TIEU LUÂN CÔNG NGHỆ SINH HOC

hiện tượng nhiễu RNA, công việc này ở thực vật ủng hộ đề xuất nhiễu RNA liên quan tới sự bảo vệ tế bào chống lại sự xâm nhập của virus [1].Ở cây trồng các phương pháp phòng chống bệnh vi

I Mở đầu

Fire và Mello đã nhận được giải Nobel năm 2006 nhờ công trình nghiên cứu đột phá của họ về cơ chế gây bất hoạt gen bởi các RNA ngắn, sợi kép và đặt tên cho công nghệ mới này là RNA interference trong tạp chí Nature năm 1998 Bởi vì cả sợi có nghĩa và sợi đối nghĩa RNA đều có thể gây bất hoạt gen, nên nhóm tác giả này cho rằng cơ chế gây bất hoạt gen sẽ không chỉ là sự bắt cặp của sợi đối nghĩa RNA đối với mRNA (như ở vi khuẩn) và họ đưa ra khái niệm RNA interference chưa được biết đến [1] Trên cơ sở đó các nhà khoa học đã có

những nghiên cứu về cơ chế RNA interfernce để ứng dụng trong thức tiễn Công nghệ RNA

interference có rất nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau và mang lại những ý nghĩa hết sức to lớn không những về mặt kinh tế mà còn về mặt nâng cao sức khỏe cho con người Vì vậy để đi sâu tìm hiểu những ứng dụng của công nghệ RNA interference nên em đã chon đề

tài:”MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA CÔNG NGHỆ RNA INTERFERENCE”.

II Mục đích

Làm sáng tỏ vấn đề mà đề tài nêu ra:”MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA CÔNG

NGHỆ RNA INTERFERENCE”.

III Phương pháp nghiên cứu

Để thực hiện đề tài, người thực hiện đã tham khảo, tổng hợp tài liệu, phân tích,

so sánh, đánh giá, chọc lọc, khái quát hóa thông tin để giải quyết vấn đề mà đề tài đã nêu ra

IV Nội dung

1 Khái niệm về công nghệ RNA interference (RNAi)

Công nghệ RNAi là một công nghệ mới mẽ, chỉ cần một vài phân tử dsRNA trong một tế bào cũng đủ để phân hũy các mRNA của một gen đặc thù Kết quả thực nghiệm cho thấy công nghệ RNAi có thể gây bất hoạt gen một cách hiệu quả ở bất kì

cơ thể nhân thực nào Theo một số báo cáo thì công nghệ này có hiệu quả hơn công nghệ gen đối nghĩa khoảng 1000 lần Dựa trên các thành tựu của chương trình genomics, trình tự của hầu hết các gen quan trọng đều có thể được xác định, từ đó người ta có thể thiết kế các dsRNA tương đồng để gây bất hoạt mọi gen đích Công nghệ RNAi có thể tạo ra cuộc cách mạng trong nghiên cứu y sinh và chữa bệnh [1]

2 Cơ chế hoạt động của RNAi

RNAi là cơ chế ức chế sự biểu hiện vật chất di truyền ở giai đoạn sau phiên mã

Ở thực vật có ba con đường ức chế RNA trong đó con đường đầu tiên là sự ức chế gen sau phiên mã PTGS (post-transcriptional gen silencing) qua trung gian là các RNA nhỏ có vai trò ức chế siRNA (short interfering RNA, dsRNA ngắn) được sử dụng phổ biến nhất trong những nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus Quá trình này xảy

ra ở tế bào chất và là con đường quan trọng trong tế bào thực vật nhiễm virus nơi mà dsRNA hoặc cấu trúc thứ cấp của RNA virus sợi đơn có thể sao chép gián tiếp Trong trường hợp virus DNA, dsRNA có thể được tạo ra nhờ quá trình phiên mã bổ sung liên tiếp Cơ chế cũng xảy ra tương tự như ở động vật Khi có sự xâm nhập của dsRNA, Dicer bản chất là Rnase III đặc hiệu đối với dsRNA để cắt những chuỗi kép RNA ra thành những đoạn ngắn hơn, khoảng 21-25 nucleotide, gọi là siRNA Sau đó, các siRNA kép hình thành được tách ra làm hai chuỗi đơn và chỉ một chuỗi đơn RNA với đầu 5' có lực bắt cặp base (base-pairing) nhỏ nhất tiếp tục liên kết với Argonaute trong phức hệ RISC Tiếp đó, phức hệ RISC đã gắn đoạn siRNA nhận biết các mRNA của tế bào có trình tự tương đồng với trình tự của đoạn chuỗi đơn siRNA này Sau khi nhận dạng mRNA qua việc bắt cặp các base tương đồng với trình tự của chuỗi đơn siRNA, mRNA bị cắt đứt ở khoảng giữa của chuỗi kép siRNA-mRNA thành những đoạn nhỏ khoảng 12 nucleotid từ đầu 3’ Sau khi bị cắt đứt, mRNA nhanh chóng bị tiêu huỷ bởi các RNA nuclease

