thuc hanh vi sinh ung dung

Mật độ tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1ml mẫu được tính như sau: ACFU/g hay CFU/ml=N/n1v1f1+…+nivifi Trong đó:A: số tế bào đơn vị hình thành khuẩn lạc N: tổng số khuẩn lạc đếm được t

Bài 1 ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ 1.Định nghĩa

Vi khuần hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có Oxy Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh thực phẩm Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc hình thành trên môi trường thạch dinh dưỡng Đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU)

2.Chuẩn bị mẫu và môi trường

2.1.Chuẩn bị mẫu

Đong 25ml rượu trong túi nilon , sau đó bổ sung 225ml dung dịch SPW

Đồng nhất mẫu

Pha loãng mẫu sau khi đồng nhất

2.2.Chuẩn bị môi trường

Môi trường PCA: là môi trường sử dụng dể đếm vi sinh vật gián tiếp

Môi trường nước muối pha loãng SPW

Được khử trùng 121oC ,15 phút

3.Quy trình thực hiện

Đong 25ml rượu, bổ sung 225ml SPW, đồng nhất mẫu 30s

 Pha loãng thành chuỗi nồng độ 10-1,10-2,10-3

 Chuyển 1ml nồng độ pha loãng vào đĩa petri (Đổ môi trường vô sau để những vi sinh vật

ky khí không phát triển, tạo điều kiện vi sinh vật hiếu khí phát triển)



Rót vào mỗi đĩa 20ml môi trường PCA



Ủ đĩa đã cấy 30oC/72h 

Đếm khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa Tinh kết quả

Mật độ tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1ml mẫu được tính như sau:

A(CFU/g hay CFU/ml)=N/n1v1f1+…+nivifi

Trong đó:A: số tế bào( đơn vị hình thành khuẩn lạc )

N: tổng số khuẩn lạc đếm được trong các đĩa đã chọn

Ni: số đĩa đã cấy tại các độ pha loãng

V: thể tích dịch mẫu cấy vào trong mỗi đĩa

Fi: độ pha loãng tương ứng

Ở nồng độ 10-1

số lượng khuẩn lạc đếm được

<25, kết quả được ghi:

<2,5*102

Kết luận; do thời gian ủ chưa đủ đề xuất hiện nhiều khuẩn lạc Nồng độ cồn ức chế vi

khuẩn hiếu khí

Hệ số pha loãng Đĩa petri

BÀI 2 ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ NẤM MEN, NẤM MỐC

1. Nguyên tắc

Nấm mốc là vi nấm dạng sợi, sinh sản bằng bào tử hoặc khuẩn ty Nấm men

là những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, thỉnh thoảng tồn tại ở dạng khuẩn ty giả trong đó các tế bào kết nhau thành chuỗi Đơn vị hình thành khuẩn lạc nấm men, nấm mốc là mầm để tạo nên một khuẩn lạc khi nuôi cấy trong môi trường Mầm có thể là 1 tế bào, 1 bào tử, hay 1 đoạn của khuẩn ty Trong thực phẩm, nấm men, nấm mốc hiện diện có thể làm thay đổi màu của thực phẩm, làm phát sinh mùi vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cấu trúc thực phẩm

2. Môi trường

Dung dịch pha loãng SPW

Môi trường thạch DRBC được sử dụng cho mẫu có hàm lượng nước cao dễ lan truyền nấm mốc vì môi trường có chứa dichloran và rose Bengal làm ngăn cản sự phát triển của nấm mốc mọc nhanh, do đó cho phép phát hiện những nấm mốc mọc chậm

3.Quy trình thực hiện

Đồng nhất và pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10-1,10-2

Nuôi cấy trong môi trường thạch DRBC, ủ ngửa 30oC, 3-4 ngày

Xuất hiện nấm mốc trắng có rìa

Đếm khuẩn lạc nấm men,nấm mốc, tính mật độ

Hệ số pha loãng Nấm men+ nấm mốc

Số lượng khuẩn lạc nấm men và nấm mốc được tính như sau:

A(CFU/g hay CFU/ml)=N/n1v1f1+…+nivifi

Trong đó:A: số tế bào( đơn vị hình thành khuẩn lạc )

N: tổng số khuẩn lạc đếm được trong các đĩa đã chọn Ni: số đĩa đã cấy tại các độ pha loãng

V: thể tích dịch mẫu cấy vào trong mỗi đĩa

Fi: độ pha loãng tương ứng

Ở nồng độ 10-1 số lượng khuẩn lạc đếm được <25, kết quả được ghi: <2,5*102

Kết luận:1 số vi khuẩn có lợi, hoặc nồng độ cồn cao đã ức chế nấm men, nấm mốc phát triển

BÀI 3

KIỂM NGHIỆM SAMONELLA TRONG THỰC PHẨM

1. Nguyên tắc

Samonella là trực trùng gram âm, hiếu khí, kỵ khí tùy nghi, có khả năng di động không tạo bào tử, lên men glucose và manitol, sinh acid nhưng không len men saccharose và lactose, không sinh indole, không phân hủy urea, không có khả năng tách nhóm amine từ tryptoplan, hầu hết các chủng đều sinh H2S

Samonella có thể phát hiện bằng 4 bước: tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập, khẳng định Vi khuẩn này thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ và cùng

hiện diện chung với 1 số lượng lớn vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae có tính cạnh tranh và ức chế sự tăng trưởng của Samonella

2. Quy trình thực hiện

Gồm 4 bước:

Đong 25ml rượu, đồng nhất với 225ml môi trường BPW, ủ ở 37oC trong 18-24h

Bước 1:Tăng sinh

Chuyển 0,1 ml mẫu sau khi ủ sang ống nghiệm chứa 10ml môi trường RV Ủ 42oC trong 18-24h

