công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu virus

Cở sở khoa học virus diệt côn trùngKhi xâm nhập vào cơ thể côn trùng, các virus nhân lên ngay trong nhân hoặctrong chất nguyên sinh của tế bào, phá hủy các mô và làm cho vật chủ chết.. T

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

BÁO CÁO CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT THUỐC TRỪ SÂU VIRUS

GVHD: Phan Phước Hiền

Sinh viên thực hiện : Phan quốc Bảo 13139007

Ngành: Công nghệ kỹ thuật hóa học

Niên khóa: 2013-2017

Tháng 11/2015

3

Báo cáo đề tài CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT THUỐC TRỪ SÂU VIRUS

Tác giảNhóm sinh viên thực hiện

MỤC LỤC

Trang

Trang tựa………i Mục lục……… ii

5

DANH SÁCH HÌNH VÀ BẢNG

Trang

Hình 1 Acid nucleic……… 3

Hình 2 Cấu tạo virus……….3

Hình 3 Ảnh kính hiển vi điện tử quét thể vùi dạng cầu của NPV (A), thể vùi (B) và dạng hạt (C) của Choristoneura fumiferna……….5

Hình 4 Sâu khỏe mạnh (A), sâu bị nhiểm bệnh (B)……….……6

Hình 5 Sự lây nhiểm NPV vào côn trùng……….…7

Hình 6 Các bước để phân lặp virus diệt côn trùng……… 10

Hình 7 Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm virus………12

Hình 8 Phương pháp thủ công SX chế phẩm NPV cho nông dân……….….12

Hình 9 Phương pháp sản xuất NPV trong phòng thí nghiệm……….13

Bảng 1: Các chỉ tiêu đánh giá chế phẩm NPV dạng bột……… 17

Bảng 2 Ví dụ về các loại thuốc trừ sâu virus thương mại đã đăng ký để kiểm soát dịch hại ở các nước khác nhau……… 20

1. TỔNG QUAN VỀ THUỐC TRỪ SÂU VIRUS

1.1. Mở đầu

Virus diệt côn trùng đã được nghiên cứu nhiều năm vì mối quan tâm đặc biệtđến dịch bệnh của động vật không xương sống Điều đặc biệt hơn là khả năng sửdụng virus như một trong những tác nhân chống dịch hại tốt nhất lại không làm ônhiểm môi trường Virus là một nhóm vi sinh vật có kích thước rất bé phải quan sát

nó dưới kính hiển vi điện tử Kích thước lớn nhất của virus là 400nm, nhỏ nhất là13-20 nm.Vật chủ của virus là tế bào người, động vật , vi khuẩn và côn trùng Virus

có khả năng sinh sản từ 1 phần của nó thành 10-100 phần mới Quá trình sinh sảncủa virus chỉ xảy ra trong tế bào Virus không có cấu tạo tế bào, thành phần hóa họcđơn giản Virus gây nhiểm trong tế bào và có khả năng lan truyền Virus chỉ mangmột loại vật chất duy truyền là acid nucleic, AND, hay ARN

1.2. Lịch sử phát hiện virus diệt côn trùng

Lịch sử cổ đại ghi nhận những phát hiện về bệnh tằm dâu và ong khi con ngườibắt đầu nhân nuôi, thuần dưỡng hai loài côn trùng có ích này

Năm 384-322 Trước công nguyên Aristotle đã miêu tả bện của ong, nhưngngười Trung Quốc đã có những quan sát về bệnh tằm dâu từ 2700 năm trước côngnguyên

Năm 1856 Cornalia và Maestri đã mô tả bệnh tằm nghệ - bệnh virus Các tácgiả này đã phát hiện thấy các thể đa diện trong cơ thể tằm Bolle (1898) mô tả sựhòa tan thể đa diện trong ruột tằm và giải phóng các hạt

Năm 1919 Akkva, Komarek và Breidl (1923) đã phát hiện dịch qua lọc có bảnchất virus và gây bệnh, tạo nên những thể đa diện ở côn trùng

Người đầu tiên nhìn thấy virus gây bệnh côn trùng là Bergold trong những côngtrình công bố 1943-1947 sau khi có kính hiển vi điện tử