Hình 1 : Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi [3]

A: Khi vào trong tế bào, dsRNA dài hoạt động là khởi đầu của quá trình RNAi B: Sau đó dsRNA dài được enzyme RNase III Dicer bám vào C: dsRNA dài bị cắt thành các siRNA siRNA cũng có thể được tổng hợp bên ngoài tế bào và sau đó được đưa vào một tế bào thông qua quá trình thâm chuyển hoặc electroporation D: Các siRNA được nạp vào phức hợp RISC Sợi kép ngắn lại được mở xoắn để tạo thành 2 sợi đơn ngắn và một trong hai sợi đó là sợi sợi đối nghĩa E và F: Sợi đối nghĩa RNA trong phức hợp RISC này bắt cặp với các mRNA bằng liên kết tương đồng giữa các base Cuối cùng RISC sẽ phân hũy mRNA [3].

Nghiên cứu RNAi ở ruồi giấm cho thấy dsRNA đã được phân cắt thành các đoạn dsRNA ngắn gồm 21- 23 nucleotide Họ cho rằng các phân tử siRNA đóng vai trò phân hũy mRNA Sau đó nhóm Fire và Millo đã xác minh rằng dsRNA dài đã được cắt thành đoạn RNA ngắn (khoảng 25 nucleotide) và tiếp theo đoạn dsRNA gây

ra sự phân hũy mRNA thông qua việc bắt cặp với mRNA [1]

mRNA đích Tách thành các mạch đơn

dsRNA dài

Hình 2: Cơ chế hoạt động của RNAi [1]

Chúng ta có thể tóm tắt cơ chế hoạt động của RNAi bằng sơ đồ trên RNA sợi kép dài được cắt thành những mảnh nhỏ siRNA bởi enzyme Dicer thông qua phản ứng ATP SiRNA kép sẽ bị tách thành siRNA sợi đơn.Trong đó mạch đối nghĩa được nạp vào phức hợp RISC và liên kết phức hợp với mạch RNA bằng bắt cặp base Phức hợp

RISC cắt mạch RNA và sau đó thì mRNA suy thoái.

Một số enzyme quan trọng tham gia vào quá trình gây bất hoạt gen:

+ Dicer: Ribonuclease III cắt dsRNA thành các đoạn ngắn RNA

+ RICS (RNA induced silencing complex): Là một tổ hợp phức tạp chứa ít nhất một protein họ argonaute

• Hoạt hóa như endonuclease có vai trò cắt mRNA

• Tương tác với DNA, methyl hóa DNA, biến đổi histone, ngăn cản khởi động phiên mã

• Tương tác với mRNA tạo tín hiệu để RNAse phân hủy mRNA

+ RNA dependent RNA polymerase- RdRp: Enzyme tổng hợp RNA trên khuôn RNA tạo nên dsRNA, nhân bản các sợi siRNA (cây trồng, nấm, giun tròn)

+ Enzyme tham gia biến đổi các nhóm chức của protein (histon) nằm trong lõi nucleosom Ví dụ gắn thêm nhóm methyl hoặc khử nhóm acetyl ở một số amino acid đặc biệt trên protein histone làm thay đổi cấu trúc không gian của sợi nhiễm sắc, làm sợi nhiễm sắc cuộn chặt, ngăn cản phiên mã [1]

Hình 3: Cơ chế can thiệp RNA trong tế bào động vật có vú [5]

Trong tế bào chất phía bên trái, dsRNA được xử lý bởi một phức hợp bao gồm Dicer, TAR RNA-dính với protein (TRBP) và activator protein của protein kinase PKR (PACT) cùng với siRNAs được nạp vào Argonaute 2 (AGO2) và phức hợp RISC siRNA điều khiển các mạch nhận nơi để cắt RNA mục tiêu Được thực hiến bởi sự xúc tác của AGO2 siRNA bổ sung cho vùng khởi động làm tắt quá trình phiên mã gen trong nhân thông qua những thay đổi liên quan đến nhiễm sắc methyl hóa histone (trên cùng bên trái); chi tiết phân tử một cách chính xác của phương pháp này trong

tế bào động vật có vú là không rõ ràng Ở phía bên phải, nội sinh mã hóa cơ bản mRNA (pri-miRNA) được phiên mã bởi RNA polymerase II (Pol II) và bước đầu xử lý bởi Drosha-DGCR8 (DiGeorge hội chứng quan trọng gen khu vực 8) để tạo ra tiền miRNA (pre -miRNAs) Những tiền chất được chuyển sang các tế bào chất của exportin 5 và sau đó liên kết với các phức hợp Dicer-TRBP-PACT, mà các quá trình pre-miRNA sẽ nạp vào AGO2 và RISC Các miRNA trưởng thành nhận diện các nơi đặt mục tiêu trong 3 ' khu vực chưa được dịch (3' UTR) của mRNA và điều khiển ức chế dịch mã và mRNA bị phân hủy trong quá trình (P) -body có chứa các enzym

Phân hũy mRNA

Ngăn cản tịnh tiến

Phân tách mRNA

nhân

Tế bào chất Tắt quá trình phiên mã

mRNA

DCP1 và DCP2 Trong đó: H3K9 là histone 3 lysine 9; H3K27 là histone 3 lysine 27;

m7G là 7-methylguanylate; ORF là khung đọc mở [5].