Bước 2: Tăng sinh chọn lọc

Cấy phân lập trên môi trường XLD, ủ 37oC trong 24

Bước 3: Phân lập và nhận diện

Chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy lên môi trường TSA, chọn khuẩn lạc màu hồng trong suốt, không có tâm đen ủ 37oC trong 24h

Bước 4: Khẳng định thử nghiệm sinh hóa

+Thử nghiệm sinh H2S trên môi trường KIA/TSI

Sau khi thử nghiệm, phần nghiêng của môi trường KIA có màu đỏ, phần sâu màu vàng.Vì trong môi trường có chất chỉ thị phenol red Chứng tỏ vi sinh vật chỉ lên men đường glucose, bề mặt của ống thạch nghiêng có pH trở nên kiềm, phần sâu có pH acid Do lượng glucose trong phần bề mặt của môi trường được vi sinh vật oxi hóa hoàn toàn thành H2O và CO2 để thu năng lượng Để đáp ứng nhu cầu tăng trưởng, vi sinh vật tiến hành dị hóa pepton trong môi trường do đó giải phóng NH3 làm bề mặt của ống có

pH kiềm Ngược lại, phần sâu oxi không đầy đủ, glucose lên men ky khí sinh acid hữu cơ làm pH giảm

Samonella là một trong số những vi sinh vật tổng hợp được enzyme desulfohydrase

xúc tác sự chuyển hóa trong điều kiện kỵ khí các acid amin chứa lưu huỳnh như cysteine, cystin, methione và giải phóng H2S Các acid amin này là sản phẩm của quá trình thủy phân protein thành acid amin Khí H2S sinh ra sẽ tạo tủa màu đen với chỉ thị sulfide chứa trong môi trường nuôi cấy Khí H2S tạo ra sẽ được phát hiện dựa vào phản úng tạo kết

tủa màu đen FeS giữa H2S và Fe2+ từ ferric ammonium citrate hiện diện trong môi trường

Kết quả TN: Ống nghiệm không xuất hiện vạch đen trong môi trường ,vi sinh vật không sinh H2S

Mục đích dùng để phân biệt một số loài thuộc họ Enterobacteriaceae

Sự lên men đường tạo ra các sản phẩm khí tích tụ bên trong thành bọt khí đẩy thạch lên +Thử nghiệm phân hủy Urea nhằm phát hiện vi sinh vật có mang enzyme urea

Vi sinh vật không phản ứng với ure nên không làm thay đổi pH môi trường, sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên màu vàng cam

Mục đích thử khả năng phân hủy urea cùa vi sinh vật, dùng để phân biệt các vi sinh

vật thuộc họ Enterobacteriaceae.

Một số vi sinh vật tổng hợp enzyme urease xúc tác sự thủy phân của enzyme urea Urea (NH)2CO là diamide của acid carbonic Urease thuộc nhóm các amidase xuc tác sự

thủy phân của liên kết amide giữa C-N trong phân tử urea để giải phóng NH3 và CO2 Sự phóng thích NH3 và CO2 làm tăng pH môi trường chuyển màu từ vàng sang đỏ

Kết quả TN: Vi sinh vật không phản ứng với ure nên không làm thay đổi pH môi trường, sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên màu vàng cam

+Thử nghiệm VP:

Với thuốc thử Barritt:

Mục đích thử nghiệm giúp phân biệt các loài thuộc họ Enterobacteriaceae dựa trên

sự oxi hóa acetoin từ 2,3-butanediol thành diacetyl Sự oxi hóa acetoin thành diacetyl được tăng cường nhờ xúc tác của - naphthol Diacetyl kết hợp với nhân guanidine có trong pepton kết tụ thành phức diacetyl-guanidine có màu đỏ

Họ Enterobacteriaceae có đặc tính chung là lên men sinh hỗn hợp acid như acid

formic, acid acetic, H2 và CO2 Họ này có thể được chia thành 2 nhóm: nhóm không sinh 2,3-butanediol và nhóm sinh 2,3 butanediol Phân tử 2,3-butanediol có thể được chuyển hóa qua lại thành acetoin trong điều kiện có oxi và môi trường có tính kiềm 2,3-butanediol bị oxi hóa thành acetoin nhờ xúc tác của enzyme 2,3-2,3-butanediol dehydrogenase Ngược lại acetoin có thể bị khử thành 2,3-butanediol do hoạt tính của

enzyme diacetyl reductase Ngoài ra acetoin còn bị oxi hóa thành diacetyl, chất này tham gia phản ứng tạo màu trong thử nghiệm VP

Kết quả TN:vi sinh vật có kết quả âm tính với thử nghiệm VP nên có hiện tượng không đổi màu trên bề mặt môi trường

+ Thử nghiệm khả năng lên men mannitol

Mục đích nhằm xác định khả năng sử dụng 1 nguồn carbon nhất định (mannitol) bởi

vi sinh vật để tăng trưởng, khả năng lên men có thể nhận thấy bằng sự chuyển màu của chỉ thị pH trong môi trường và sinh hơi

Khả năng lên men được đánh giá bằng sự làm giảm pH của môi trường Ngoài ra trong quá trình lên men sẽ có bọt khí trong ống Durham

Môi trường sử dụng là môi trường Phenol red broth base có pH= 7,4 Chỉ thị pH trong môi trường màu đỏ là phenol, màu đỏ sẽ chuyển thành màu vàng khi pH môi trường dưới 6,8

Kết quả TN:Sinh acid: (-) môi trường có màu đỏ

Sinh hơi: có bọt khí sinh ra trong ống Durham

Kết luận: Samonella âm tính với 25ml rượu vì không sinh khí H2S và âm tính với sinh acid