1.3. Cở sở khoa học virus diệt côn trùng

Khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng, các virus nhân lên ngay trong nhân hoặctrong chất nguyên sinh của tế bào, phá hủy các mô và làm cho vật chủ chết Nhữngcôn trùng còn sống sót vẫn tiếp tục bị ảnh hưởng trong giai đoạn nhộng ( nhộng bịthối, ngài vũ hóa bị biến dạng), trong giai đoạn ngài ( khả năng đẻ trứng giảm) vàảnh hưởng tới các thế hệ sau Nguồn virus tồn đọng trong tự nhiên lại gây lây nhiểmcho thế hệ mới Trên cơ sở khoa học này, virus gây bệnh côn trùng ngày càng đượcchú ý nghiên cứu và được coi là một trong những nhân tố có triển vọng trongphương pháp đấu tranh sinh học phòng chống sâu hại cây trồng trong tương lại.Năm 1923, Tanaka và Kaya đã miêu tả hơn 20 nhóm (họ) virus gây bệnh chocôn trùng Trong đó 2 họ được nghiên cứu nhiều là Baculoviridae và Reoviridae.Đại diện của hị Baculoviridae là virus đa diện (NPV – Nuclear polyhedrosisviruses) và đại diện của họ Reoviridae là virus đa diện tế bào chất (CPV –Cytoplasmic polyhedrosis viruses)

Theo Hukuhara và Bonami (1991) thì CPVs ký sinh trong 4 bộ côn trùng haygặp nhất bộ cánh vảnh – Lepidoptera có 201 vật chủ, bộ hai cánh – Diptera – 39 vật

chủ Tuy nhiên chỉ có CPV của sâu Dendrolimus spectabilis là được sản xuất và

đăng kí là thuốc trừ sau sinh học virus Mặc dù thuốc CPV có hiệu quả diệt sâu,nhưng người ta vẫn ít quan tâm phát triển nó hơn Baculovirus, vì lý do chủ yếu làCPVs chỉ tấn công tế bào mô ruột của sâu và có xu hướng gây ra nhiểm trùng mãntính Hơn nữa trong điều kiện tự nhiên, chúng gây bệnh dịch có tỷ lệ thấp với tỷ lệthấp và ít ảnh hưởng tới quần thể vật chủ như Baculovirus Tuy nhiên chúng có thểnhân nuôi theo quy mô lớn trong công nghiệp

Theo các tác giả Granados và Federici (1986); Possee (1993); Tanada và Kaya(1993), có hơn 600 loài sâu thuộc bộ Lepidoptera, Hymenoptera, Coleoptera,Diptera… là vật chủ của Baculovirus Do đó có rất nhiều nghiên cứu và sản xuấtthuốc trừ sâu virus này Hầu hết Baculovirus thuộc tính chuyên hóa cao, chỉ ký sinhtrong một loài sâu, thậm chí ký sinh một số mô nhất định nào đó của sâu

(Groner,1986), Baculovirus của Autographa California (AcMNPV) và Baculovirus của Autographa falcifera có vật chủ hơn 30 loài côn trùng thuộc bộ cánh vảy –

9

ADN virrut ARN virut

Lepidoptera Những tác động có hại của Baculovirus đối với thiên địch và các ong

kí sinh trưởng chưa thành chưa được phát hiện trong tự nhiên (Groner,1990) Vậychúng ta sẽ tập trung tìm hiểu chủ yếu về nhóm Baculovirus với đại diện tiêu biểunhất của nhóm này

1.4. Sơ lược về hình thái và cấu tạo virus diệt côn trùng

1.4.1.Sơ lược chung về virus

Cấu trúc: Vỏ và nhân

• Virus có cấu tạo vỏ la Capsid có bản chất protein

• Trong vỏ capsid là nhân (Nucleoid) chứa AND hoặc ARN

Hình thái: virus có cấu trúc hình học, 5 – 6 đến 20 cạnh với nhiều nhóm viruskhác nhau Các acid nucleic (AND, ARN) gồm dạng sợi đơn và sợi đôi:

Hình 1 Acid nucleic

có vỏ, hoặc là một nucleocapsid trần gọi là virus không vỏ:

Hình 2 Cấu tạo virus

• Nucleocapsid là cấu trúc bao gồm capsid và acid nucleic

• Capsid là một vỏ protein của hạt virus bao gồm nhiều capsomer

1.4.2.Nhóm virus diệt côn trùng Baculovirus

Baculovirus chứa AND kép, khép kín Kích thước hệ gen từ 80 – 180kbp.Người ta đã tìm thấy 120 – 160 khung đọc trình tự phân giải mã bộ gen của virus.Trên hệ gen, ngoài các trình tự mã hóa còn có nhiều trình tự ngắn lặp lại (được gọi

là các vùng tương đồng) trải khắp hệ gen Những vùng nay giúp tăng cường khẳnăng phiên mã sớm của gen, đồng thời hoạt động như những vùng khởi đầu phiênmã.Nhiều gen trong hệ gen của Baculovirus có gen gối nhau Cho phép mã hóađược nhiều gen trong khi chúng có hệ gen với kích thước nhỏ

