chất quan trọng nhất của các hợp chất flavonoid, quyết định hoạt tính sinh học của chúng

Phản ứng xảy ra giữa nhóm oxyphenolic và oxycacbonyl của các nhóm peptit để tạo thành liên kết hydro Tính bền vững của liên kết phụ thuộc vào số lượng và

vị trí các nhóm hydroxyl và kích thước phân tử của hợp chất phenol

Tuy nhiên, có một số tác giả cho rằng giữa phenol và nhóm amin của protein không có vai trò chính trong việc làm thay đổi hoạt tính enzym, họ đã nghiên cứu quá trình tiếp nhận một số chất polyphenol vào ty thể của gan chuột

và kết luận rằng: sự liên kết của các polyphenol với các protein thường kèm theo những thay đổi cấu hình của phân tử protein enzym, bởi vậy một số polyphenol có hiệu ứng dị lập thể (chất điều hòa dị lập thể) đối với nhiều enzym trong tế bào động thực vật

Flavonoid có tác dụng trên nhiều enzym động vật như: protein-tyrozin kinaza, protein kinaza, lipooxygenaza, cyclooxygenaza, phospholypaza ADN topoizomeraza, glutathion S transferaza, aldoz reductaza, monoamin oxydaza, pyruvat kinaza, aldehyd và alcohol dehydrogenaza, amylaza, ARN polymeraza, AND polymeaza, AND ligaza-I ở người, ribonucleaza, hệ cytocrom P450,

elastaza, nitric oxide syntaza, oxydoreductase, peroxydase, caspase…

Bản thân các chất flavonoid khi ở trong cơ thể sống có thể tồn tại ở dạng oxy hóa hoặc khử và chịu nhiều biến đổi phức tạp khác nhau cho nên có thể trong các điều kiện khác nhau nó sẽ thể hiện họat tính sinh học khác nhau như kìm hãm hoặc kích thích hoạt động enzym hoặc kích thích có mức độ và có điều kiện Ví dụ như flavonoid có khả năng:

- Làm tăng hoạt tính prolin hydroxylase, là một enzym quan trọng trong quá trình làm lành vết thương và tạo sẹo

- Kìm hãm các enzym lypoxygenase và enzym tổng hợp prostaglandin, chất chuyển các dạng acid béo không no về các dạng dẫn xuất chứa oxy trong

đó phải kể đến luteolin và 3', 4' dihydroxyflavon là các flavonoid có hoạt tính mạnh đối với cả hai loại enzym này, ở nồng độ 2×10-5M, chúng kìm hãm 50% họat tính lypoxygenaza

Nhờ tác dụng sinh học đối với enzym mà các flavonoid có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, mau chóng làm lành vết thương, giảm các nguy cơ về bệnh tim mạch

1.3.4.4 Hoạt tính kháng khuẩn [21-22]

Gần đây, các hợp chất có hoạt tính sinh học nguồn gốc thảo mộc đang

là đối tượng quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới Tác dụng kháng khuẩn của flavonoid đã được nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới chứng minh

Về tác dụng kháng khuẩn một số tác giả nghiên cứu tác dụng của

anthocyanin, leucoanthocyanin và acid phenolic lên vi khuẩn Salmonella và

thấy có tác dụng kìm hãm rõ rệt Hầu hết các chất này có khả năng kìm hãm sự

hô hấp hay phân chia của vi khuẩn khi có mặt glucoza

Các nghiên cứu về cơ chế tác dụng kháng vi sinh của flavonoid còn rất

ít và có thể theo một giả thiết sau:

- Flavonoid ức chế transpeptidaza làm cho mucopeptit (yếu tố đảm bảo cho thành tế bào vi khuẩn vững chắc) không tổng hợp được

- Gắn lên màng nguyên sinh chất của vi khuẩn, làm thay đổi tính thẩm thấu chọn lọc của màng nguyên sinh chất Vì vậy, làm một số chất cần thiết cho đời sống vi khuẩn như nucleotit, pyrimidin, purin lọt qua màng nguyên sinh chất ra ngoài

- Tác động lên quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn theo hai kiểu: phong tỏa mạch peptit của vi khuẩn bằng cách phong tỏa transferaza chuyển acid amin từ ARN vào mạch làm mạch không kéo dài thêm được hoặc tạo ra protein bất thường không có tác dụng đối với đời sống của vi khuẩn, làm chúng không sử dụng được