3 Một số đặc tính của công nghệ RNAi

RNA sợi kép là tác nhân gây ra hiện tượng làm bất hoạt gen mạnh hơn là RNA đối nghĩa sợi đơn

Có tính đặc hiệu rất cao, chỉ làm bất hoạt các mRNA có trình tự tương đồng và với mRNA trưởng thành

Có hiệu quả cao và mạnh, chỉ cần một vài phân tử RNA sợi kép là đủ để gây bất hoạt gen của tế bào và virus

Có thể làm câm gen ở các giai đoạn phát triển khác nhau của cá thể hoặc các bước khác nhau trong quá trình sinh hóa cũng như phân hóa tế bào và mô bằng cách liên kết với quá trình biến đổi nhiễm sắc thể trực tiếp qua siRNA, nó bao gồm

sự methyl hóa histone và DNA

Đặc biệt công nghệ RNAi có thể làm bất hoạt cả nhóm gen [1]

4 Một số vai trò của RNAi

4.1 RNAi kìm hãm tổng hợp protein và điều hòa sự phát triển cơ thể sinh vật

Ngay sau khi khám phá ra RNA ngắn là hiệu ứng của sự gây nhiễu RNA, người

ta nhận thấy rằng có một lớp RNA trong hệ gen có ở bộ phận sinh dục, ở sâu bọ cánh cứng, ở chuột và người, RNA ngắn này là miRNA Thực vật cũng chứa đựng một lớp phân tử RNA này trong hệ gen MiRNA mở đầu cho những nghiên cứu sôi nổi trong

tự nhiên về lớp phân tử RNA này MiRNA có thể điều hòa biểu hiện gen bằng cách bắt cặp base với mRNA, kết quả dẫn đến suy thoái mRNA hay tăng cường dịch mã Hiện nay, ước có khoảng 500 miRNAs ở tế bào động vật có vú, và khoảng 30% điều hòa bởi miRNAs Điều đó cho biết miRNAs đóng vai trò quan trọng trong suốt quá trình phát triển ở thực vật và động vật có vú Vì thế, miRNAs phụ thuộc biểu biện gen đặc trưng cho nguyên tắc cơ bản mới của điều hòa gen Tuy nhiên, ý nghĩa đầy đủ của điều hòa RNAi ngắn vẫn chưa rõ ràng [1]

4.2 RNAi là cơ chế bảo vệ cơ thể chống lại sự xâm nhiễm của virus

Người ta sớm nhận ra tế bào thực vật có cơ chế bảo vệ chống lại sự xâm nhập của virus dựa trên hiện tượng PTGS Khi bắt đầu lộ ra PTGS là chất lưỡng trị thay cho

hiện tượng nhiễu RNA, công việc này ở thực vật ủng hộ đề xuất nhiễu RNA liên quan tới sự bảo vệ tế bào chống lại sự xâm nhập của virus [1].

Ở cây trồng các phương pháp phòng chống bệnh virus cơ bản sau đây đang được nghiên cứu:

• Phòng chống các vector truyền bệnh của virus, phương pháp này có thể phải sử dụng rất nhiều thuốc bảo vệ thực vật rất tốn kém, gây ô nhiễm môi trường hoặc thông qua

sử dụng các gen kháng vector truyền bệnh sẵn có ở cây trồng (ví dụ như các nguồn gen kháng rầy, truyền gen lùn ở lúa cỏ ) Tuy vậy khi dịch bệnh đã bùng phát rất khó kiểm soát

• Tạo các giống kháng bệnh từ các gen kháng bệnh có sẵn ở cây trồng Tuy nhiên các chiến lược này gặp rất nhiều khó khăn do thiếu nguồn gen kháng virus có sẵn ở cây trồng Vì thế công nghệ tạo giống truyền thống hầu như đang bó tay trong việc tạo giống kháng bệnh như ở cà chua, đu đủ …

Các công trình nghiên cứu công bố năm 1997 cho thấy cây trồng có hàng rào bảo vệ rất hiệu quả chống lại sự xâm nhiễm của virus dựa trên cơ chế PTCS Bộ máy dsRNA có thể nhận biết được của RNA của virus xâm nhập (hoặc là RNA sợi kép bản sao của virus) và ngăn chặn sự xâm nhập của virus bằng cách phá hủy RNA của virus

Hệ thống RNAi cũng giữ một vị trí quan trọng tương tự trong hệ thống miễn dịch của động vật có xương sống Nó nhận biết sự xâm nhập của sinh vật kí sinh, tạo ra các phản ứng gây bất hoạt gen ban đầu và sau đó khuếch đại phản ứng để loại bỏ hoàn toàn các nhân tố bên ngoài xâm nhập [1]