Baculovirus có hình quen điển hình, có đường kính 30 – 60nm, dài 250 –300nm

11

Polyhedra: Các virus tập trung lại trong một thể đa dien (thể bọc), được quansát dưới kính hiển vi quang học Thể bọc được tạo ra ở giai đoạn muộn trong chu kìlây nhiểm của virus, thể này được bọc trong một lớp giàu protein, cấu trúc này đượcgọi là polyhedral, giúp virus lây nhiểm sang tế bào mới và giúp chúng chống chịuđược với điều kiện tự nhiên, do đó có thể tồn tại trong thời gian dài ngoài cơ thể vậtchủ.

Virus nảy chồi: gặp khi virus lây nhiểm vào cơ thể côn trùng hoặc được nuôicấy trong điều kiện thích hợp Virus nảy chồi chỉ mang duy nhất một nucleocapsidđược bao bọc bởi lớp vỏ có nguồn gốc từ màng sinh chất củ vật chủ Các proteintrên lớp vỏ này như protein GP64 có vai trò quan trọng trong việc giuwps virus lâynhiểm

Hiện nay, Baculoviridae được chia thành hai chi:

Nucleopolyhedrovirus (NPV) được đặc trưng bởi sự hình thành thể bọc đa diện.Trong mỗi thể bọc chứa nhiều virus, virus nhân lên và tạo vỏ bọc trong nhân của tếbào ký chủ

Granulovirus (GV) được đặc trưng bởi sự tạo thành thể bọc hình elip, hoặc hìnhgậy hai đầu tròn Trong mỗi thể bọc chỉ có một virion Virus tiến hành nhân lên vàtạo vỏ bọc trong nhân tế bào chủ

Tuy nhiên có trường hợp ngoại lê, virus nhân lên trong tế bào chất

1.4.3.Nuclear polyhedrosis virus (NPV)

NPV có dạng hình gậy, chứa AND, nucleocapsis, có kích thước 35 50 x 200

-320 nm Các hạt virus có một lớp bọc bên ngoài gọi là nhân capsis (Harap, 1972).Hơn nữa NPV có một đặc tính là hình thành các protein tinh thể trong nhân của tếbào côn trùng với kích thước từ 0,5 - 15 nm (Smith, 1976).NPV có hai dạng:

• NPV hình thành thể vùi đa diện (Polyhedrosis Inclusion Body - PIB) chứamột nhân capsis trong một vỏ bọc virus Do đó NPV loại này được gọi làSNPVs (hoặc SEVs)

• NPV hình thành các thể vùi đa diện chứa nhiều nhân capsis trong một vỏvirus gọi là MNPVs (hoặc MEVs) (Rammosca & Hink, 1974)

Hình 3 Ảnh kính hiển vi điện tử quét thể vùi dạng cầu của NPV (A), thể

vùi (B) và dạng hạt (C) của Choristoneura fumiferna.

Phân tích trên các kính hiển vi điện tử thấy các thể vùi đa diện nhân là nhữngtinh thể lớn, nhiều cạnh, có dạng như hình cầu (Hình 3), hình vuông, kích thước từ

1 – 4 µm Các thể vùi này có cấu tạo bởi các thể protein Các lát cắt cực mỏng(microtom) phóng đại trên 60.000 lần cho thấy các khối đa diện (polyhedra) chứanhiều virion hình que Các virion (hay hạt virus) của NPV sâu xanh chỉ có mộtnucleocapsis trong một lớp vỏ bao và nucleocapsis này cũng có dạng hình que Cáckhối đa diện có đặc điểm dễ bị kiềm hóa, dùng 1/10N NaOH có thể phá vỡ các vỏ

đa diện giải phóng các virion, chính vì vậy trong ruột côn trùng, dịch ruột mang tínhkiềm nên các polyhedral dễ bị phân hủy để lây nhiễm tiếp vào các nhân của các tếbào khác Mỗi nucleocapsid chỉ chứa một sợi đôi AND dạng vòng Trọng lượngphân tử 75 – 100.106 Da