- Ức chế tổng hợp acid nucleic

- Tác dụng vào ADN khuôn, ức chế tổng hợp ARN của vi khuẩn

1.3.4.5 Hoạt tính kháng viêm [23-24]

Flavonoid đã được nghiên cứu và chứng minh có tác động kháng viêm theo nhiều cơ chế khác nhau Về hoạt tính kháng viêm của flavonoid, rất nhiều công trình nghiên cứu đã được công bố và đã chứng minh sự liên quan giữa khả năng chống oxy hóa với khả năng ức chế enzym cyclo-oxygenase và enzym 5-lipooxygenase trong hoạt tính kháng viêm

Tác dụng chống viêm của nhiều flavonoid thuộc các nhóm flavon, flavanon,dihydroflavonol, anthocyanin, flavan-3-ol, chalcon, isoflavon, biflavon, 4-aryl coumarin, 4-aryl chroman đều được chứng minh bằng thực nghiệm là do các chất này ức chế con đường sinh tổng hợp prostagladin Các prostaglandin được tổng hợp và sử dụng ngay tại các mô với nồng độ rất thấp chỉ khoảng vài nanogam/gam Chúng có mặt ở khắp nơi trong cơ thể, phạm vi tác dụng sinh lý rất rộng lớn nên còn được gọi là hormon tổ chức Một số prostaglandin gây viêm và gây đau, prostaglandin còn làm tăng cảm thụ của thụ cảm thể với các chất gây đau như bradykinin

Hiện nay các flavonoid được nghiên cứu có tác dụng tốt đa phần là các flavonoid thiên nhiên như kaempferol, quercetin, catechin, chrysin… Theo các nghiên cứu, tác dụng sinh học của chúng nhờ vào sự có mặt của nhiều nhóm hydroxyl phenol Tuy nhiên, các nhóm hydroxyl tự do này cũng là nguyên nhân

làm tăng sự phân cực, hấp thu kém nên tác động in vivo thường không tốt như trong in vitro

1.3.4.6 Hoạt tính kháng ung thư [25]

Việc tìm kiếm các thuốc chữa ung thư từ thực vật là hướng đi của thời đại, được khoa học đặc biệt quan tâm Trong vài thập kỷ gần đây, nhiều loại thuốc đã được ra đời phục vụ y học song vấn đề tìm ra các loại thuốc có hiệu lực chữa trị ung thư vẫn còn là câu hỏi lớn đối với các nhà khoa học Trong các hướng nghiên cứu nhằm tìm ra các hoạt chất có khả nǎng chống ung thư, flavonoid là một trong những lớp chất được quan tâm bởi chúng là những chất

có hoạt tính chống oxy hóa cao, tác dụng đến nhiều hệ enzym và ít độc đối với

cơ thể sống Khi đưa vào cơ thể sống, flavonoid có thể tác động lên các biến đổi sinh hóa học bằng cách trực tiếp hay gián tiếp như thông qua hoạt động của các enzym hay hệ thống thần kinh, nội tiết Các kết quả thực nghiệm cho thấy một số flavonoid có tác dụng chống ung thư thông qua khả năng hoạt hoá các enzym trong gan có nhiệm vụ chuyển hoá các chất gây ung thư Những sản phẩm chuyển hoá thường có tính gây ung thư thấp hơn Ngoài ra, các flavonoid còn tham gia trong việc phòng chống ung thư bằng khả năng chống oxy hoá, loại trừ các gốc tự do có thể gây tổn hại tế bào, chống lại quá trình sao chép, chống sự tân sinh mạch máu

1.4 Một số phương pháp hóa lí dùng để phân tích cấu trúc hóa học các hợp chất tự nhiên [26-27]

1.4.1 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR và 13 C-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (CHTHN)là phương pháp vật lý hiện đại nghiên cứu cấu trúc của các hợp chất hữu cơ Phương pháp phổ biến được sử dụng là phổ 1H-NMR và 13C-NMR Hạt nhân của nguyên tử 1H và 13C có momen từ Nếu đặt proton trong từ trường không đổi thì moment từ của nó có thể định hướng cùng chiều hay ngược chiều với từ trường Đó là spin hạt nhân

có tính chất lượng tử với các số lượng tử +1/2 và -1/2

Độ chuyển dịch hóa học : Do hiệu ứng chắn từ khác nhau nên các hạt

nhân 1H và 13C trong phân tử có tần số cộng hưởng khác nhau Đặc trưng cho các hạt nhân 1H và 13C trong phân tử có độ chuyển dịch hóa học δ; đối với hạt nhân 1H thì:

Trong đó:νTMS, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn TMS và của hạt nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ

Trong đó:νchuan, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn và của hạt nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ

Hằng số chắn σ xuất hiện do ảnh hưởng của đám mây electron bao quanh

phân tử khác nhau mà mật độ electron bao quanh nó khác nhau dẫn đến chúng

có giá trị hằng số chắn σ khác nhau và do đó độ chuyển dịch hóa học của mỗi hạt nhân khác nhau Theo đó proton nào cộng hưởng ở trường yếu hơn sẽ có

độ chuyển dịnh hóa học lớn hơn

Dựa vào độ chuyển dịch hóa học  ta biết được loại proton nào có mặt trong chất được khảo sát Giá trị độ chuyển dịch hóa học không có thứ nguyên

mà được tính bằng phần triệu (ppm) Đối với 1H-NMR thì δ có giá trị từ 0-12 ppm, đối với 13C-NMR thì δ có giá trị từ 0-230 ppm

Hằng số tương tác spin-spin J: Trên phổ NMR, mỗi nhóm hạt nhân

không tương đương sẽ thể hiện bởi một cụm tín hiệu gọi và vân phổ, mỗi vân phổ có thể bao gồm một hoặc nhiều hợp phần Nguyên nhân gây nên sự tách tín hiệu cộng hưởng thành nhiều hợp phần là do tương tác của các hạt nhân có

từ tính ở cạnh nhau Tương tác đó thể hiện qua các electron liên kết Giá trị J

phụ thuộc vào bản chất của hạt nhân tương tác, số liên kết và bản chất các liên kết ngăn giữa các tương tác

Hằng số tương tác spin-spin J được xác định bằng khoảng cách giữa các

hợp phần của một vân phổ Dựa vào hằng số tương tác spin-spin J ta có thể rút

ra kết luận về vị trí trương đối của các hạt nhân có tương tác với nhau

1.4.2 Phương pháp phổ khối lượng (MS)

Nguyên tắc chung của phương pháp phổ khối lượng là phá vỡ phân tử trung hòa thành ion phân tử và các mảnh ion dương có số khối z = m/e Sau đó phân tách các ion này theo số khối và ghi nhận được phổ khối lượng Dựa vào phổ khối này có thể xác định phân tử khối và cấu tạo phân tử của chất nghiên cứu

Để phá vỡ phân tử người ta có nhiều phương pháp: bắn phá bằng dòng electron (EI), phương pháp ion hóa hóa học (CI), phương pháp bắn phá nguyên

tử nhanh (FAB)… Dùng dòng eclectron có năng lượng cao để bắn phá phân tử

là phương pháp hay được sử dụng nhất Khi bắn phá các phân tử hợp chất hữu

cơ trung hòa sẽ trở thành các ion phân tử mang điện tích dương hoặc bị phá vỡ thành các ion và các gốc Sự hình thành các ion mang điện tích +1 chiếm hơn 95%, còn lại là các ion mang điện tích +2 và điện tích âm (-) Năng lượng bắn phá các phân tử thành ion phân tử khoảng 10 eV Nhưng với năng lượng cao thì ion phân tử có thể phá vỡ thành các mảnh ion dương (+), hoặc các ion gốc, các gốc, hoặc phân tử trung hòa nhỏ hơn, nên người ta thường thực hiện bắn phá các phân tử ở mức năng lượng 70 eV Sự phá vỡ này phụ thuộc vào cấu tạo chất, phương pháp bắn phá và năng lượng bắn phá Quá trình này gọi là quá trình ion hóa Các ion ion dương hình thành đều có khối lượng m và mang điện tích e, tỉ số m/e được gọi là số khối z Bằng cách nào đó tách các ion có số khối khác nhau ra khỏi nhau và xác định được xác suất có mặt của chúng, rồi vẽ đồ thị biểu diễn mối liên quan giữa xác suất có mặt (hay cường độ I) và số khối z thì đồ thị này được gọi là phổ khối lượng

Như vậy, khi phân tích phổ khối lượng người ta thu được khối lượng phân tử của chất nghiên cứu, từ các pic mảnh ion trên phổ đồ có thể xác định được cấu trúc phân tử và tìm ra qui luật phân mảnh Đây là một trong những thông số quan trọng để qui kết chính xác cấu trúc phân tử của một chất cần nghiên cứu khi kết hợp nhiều phương pháp phổ với nhau

1.4.3 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)

Trong số các phương pháp phân tích cấu trúc, phổ hồng ngoại cho nhiều thông tin quan trọng về cấu trúc của hợp chất