4.3 RNAi đảm bảo sự bền vững của bộ gen thông qua việc làm bất hoạt gen nhảy

Các gen nhảy gây ra các đột biến bất lợi trong cơ thể Nhóm nghiên cứu của Milo và Fire cho rằng trong vùng chứa gen nhảy của bộ gen, cả hai sợi DNA được sao chép, dsRNA được tạo thành và dẫn đến quá trình RNAi loại bỏ những sản phẩm không mong muốn từ gen nhảy Những phân tử dsRNA ngắn cũng có thể tác động trực tiếp lên sợi nhiễm sắc và ngăn chặn sự dịch mã, đây cũng là một phương thức khác để làm bất hoạt gen nhảy Plasterk (2002) cho rằng, cơ chế gây bất hoạt gen RNAi tạo nên hệ thống miễn dịch của bộ gen [1]

4.4 RNAi làm tăng độ xoắn (độ đông đặc) của nhiễm sắc thể và ngăn chặn quá trình phiên mã

Các gen nằm trong vùng heterocromatin (dị nhiễm sắc) của nhiễm sắc thể thường nằm trong trạng thái cuộn chặt, phình ra với mật độ đậm đặc do bị liên kết hoặc bị phong tỏa bởi nhóm protein thuộc nhóm histon, hoặc các nucleohiston Trong trạng thái đó gen thường im lặng, không biểu hiện (không có khả năng phiên mã) hoặc biểu hiện yếu Gen chỉ biểu hiện khi thoát khỏi trạng thái này Nghiên cứu ở thực vật cho thấy đây là hiện tượng bất hoạt gen ở giai đoạn phiên mã Sau khi phát hiện ra RNAi, người ta thấy rằng bất hoạt gen ở giai đoạn phiên mã cũng xảy ra theo cơ chế

tương tự như RNAi Sau đó được biết ở nấm Schizosaccharomyoces pomb, ở ruồi

giấm và động vật có xương sống đều có các cơ chế tương tự RNAi với sựu tham gia của các RNA sợi kép ngắn để giữ cho vùng dị nhiễm sắc thể đông đặc và ngăn chặn quá trình dịch mã Hiện nay cơ chế phân tử của quá trình ức chế gen ở mức dịch mã chưa hoàn toàn được làm rõ Nhưng vai trò của những biến đổi ở histon, vai trò của protein đặc thù bám dính nhiễm sắc thể HP1 và sự methyl hóa DNA đều đóng những vai trò quan trọng trong điều khiển gen [1]

5 Một số ứng dụng của công nghệ RNAi

Trên cơ sở những tìm hiểu về lý thuyết của RNAi cũng như công nghệ RNAi các nhà khoa học đã nghiên cứu để có những ứng dụng công nghệ RNAi trong rất nhiều lĩnh vực mà đặc biệt là trong y học và nông nghiêp

5.1 Ứng dụng trong lĩnh vực y học

RNAi có thể gây bất hoạt một gen đặc thù (gen đích) bằng nhiều cách khác nhau:(1) Bằng tiêm dsRNA vào động vật

(2) Qua đường ruột bằng cách cho tuyến trùng ăn chủng E coli đã được chuyển

gen có khả năng sản sinh dsRNA

(3) Bằng gây sốc giun tròn trong dung dịch có chứa dsRNA

(4) Bằng chuyển gen RNAi có khả năng sản sinh dsRNA vào tế bào động vật, từ

đó dsRNA sẽ được sản sinh trong cơ thể để gây bất hoạt gen đích

Từ những kết quả trên các nhà khoa học cho rằng có thể sử dụng RNAi như là một phương pháp trị liệu (như dược chất đưa từ bên ngoài vào cơ thể hoặc là liệu pháp

di truyền – bằng phương pháp chuyển gen vào cơ thể)

Ngay sau các công bố trên, đã xảy ra sự bùng nổ nghiên cứu ứng dụng của công nghệ RNAi trong y học Nhờ vậy, đã xác định RNAi là quá trình đặc biệt và đã được kiểm chứng để làm ngừng biểu hiện của bất kì gen nào ở bất cứ tế bào nào trong tất cả các cơ thể đa bào Công nghệ này có nhiều triển vọng ứng dụng quan trọng, đặc biệt là chống lại nhiều bệnh nan y một cách hiệu quả như bệnh ung thư và các bệnh

lây nhiễm do virus như suy giảm nhiễm dịch do HIV…[1] Sau đây là một số ứng dụng cụ thể của công nghệ RNAi trong y học.