2. CƠ CHẾ GÂY BỆNH CỦA VIRUS DIỆT CÔN TRÙNG

2.1. Triệu chứng gây bệnh

Sau khi NPV vào cơ thể ký chủ côn trùng bằng đường tiêu hóa, sâu non ngừng

ăn Cơ thể sâu biến đổi về màu sắc Sau 2-3 ngày cơ thể sâu căng phồng mọngnước Cơ thể có màu vàng hoặc trắng Hạ bì dễ bị nứt, chuyển động chậm, chếtnhanh Ngoài đồng ruộng sâu chết do virus thường quan sát thấy đầu chúc xuốngdưới, dịch trắng chảy ra ngoài

Hình 4 Sâu khỏe mạnh (A), sâu bị nhiểm bệnh (B).

13

2.2. Nguyên nhân gây bệnh

Nguyên nhân là do các thể vùi PIB gây ra Biết được nguyên nhân gây bệnh củavirus côn trùng trong quá trình sản xuất, người sản xuất phải chú ý để nâng cao việcsản xuất virus tạo nhiều thể vùi PIB nhất trên 1 đơn vị (g hoặc ml) để có hiệu quảdiệt sâu cao

2.3. Cơ chế gây bệnh

Hình 5 Sự lây nhiểm NPV vào côn trùng

Khi sâu non ăn thức ăn vào ruột có virus lẫn trong thức ăn cũng như virus nhân

đa diện bằng con đường tiêu hoá virus xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng đã thực hiệnmột qua trình phá huỷ toàn bộ chức năng trong ruột của sâu Cơ chế gây bệnh được

mô tả như sau:

tế bào thực hiện quá trình sao chép, phiên mã và dịch mã tạo ra các virionmới.

• Virion mới nhảy chồi, thoát ra khỏi tế bào thành ruột trở thành dạng virusnảy chồi Do lớp bọc ngoài là từ mang tế bào thành ruột nên các virus nàyxâm nhập tiếp vào các tế bào thuộc các mô khác của côn trùng

• Virus tấn công vào các tất cả các tế bào khác nhau trong cơ thể vật chủ, ởmỗi tế bào chu trình trên lại được tiếp tục Tuy nhiên, thay vì tạo ra cácvirion nảy chồi, các virus mới tạo ra tập hợp lại, được bao bởi các proteinpolyhedrin đặc biệt tạo ra các cấu trúc thể bọc gây tan tế bào Vật chủ bịtiêu diệt giải phóng hàng loạt thể bọc Các thể bọc này lại tiếp tục tấn côngvào cơ thể mới

Sự nhiễm bệnh của sâu thường trải qua ba giai đoạn:

• Giai đoạn tiệm ẩn: kéo dài khoảng 12 giờ Đây là giai đoạn xâm nhập củavirus vào bên trong tế bào Các virus cài vào các thụ thể của màng củanhân tế bào

• Giai đoạn tăng trưởng: kéo dài khoảng 12-48 giờ Virus tăng trưởng nhanhtrong giai đoạn này Trong nhân tế bào các vật chủ, xuất hiện các cấu trúcmạng lưới Sau 32 giờ trong nhân tế bào vật chủ chứa đầy các virionkhông vỏ

• Giai đoạn cuối: Ở giai đoạn này xảy ra sự tạo thành thể vùi, nghĩa là cácvirion được bao bọc trong thể protein Giai đoạn này kéo dài 2-7 ngày.Thời kỳ ủ bệnh của các côn trùng gây bệnh thường kéo dài từ 3-12 ngày, phụthuộc vào tuổi của vật chủ, nhiệt độ, độ ẩm, và các điều kiện khác của môi trường.Việc lây truyền nguồn bệnh virus ở côn trùng xảy ra theo hai hướng:

• Lây truyền ngang: Nguồn bệnh lây lan giữa các cá thể trong cùng một thế

hệ trong điều kiện phát thành dịch, nguồn virus có thể bám vào trứng củavật chủ Khi nở ấu trùng gặm vỏ trứng chui ra và bị nhiễm bệnh

• Lây truyền dọc: Là sự lây truyền bệnh qua trứng và phôi Trong invitro sựxâm nhập của NPV vào tế bào mẫn cảm bằng cách các vỏ virus hấp thụtrên bề mặt tế bào và các virus này đi vào tế bào chất bằng thực bào Cáccapsit nhân lên trong tế bào chất và tương tác với các lỗ rò của màng nhân

để đi vào nhân (Nucleoplasm)

15

Trong quần thể sâu hại tự nhiên côn trùng không chỉ bị một bệnh do một loạivirus gây ra mà còn bị nhiễm bệnh hỗn hợp của 2 loại virus Thông thường đó làhỗn hợp giữa NPV và CPV Có loài côn trùng cùng một lúc có tới 9 virus gây bệnh.Đến nay sự nhiễm bệnh hỗn hợp của nhiều loại virus đã được biết ở 198 loại côntrùng.