Bức xạ hồng ngoại bao gồm một phần của phổ điện từ, đó là vùng bước sóng khoảng 10-4 đến 10-6m Nó nằm giữa vi sóng và ánh sáng khả kiến Phần của vùng hồng ngoại được sử dụng nhiều nhất để xác định cấu trúc nằm trong giữa 2,5x10-4 và 16x10-6m Đại lượng được sử dụng nhiều trong phổ hồng ngoại

là số sóng (cm-1), ưu điểm của việc dùng số sóng là là chúng tỷ lệ thuận với năng lượng

Căn cứ vào phổ hồng ngoại đo được đối chiếu với các dao động đặc trưng

phân tử có thể có nhiều dao động khác nhau và phổ hồng ngoại của các phân

tử khác nhau thì khác nhau, tương tự như sự khác nhau của các vân ngón tay

Sự chồng khít lên nhau của phổ hồng ngoại thường được làm dẫn chứng cho hai hợp chất giống nhau

Khi sử dụng phổ hồng ngoại để xác định cấu trúc, thông tin thu được chủ yếu là xác định các nhóm chức hữu cơ và những liên kết đặc trưng Các pic nằm trong vùng từ 4000 - 1600 cm-1 thường được quan tâm đặc biệt, vì vùng này chứa các dải hấp thụ của các nhóm chức, như OH, NH, C=O, C≡N… nên được gọi là vùng nhóm chức Vùng phổ từ 1300 - 626 cm-1 phức tạp hơn và thường được dùng để nhận dạng toàn phân tử hơn là để xác định nhóm chức Chính ở đây các dạng pic thay đổi nhiều nhất từ hợp chất này đến hợp chất khác, vì thế vùng phổ từ 1500 cm-1 được gọi là vùng vân ngón

tay

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng

Lá cây Sen hồng (Nelumbo nucifera) được thu hái tại phường Ninh Xá,

thành phố Bắc Ninh vào tháng 3 năm 2016 Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại phòng Hóa sinh ứng dụng, viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công

- Sắc ký cột (CC) sử dụng Silica gel Merck cỡ hạt 40-60 µm

- Sắc ký cột (CC) với pha tĩnh là Sephadex LH-20

- Thuốc hiện trong phân tích TLC: FeCl3, Ceri sulfat, Vanilin/ H2SO4 đặc

2.1.3 Thiết bị nghiên cứu

- Điểm nóng chảy được đo trên máy HMK 70/3159

- Phổ hồng ngoại được ghi trên máy FTIR Impact-410

- Phổ khối phun mù điện tử (ESI-MS) được đo trên máy sắc ký lỏng ghép khối phổ với đầu dò MSD (LC/MSD Agilen series 1100), sử dụng mode ESI và đầu dò DAD

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được ghi trên máy Bruker Avance

500 MHz với TMS là chất chuẩn nội

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp xử lý và ngâm chiết mẫu thực vật

Lá cây sen hồng (Nelumbo nucifera)(28 kg) phơi trong bóng mát cho khô

tự nhiên, sau đó nghiền nhỏ thu được 5,5 kg lá khô Mẫu khô được ngâm chiết

với EtOH 70% trong 5 lần (24 giờ/lần), lọc lấy phần dịch và cất loại dung môi

dưới áp suất giảm thu được cặn EtOH

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ ngâm chiết lá cây Sen hồng Nelumbo nucifera

Cặn tổng EtOH thêm nước, sau đó chiết phân bố với n-hexan với tỉ lệ 1/1 (4 lần), thu phần dịch n-hexan để cất loại dung môi thu được cặn n-hexan (110

g) Tiếp theo, axit hóa phần nước bằng HCl và chiết với ethylacetat (4 lần), thu lấy phần dịch EtOAc, cất loại dung môi thu được cặn ethylacetat (800 g) Loại

bỏ nước ở phần dịch còn lại thu được cặn nước (700 g)

Quá trình ngâm chiết lá cây Sen hồng được trình bày trong Sơ đồ 2.1

2.2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất tự nhiên

Cặn chiết ethylacetat của lá cây Nelumbo nucifera (50g) được phân tách trên cột silicagel (150g) với hệ dung môi rửa giải là n-hexan/EtOAc/MeOH

gradient thu được 10 phân đoạn ký hiệu từ F1 đến F10 Phân đoạn F3 (1,1g) được tinh chế trên cột Sephadex LH-20 với dung môi MeOH thu được 2 phân đoạn nhỏ F3.1 và F3.2 Kết tinh phân đoạn F3.2 với hệ dung môi