5.1.1 Ứng dụng của công nghệ RNAi trong sàng lọc thông lượng cao trong sinh học ung thư và virus

5.1.1.1 Ứng dụng của công nghệ RNAi trong sàng lọc thông lượng cao sinh học ung thư

Phương pháp can thiệp RNA HTS (sàng lọc thông lượng cao) vẫn đang ở giai đoạn sớm so với nhiều phương pháp di truyền cổ điển, nhưng nó đã được sử dụng với

số lượng lớn các nghiên cứu cho thấy các tác động đáng kể của phương pháp này trong một loạt các lĩnh vực, đặc biệt là trong sinh học ung thư

Tế bào ung thư chứa tập hợp của các gen bị đột biến gây ung thư và một số lượng lớn các thông tin về các gen đột biến đã được tích lũy từ các loại trình tự exome

và trình tự thế hệ tiếp theo Tuy nhiên, điều đó không có nghĩa là tất cả các gen đột biến ung thư đều phát triển và không phải chỉ một gen đột biến giới hạn gây ung thư Điều đó là rất quan trọng để biết được đột biến gen là một động lực chính cho sự sống còn và phát triển của các tế bào ung thư Hơn nữa, sự phát triển mạnh và các chất ức chế cụ thể nhắm vào những gen đột biến chính đại diện cho một lĩnh vực nóng trong điều trị ung thư mục tiêu, trong đó có thể trở thành một phần quan trọng của nhiều phương pháp điều trị ung thư do độ chính xác của nó trong việc tiêu diệt các tế bào ung thư và đặc biệt là tương đối ít tác dụng phụ so với phương pháp hóa trị liệu truyền thống Tuy nhiên, độ chính xác thường cũng chỉ có ở một số tế bào nào đó, đó là một nhược điểm nội tại của điều trị ung thư mục tiêu Như vậy, các chất ức chế thường biểu hiện hoạt động kém hiệu quả và hạn chế trong tiêu diệt các tế bào ung thư và cũng cho phép các tế bào ung thư phát triển kháng thuốc, đây là một trong những lý

do chính của sự thất bại của phương pháp này trong việc điều trị Thách thức lớn và chủ yếu để điều trị ung thư là xác định các mục tiêu, đó là điều cần thiết cho sự tồn tại

và phát triển của các tế bào ung thư, cũng như chỉ ra dấu hiệu sinh học có thể dự đoán những loại ung thư nhạy cảm hoặc kháng với các chất ức chế cụ thể Vì vậy, RNAi HTS sẽ rất hữu ích trong việc lựa chọn mục tiêu và ung thư có chọn lọc để điều trị cho bệnh nhân Hơn nữa, xét nghiệm kiểu hình để phát hiện số lượng tế bào và khả năng tồn tại cũng được thực hiện Vì vậy, nó không phải là đáng ngạc nhiên khi RNAi HTS

đã được áp dụng để phát hiện ra các đột biến chức năng của gen hoặc xác định mục tiêu điều trị trong ung thư kiểu hình trong các nghiên cứu sớm nhất Sàng lọc shRNA gây chết toàn bộ gen đã được chú trọng thành lập để xác định sự phụ thuộc chức năng trong hai tế bào vú dòng thuần mà đã được biến đổi gen gây ung thư bằng cách sử

dụng cùng với kiểu hình khác nhau Gen Proteasome đã được làm phong phú hơn trong số 154 gen xác định cho thấy sự phụ thuộc cao hơn vào các tế bào chuyển hóa

cơ bản giống như trong myoepi-thelial và giống như các tế bào biến đổi Một thư viện siRNA mở rộng bộ gen trong một định dạng gộp được áp dụng để xác định gen điều tiết nhạy cảm với RAS tế bào ung thư đột biến trong đại trực tràng DLD, một tế bào

có và không có một dạng đột biến của các gen gây ung thư KRAS Một tập hợp các điều hòa phân bào, bao gồm phân hủy suy thoái của proteasome yếu tố phân bào và PLK1, tăng sự phụ thuộc vào các tế bào KRAS- đột biến vào trạm kiểm soát phân bào

và sự phát triển Những dòng tế bào KRAS- đột biến cũng nhạy cảm với phương pháp

điều trị bằng chất ức chế PLK1 trong cả in vivo và xenograft mô hình Các chất ức chế

PLK1 và siRNAs hiện đang là thử nghiệm lâm sàng và nó sẽ rất thú vị để xác định nếu RAS các khối u biểu hiện tăng độ nhạy cảm trong việc chuẩn đoán lâm sàng MED12 được xác định là một yếu tố quyết định kháng thuốc sử dụng 24.000 shRNAs nhắm mục tiêu 8000 gen của con người trong một dòng ung thư phổi chứa sự chuyển giữa EML4 và ALK kinase, đó là nhạy cảm với ALK các chất ức chế PF-02341066 (crizotinib) và NVP-TAE684 Hơn thế nữa thermore MED12 tắt gây kháng thuốc khác nhau ức chế thụ thể tyrosine bằng cách điều tiết tiêu cực TGF-βR2 thông qua sự tương tác với TGF-βR2