Tác động qua lại giữa các virus trong quá trình nhiễm bệnh biểu hiện theo bakiểu: Đồng tác động, tác động không phụ thuộc vào nhau và tác động gây nhiễukhác nhau Khi có hiện tương đồng tác động các virus trong cùng một cơ chế xuống50% Điều này rất có ý nghĩa trong thực tiễn sản xuất Ngược lại hiện tượng tácđộng nhiễu làm giảm hiệu lực gây bệnh của virus và làm giảm hiệu quả của chếphẩm, vì vậy khi sản xuất chế phẩm cần loại trừ các virus có tác động nhiễu Chếphẩm NPV không dùng trong quần thể sâu hại có bệnh CPV vì giữa hai nhóm nàythường có tác động nhiễu lên nhau

3. QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT THUỐC TRỪ SÂU VIRUS

3.1. Giới thiệu

Trên thế giới công nghệ sản xuất chế phẩm virus trừ sâu đã được nhiều nướcthực hiện như Mỹ, Nga, Pháp, Ấn Độ, Trung Quốc… Ở nước ta có một số cơ sởnghiên cứu như Viên Bảo vệ thực vật, Viên công nghệ sinh học đã sản xuất và ứngdụng có hiệu quả đối với một số sâu, đặc biệt sâu xanh, một số loại sâu gây hại lớncho cây trồng và đã kháng với thuốc hóa học bảo vệ thực vật

Cơ chế diệt sâu của virus được thực hiện khi virus xâm nhập vào cơ thể côntrùng, chúng nhân lên và phát triển ngay trong nhân hoặc trong nguyên sinh chấtcủa tế bào Khi virus nhân lên với số lượng lớn, chúng phá hủy tế bào và xâm nhậpvào các tế bào khác, cứ như thế dẫn tới phá hủy các mô và làm cho côn trùng chết

3.2. Nguyên tắc sản xuất thuốc trừ sâu virus

Nuôi sâu làm vật chủ để nhân bản virus vì virus chỉ nhiểm vào tế bào sống.Sâu kí sinh được nuôi trong buồng nuôi bằng thức ăn nhân tạo, đến giai đoạn ấutrùng thì dịch huyền phù virus được cấy vào thức ăn để lây nhiểm cho sâu Sau 7 –

3.3. Phân lập virus diệt côn trùng

Phân lập virus từ vật chủ mà trong đó virus ký sinh là một bước quan trọngtrong nghiên cứu chuẩn đoán bệnh hoặc cho mục đích đặc biệt cần đến độ tinh khiếtcao của hạt virus Phương pháp phân lập gồm các bước sau:

Thu mẩu côn trùng bị bệnh cho vào cối, cho nước cất và nước khử ion 2 lầnhoặc đệm Tris, pH 7.3 – 8.0, nghiền, lọc bỏ bã Lấy dịch lọc ly tâm 500 vòng/phút,

bỏ cặn, lấy dịch ly tâm

Hình 6 Các bước để phân lặp virus diệt côn trùng

3.4. Phương pháp sản xuất chế phẩm virus

Có 2 phương pháp: phương pháp sản xuất in vivo và phương pháp sản xuất invitro

3.4.1.Phương pháp sản xuất in vitro

Phương pháp sản xuất in vitro là phương pháp nuôi cấy virus trên mô tế bào.Phương pháp này được nguyên cứu từ năm 1962 do Grace thực hiện, sau đó đượcGoodwin CS phát triển thành kĩ thuật nuôi cấy tế bào (1970) Những dòng tế bào

thường gặp tiêu biểu cho các loại sâu quan trọng bao gồm Autographa californica,

Spodoptera frugiperda Các dòng tế bào này được tách từ sâu tuổi nhỏ và nuôi trong

các nồi phản ứng sinh học, có một lượng nhỏ môi trường có thành phần gồm huyết

17