CH2Cl2/MeOH thu được hợp chất NN3 (30mg) dưới dạng chất rắn màu vàng

Từ phân đoạn F5 (2,5 g),tinh chế trên cột sillica gel với hệ dung môi

CH2Cl2/MeOH gradient thu được 2 phân đoạn nhỏ F5.1 và F5.2 Phân đoạn F5.2 được tinh chế trên cột Sephadex LH-20 với dung môi MeOH thu được

chất NN1 (35 mg) Từ phân đoạn F7 (11 g), tiến hành tinh chế trên cột Sephadex

LH-20 với dung môi MeOH thu được 2 phân đoạn nhỏ F7.1 và F7.2 Phân đoạn nhỏ F7.1 được tiếp tục tinh chế trên cột Sephadex LH-20 với dung môi MeOH

thu được chất NN2 (50mg) Phân đoạn F8 (3,7g) được phân tách trên cột

Sephadex LH-20 với dung môi MeOH thu được 4 phân đoạn nhỏ F8.1-F8.4 Phân đoạn F8.1 (300 mg) được tinh chế trên cột Sephadex LH-20 với dung môi MeOH và sắc ký bản mỏng điều chế với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH 10% thu

được chất NN4 (4 mg) Phân đoạn nhỏ F8.2 (1,6 g) được phân tách trên cột

sillica gel với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH gradient và sắc ký bản mỏng điều chế với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH 20% thu được chất NN5 (15 mg) Phân

đoạn nhỏ F8.3 (220 mg) tiếp tục được tinh chế trên cột Sephadex LH-20 với

dung môi MeOH thu được chất NN6 (11mg)

Quá trình phân lập các chất từ cặn EtOAc của lá cây sen hồng được trình

bày trong Sơ đồ 2.2

Sơ đồ 2.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn EtOAc của lá Sen hồng

2.3 Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các chất phân lập được

J = 2,0 Hz, H-8); 6,21 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6)

Hz, H-2’’); 3,47 (1H, t, J = 9,0 Hz, H-3’’)

13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) (ppm): 179,2 (C-4); 170,7 (C-6’’); 166,1

(C-7); 163,0 (C-5); 159,4 (C-9); 158,5 (C-2); 149,8 (C-4’); 145,9 (C-3’); 135,4 (C-3); 123,5 (C-6’); 122,9 (C-1’); 117,3 (C-2’); 115,9 (C-5’); 105,6 (C-10); 104,8 (C-1’’); 99,9 (C-6); 94,8 (C-8); 77,3 (C-3’’); 77,1 (C-5’’); 75,3 (C-2’’); 72,7 (C-4’’); 52,8 (OCH3)

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Từ cặn chiết EtOAc của lá sen hồng, bằng các phương pháp sắc ký và

kết tinh phân đoạn đã phân lập được 6 hợp chất ký hiệu từNN1 đến NN6

Cấu trúc hóa học của các hợp chất này đã được xác định nhờ phân tích các dữ liệu phổ bao gồm phổ MS, 1D và 2D NMR, đồng thời so sánh với các tài liệu đã công bố trước đây đối với các hợp chất đã biết Việc phân tích cấu trúc của các hợp chất được trình bày dưới đây:

3.1 Phân tích cấu trúc hóa học hợp chất catechin (NN1- C 15 H 14 O 6 )

Hợp chất catechin (NN1- C 15 H 14 O 6 ) được phân lập dưới dạng chất rắn màu vàng, đnc: 241-242ºC Phổ khối ESI-MS của NN1 cho pic ion phân tử

proton hóa ở m/z 291 [M+H]+ Trên phổ IR có các đỉnh hấp thụ mạnh của nhóm

OH và vòng thơm aromatic ở 3387, 1611, 1520 cm 1

Hình 3.1 Phổ ESI-MS của hợp chất catechin (NN1)

Phổ 1H-NMR và 13C-NMR cho thấy sự có mặt của 1 nhóm CH2 ở H 2,55

(1H, dd, J = 8,5; 16,0 Hz, H-4b); 2,97 (1H, dd, J = 6,0; 16,0 Hz, H-4a); C 27,6 (C-4) và 2 nhóm methin gắn với oxi ở H 4,59 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-2); C 81,7 (C-2) và và  4,02 (1H, m, H-3);  67,9 (C-3) là các tín hiệu đặc trưng cho vị