Mặc dù một số nhóm đã đạt được tiến bộ đáng kể trong việc xác định các tác nhân quan trọng gây ung thư và ung thư mục tiêu trị liệu bằng cách sử dụng kỹ thuật RNAi HTS, gần như tất cả trong số các phương pháp được thực hiện trong ống nghiệm Như trong các màn ống nghiệm dẫn ra một số kết quả quan trọng và mới lạ trong các nghiên cứu của các tế bào ung thư nhưng ít có khả năng gom lại các tương tác phức tạp gồm giữa khối u và vi môi trường của họ, đó là một bước quan trọng hướng tới sự tăng trưởng tế bào ung thư trong sự hiểu biết bối cảnh sinh lý hơn, vì nó không phải là có thể thiết kế nhiều hơn các phương pháp điều trị hợp lý cho bệnh ung

thư dựa trên phương pháp sàng lọc in vitro Beronja và đồng nghiệp thực hiện một thí

nghiệm về bộ gen trong cơ thể lentivirus shRNA màn trong mô biểu bì bình thường của phôi thai và một siêu sinh sản của HrasG12V gây ra khối u ở chuột Một số lượng gen mong đợi và bất ngờ điều chỉnh tăng trưởng biểu bì phôi thai được xác định bởi các phân tích của shRNA tương đối phong phú Sau khi loại bỏ các gen là rất cần thiết trong cả điều kiện và được coi là gen bảo vệ / khả năng tồn tại, vẫn còn khoảng 250 các gen khác được xác định là gen gây ung thư cụ thể như oncogene- điều hòa sinh trưởng Chúng đại diện cho gen có thể được nhắm đến mục tiêu trong ung thư mà không gây ra bất kỳ ảnh hưởng xấu đến các mô bình thường Trong số hits màn hàng

đầu HrasG12V phụ thuộc là effector Wnt β-catenin và myeloid / lymphoid hoặc hỗn hợp dòng bạch cầu chuyển lên 6 (Mllt6) Sự im lặng của một trong hai gen trong HrasG12V- biểu hiện tế bào biểu bì làm giảm sự forma- tion của HrasG12V vảy phụ thuộc ở chuột và ức chế cả sự bắt đầu và duy trì sự sống của con người, vảy xenografts ung thư tế bào Những kết quả này chứng minh tính khả thi của phương

pháp in-vivo sàng lọc này và xác định được sự điều chỉnh tăng trưởng chính gây ung

thư có thể nêu lên mục tiêu và tiềm năng điều trị các ung thư sinh học [2]

Hình 4: Phương pháp sàng lọc thông lượng cao [9]

A Cũng dựa trên công nghệ RNAi sàng lọc (a Thư viên của virus tích trữ glycerol của siRNA; b Các thư viện của các thuốc thử gen mục tiêu được chuyển đổi thành DNA thâm chuyển chất lượng cao (plasmid -dựa trên RNA kẹp tóc ngắn (shRNAs)) hoặc siRNAs Một phương pháp được sử dụng phổ biến là để nhiều bể chứa siRNAs

mà mục tiêu cùng một gen và mảng các nguồn gen cụ thể vào tấm đa tốt; c Sự chuẩn

bị của shRNA – biểu hiện của virus; d,e Virus hoặc acid nucleic dàn lại vào tấm 384

để sàng lọc thông lượng cao; f Sự truyền nhiễm, thâm chuyển hoặc thâm chuyển

ngược của thuốc thử gen nhắm mục tiêu thích hợp vào các tế bào mục tiêu kết quả trong việc knockdown gen cụ thể; g Xét nghiệm kiểu hình dựa trên dĩa có thể được thực hiện tốt mà các tế bào mục tiêu cho thấy một phản ứng mạnh mẽ với các nhiễu loạn có thể được xác định đơn giản chỉ bởi vị trí đĩa của chúng (xem các tế bào màu đỏ)) B RNAi dựa vào tế bào microarrays (a Thư viện có thể có một số định dạng bao gồm siRNAs tổng hợp, shRNAs, siRNAs plasmid dựa trên các enzyme có nguồn gốc (esiRNAs) hoặc virus dựa trên shRNA; b Thành phần thư viện có thể được in lên lam kính hiển vi ở mật độ cao; c Microarray RNAi có thể được lưu trữ trong thời gian dài hoặc các tế bào có thể được nuôi cấy trên đầu của các mảng và sau đó được xử

lý trong một xét nghiệm dựa trên hình ảnh; d Các tế bào trên đầu của các "đốm" đại diện cho knockdowns gen cụ thể được kiểm tra tự động bằng phần mềm phân tích [9].

5.1.1.2 Ứng dụng của công nghệ RNAi trong sàng lọc thông lượng cao virus

Mặc dù đã có sự nỗ lực rất lớn trong việc phát triển thuốc kháng virus và lĩnh vực nghiên cứu tiêm chủng, nhưng virus vẫn là mối đe dọa lớn đối với sức khỏe cộng đồng Thật vậy, mặc dù đã có một số biện pháp phòng tránh nhưng virus cúm lây nhiễm lên đến một tỷ người trên toàn cầu, chiếm năm triệu trường hợp bệnh nghiêm trọng và 250.000 đến 500.000 ca tử vong mỗi năm Ngược lại, nếu mà không có một vắc - xin sau 25 năm nghiên cứu, HIV đã lây nhiễm hơn cho 70 triệu người cho đến nay và gây tử vong hơn 35 triệu người (WHO) Tương tự như vậy, virus viêm gan C (HCV) nhiễm 130.000.000-170.000.000 người mỗi năm, gây nhiễm trùng cấp tính và nhiễm trùng mãn tính Virus Sốt xuất huyết gây bệnh gần 100 triệu người mỗi năm, dẫn đến nửa triệu trường hợp sốt xuất huyết Ngoài ra, virus cũng là những nguyên nhân chính gây ra một số loại khối u ở người Loại virus có nguy cơ gây bệnh cao của con người papillomaviruses (HPV) là nguyên nhân của gần như tất cả bệnh ung thư cổ

tử cung, đó là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây ra tử vong ở phụ nữ Tương tự như vậy, virus Epstein-Barr (EBV), lây nhiễm cho 90% người lớn trên toàn thế giới, là nguyên nhân gây ra các khối u nhất định, bao gồm cả lym- Burkitt của Phoma, bệnh Hodgkin và ung thư biểu mô vòm họng

Cách hiệu quả nhất để ngăn ngừa các bệnh liên quan đến virus là vắc-xin Tuy nhiên, trong hầu hết các trường hợp, vắc- xin không có sẵn hoặc không phải luôn luôn

có hiệu quả Mỗi năm, hiệu quả bảo vệ của vắc-xin cúm bất hoạt hóa trị ba (TIVs) là chỉ khoảng 59% trong dân số trưởng thành ở độ tuổi 18-65 ở Mỹ Thuốc kháng virus

do đó rất quan trọng trong việc kiểm soát độc lực của virus Các loại thuốc đang được

sử dụng chủ yếu nhắm vào mục tiêu protein hoặc bộ gen của virus Tuy nhiên, điều đó

là rất dễ dàng cho virus, đặc biệt là virus RNA, để chúng phát triển sức đề kháng chống lại các loại thuốc như vậy do tỷ lệ đột biến cao của các bộ gen của virus Từ đó, việc tìm kiếm một cách hiệu quả hơn để phát triển các loại thuốc mới đã trở thành một

đề tài nghiên cứu rất được quan tâm Điều đó đã được chứng minh khi siRNAs gộp nhắm mục tiêu các Zaire Ebolavirus (ZEBOV) protein chủ chốt bao gồm RNA polymerase L protein, protein của virus (VP) 24 và VP35 bảo vệ rất hiệu quả để chống lại Ebola trong loài linh trưởng, đây là một gợi ý để chúng ta tiến hành điều trị hữu ích cho các virus mới xuất hiện khác gây nhiễm trùng ở người

Virus dựa vào tế bào vật chủ để xâm nhập, lây nhiễm và nhân lên Vì vậy, hiểu đúng vai trò của các yếu tố vật chủ trong sự lây nhiễm của virus có thể tạo thuận lợi cho sự phát hiện của các phương pháp điều trị Vì thuốc điều trị bệnh làm yếu tố vật chủ trải qua áp lực ít hơn nhiều hơn so với virus gây đột biến protein và có thể có một chức năng khác nhau trong nhiễm virus Với sự phát triển của phương pháp RNAi HTS giúp ta có thể kiểm tra các sự tương tác trên bộ gen giữa virus và các yếu tố vật chủ

Virus Drosophila C (DCV), một picornavirus, là virus đầu tiên trải qua sàng lọc RNAi toàn bộ gen để xác định yếu tố vật chủ mới cần thiết cho nơi đi vào bên trong ribosome (IRES) – virus phụ thuộc phiên mã Các virus đầu tiên trên các sinh vật có

vú đã được sàng lọc gen bởi hệ thống RNAi rộng là HCV vào năm 2007 Trong một

nỗ lực để khám phá mục tiêu druggable mới chống lại HCV, một thư viện của siRNAs nhắm mục tiêu 4.000 gen của con người được sử dụng để xác định gen điều chỉnh nhân rộng HCV trong Huh7 có nguồn gốc từ tế bào EN5-3 thu hoăc một HCV replicon subgenomic Chín gen di động, bao gồm các thành viên của các yếu tố hoại

tử khối u / tế bào bạch huyết báo hiệu đường đã được xác định Bịt miệng những gen dẫn đến ức chế sự sao chép HCV, và mức độ của sự im lặng siRNA của các gen chủ tương quan tốt với sự ức chế của HCV

Năm 2008, ba nhóm đồng thời báo cáo bộ gen - RNAi HTS rộng cho các yếu

tố cần thiết để vật chủ nhân bản HIV Brass et al phát triển một màn hai phần siRNA

để phát hiện các yếu tố chủ tham giatrong việc nhiễm HIV Với 21.121 bể của siRNA,

họ đã xác định 273 HIV- các yếu tố phụ thuộc vào tế bào TZM-bl Khác với 36 yếu tố vật chủ, bao gồm cả CD4, CXCR4 và các thành phần của NF-κB mà trước đó đã liên

quan đến bệnh HIV, họ tiết lộ sự tham gia của các protein vận chuyển Golgi Rab6 và Vps53 đi vào trong HIV, TNPO3 trong sự hòa hợp và Med28 trong phiên mã Một nhóm khác bằng cách sử dụng một thư viện siRNA gồm 22.329 bể của siRNA nhắm mục tiêu 19.709 gen trong tế bào HeLa P4/ R5 phát hiện 311 yếu tố vật chủ, với một

có 18 gen trùng với Brass và cộng sự

Họ khẳng định sự tham gia của SP1/hòa giải phức tạp và các đường truyền tín hiệu NF-κB trong sự sao chép HIV Trong khi đó, một nghiên cứu tập trung vào các bước đầu của sự nhiễm HIV-1 tiết lộ có hơn 200 gen trong tế bào 293T của con người

mà có thể tạo điều kiện nhiễm HIV Trong số đó, hơn 40 gen cụ thể điều chỉnh việc bắt đầu nhân lên của virus Mặc dầu mỗi màn có tỷ lệ chồng chéo khoảng 6%, tuy nhiên chỉ có ba yếu tố vật chủ được xác định trong tất cả ba phương pháp MED6, MED7 (hòa giải phức tạp), và RELA (NF-κB com-plex)

Do sự bùng phát liên tục của cúm theo mùa và năm 2009 có đại dịch cúm, virus cúm đã được chọn để nghiên cứu sử dụng phương pháp RNA can thiệt (RNAi) bộ gen Một nỗ lực ban đầu được thực hiện trong năm 2008, bao gồm 90% gen của ruồi giấm Drosophila Dựa trên một gen phóng luciferase Renilla, hơn 100 yếu tố vật chủ

đã được xác định rằng thay đổi nhân rộng cúm, bao gồm cả các cytochrome c oxidase tiểu đơn vị COX6A1, các ATPase ATP6VoD1 và yếu tố xuất khẩu hạch nhân NXF1/TAP Các protein xuyên màng IFITM1, 2 và 3 được phát triển sau này hạn chế các giai đoạn đầu của bệnh cúm A sao chép của virus thông qua một màn siRNA trong các tế bào u xương ác tính (U2OS) Kiểm tra sau đó nhắm mục tiêu 19.000 gen của con người được thực hiện trong các tế bào biểu mô phổi A549 trong năm 2010 Trong

số 295 yếu tố vật chủ xác định, 23 yếu tố là cần thiết cho sự xâm nhập của virus cúm,

và 10 yếu tố cần thiết cho các bước sau khi xâm nhập Konig et al xác định một số các yếu tố sử dụng chất ức chế phân tử nhỏ, bao gồm cả các v ATPase và CAMK2B

có thực sự cần thiết với việc nhân rộng cúm hay không Ngoài ra, một nghiên cứu HTS RNAi sử dụng dịch virus cúm lợn xác định có 168 yếu tố ức chế sự nhiễm virus, bao gồm cả protein SON DNA (SON) kiểm soát việc trao đổi của virion để endosomes cuối, cũng như CDC-như kinase 1 (CLK1) Trong xét nghiệm sâu hơn nữa

đã phát hiện ra vai trò của cyclin phụ thuộc vào chất ức chế kinase 1B (Cdkn1b) trong nhiễm cúm bằng cách sử dụng p27 ở chuột Thiết kế cẩn thận màn RNAi cũng cho thấy chi tiết và thông tin cụ thể đối với việc nhiễm poxvirus Một thư viện sử dụng

màn 7.000 gen trong các tế bào HeLa druggable rõ ràng cho thấy rằng Cullin 3 dựa trên ubiquitination là cần thiết để virus vaccinia (VACV) khởi đầu nhân đôi DNA Trong một nghiên cứu khác cho thấy hơn 500 gen ức chế đáng kể và một số lượng tương tự để tăng cường sự nhân đôi và lây lan của VACV đã được xác định từ RNAi HTSs với hai thư viện gen độc lập của con người Chức năng nghiên cứu chứng minh rằng khi chặn nucleoporin 62 mạnh ức chế VACV hình thái và chỉ có một tác động rất

ít về biểu hiện gen của virus, do đó cung cấp cái nhìn sâu sắc vào các nghiên cứu trước đó với các tế bào enucleated [2]

Hình 5: Sàng lọc thông lượng cao của siRNAs từ các thư viện RNAi từ sự xâm nhập

của vi khuẩn [4]

Một thư viện shRNA được enzyme xây dựng từ gen mục tiêu Dnase I-tiêu hóa và chuyển hóa thành E coli BT203-RLuc trong đó gen asd đã được thay thế bằng các biểu hiện băng RLuc Các cấu trúc gen pCMV-Luc-mục tiêu cho biểu hiện của bảng sao lại trong các tế bào động vật có vú hybrid cũng được xây dựng vào plasmid vừa

để biểu lộ thư viện shRNA Cá nhân BT203-RLuc-shRNA sao chép từ thư viện shRNAi được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng và cảm ứng với IPTG cho biểu hiện shRNA và sau

đó ủ với tế bào HeLa trong tấm 96 giếng vận chuyển của cả hai shRNAs và

pCMV-Vi khuẩn xâm nhập

TB động vật có vú

Làm thí nghiệm Luciferase

Bản sao bị phá hủy Gen mục tiêu